GENETICA MOLECULAR

Dra. Dania Guerra

Uno de los objetivos fundamentales
de la gentica medica y humana es
comprender a nivel molecular la base
de las mutaciones que generan
enfermedades genticas y utilizar
dicha informacin para mejorar los
mtodos diagnsticos y de
tratamiento de estos trastornos
COMO OBTENER GRANDES CANTIDADES DE ADN EN
FORMA PURA PARA ANLISIS MOLECULAR?
Mediante el proceso de clonacin molecular que
consiste en aislar la secuencia de ADN que nos
interesa y obtener mltiples copias de sta
introducindolo en un organismo, que es
usualmente una bacteria (en vivo) o por
procedimientos como la PCR (en vitro)
CLONACIN MOLECULAR

Para poder clonar un fragmento de ADN es necesario:

-Aislar el fragmento que queremos clonar

-El vector, que es el organismo donde vamos a
recombinar el ADN forneo, y este se va a multiplicar
dentro de otro organismo

-El hospedero que generalmente es una bacteria,
capaz de garantizar la multiplicacin del vector en su
interior

-Enzimas necesarias para el proceso: las
endonucleasas de restriccin y la ligasas


ENZIMAS DE RESTRICCIN
Las endonucleasas de restriccin bacterianas son
enzimas que reconocen secuencias de doble
cadena especificas, generalmente cortas en el ADN
y lo cortan en el sitio especifico de reconocimiento
o cerca de este y dejan un segmento pegajoso
monocatenario capaz de unirse a su segmento
complementario facilmente
Ejemplo la enzima de restriccin EcoR1 reconoce la
secuencia especifica de 6 pares de bases
Enzima de restriccin EcoR1
ELECTROFORESIS
Una vez fragmentados los segmentos de ADN pueden
visualizarse ya que estos migran en un gradiente elctrico
que tiene como soporte un gel, con una velocidad
inversamente proporcional a su tamao, por lo que los
mas pequeos corren con mas rapidez. Al finalizar la
corrida el gel se lava y se tie con un colorante que se
introduce entre las dos hlices del ADN (bromuro de
etidio) y que tiene la capacidad de absorber la luz
ultravioleta emitiendo una luz anaranjada, que permite
identificar los diferentes fragmentos de ADN
Un VECTOR es una molcula de ADN que se replica de una
manera autnoma en un hospedero, tales como bacterias o
levaduras, de la cual puede ser aislada en forma pura para su
anlisis
Vectores mas frecuentes:
Plsmidos
Molculas de ADN circular de tamao
pequeo o moderado que se
encuentran presentes normalmente en
algunos microorganismos , a los
cuales favorecen en alguna funcin

Bacterifagos
Son de mayor tamao por lo
que trasportan mayor
cantidad de ADN forneo e
ingresan a la clula
bacteriana de manera mas
eficiente
INCLUSIN DEL ADN EXTRAO EN EL VECTOR
EL FRAGMENTO DE ADN EN CUYO EXTREMO ESTAN
LAS 4 BASES SE HIBRIDIZA CON EL EXTREMO DE 4
BASES DEL ADN DEL PLASMIDO POR ACCION DE LA
DNA LIGASA
El hospedero es generalmente la bacteria E. Coli
GENOTECA GENOMICA
Si el ADN de un organismo es sometido a la accin de
una enzima de restriccin, se forman numerosos
fragmentos, estos fragmentos pueden ser ligados a un
vector que se trato con la misma enzima, de forma que
se produce una coleccin de molculas del vector que
llevan todos los tipos de fragmentos, esta coleccin se
denomina GENOTECA GENOMICA
Materialmente es un conjunto de placas de Petri (20 o mas) con
cultivos en los que cada colonia tiene un fragmento de ADN
Como solo el 10% del genoma es ADN de copia unica (exones
de los genes) es mas util construir una genoteca a partir de
ARNm o genotecas de ADN complementario
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
Esta tcnica fue descrita por Kary Mullis en 1980 y consiste
en la amplificacin exponencial de un fragmento especifico
de ADN

Se requiere:
-Dos oligonucleotidos pequeos (primers o cebadores) que
son complementarios a cada uno de los extremos del ADN
matriz o templado que se quiere amplificar
-La enzima polimerasa termoresistente, la Tac polimerasa
-los 4 dexoinucleotidos que se incorporan al nuevo ADN
-Un buffer a PH 8.5 + Cloruro de Magnesio

Esta mezcla se coloca en un termociclador, equipo
que calienta y enfra rpidamente los tubos en los
ciclos programados
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
APLICACIONES DE LA PCR
METODOS DE ANALISIS DEL DNA
Los mtodos para identificar una determinada secuencia
de ADN o ARN se basan en su propiedad de HIBRIDAR,
es decir la propiedad de la cadenas simples de
nucletidos de unirse con a una cadena estrictamente
complementaria de bases

Es necesario disponer de una secuencia conocida
(cadena simple) que esta rotulada con un marcador ,
radiactivo o no, esta recibe el nombre de SONDA y
puede proceder de mltiples fuentes:
Secuencias de ADN genmico aleatorias
Secuencias de ADNc complementario
Genes especficos
Secuencias de oligonucleotidos obtenidas mediante
sntesis basada en la secuencia de la proteina

Mtodos: Southern Blot, Northern Blot y Western

TECNICA DE SOUTHERN BLOT
1. Se somete el ADN a digestin con una enzima de
restriccin

2. Se realiza una electroforesis en gel de agarosa separando
los fragmentos de restriccin por tamaos

3. Se desnaturalizan los fragmentos del gel mediante
tratamiento con lcalis, convirtindolos en fragmentos de
hebra simple

4. Se coloca una membrana de nitrocelulosa o nylon sobre el
gel y se comprime, de manera que una alicuota de los
fragmentos se pegan a la membrana ( como una impronta,
huella= blot en ingles

5. Esta membrana se trasfiere a una solucin con la sonda y
si existe una secuencia complementaria la hibridacin se
visualiza colocando la membrana lavada y seca se
adhiere a una placa fotogrfica que es revelada
IMPRONTA O HUELLA DE SOUTHERN ( SOUTHERN BLOT)
SECUENCIACION
El conocimiento de la secuencia del ADN aporta informacin sobre
la naturaleza de las mutaciones especificas, la funcin del gen y la
similitud con otros genes conocidos.

El mtodo de secuenciacin enzimtico inventado por Frederick
Sanger se basa en el uso de dideoxinucleotidos de terminacin de
cadena, estos son similares a los deoxinucleotidos normales solo
que han perdido un grupo hidroxilo y esto impide la formacin de
nuevos enlaces fosfodiester con las bases del DNA libre








Los dideoxinucleotidos se incorporan a la hlice en formacion ,
pero una vez incluidos no pueden incorporarse nucletidos
adicionales y se detiene la sintesis
SECUENCIACION
El cebador hbrida en la posicin complementaria adecuada y la DNA
polimerasa aade las bases libres a la molcula de DNA en formacin,
pero una vez que se incorpora un dideoxinucletido, la cadena termina.
As se producen fragmentos de longitud variable que terminan en el
mismo dideoxinucletido
Para realizar la secuenciacin se requiere los cuatro dideoxi
correspondientes a los nucletido normales A, T, C, G, el ADN de cadena
simple cuya secuencia queremos determinar, la enzima DNA polimerasa,
los cebadores marcados radiactivamente, los nucletidos normales
SECUENCIACION
Se corren cuatro reacciones de secuenciacin diferentes, una
para cada base. Se realiza una electroforesis con los fragmentos
obtenidos de cada reaccin , que se colocan de forma adyacente
en el mismo gel para que se pueda comparar la posicin de cada
fragmento, dado que cada banda corresponde a una cadena de
ADN con una nica base en su extremo, la secuencia del ADN
puede ser leda observando el orden de las bandas en el gel tras
de realizar una autoradiografa

SECUENCIACION AUTOMATIZADA
-Cada uno de los cuatro nucletidos se marca con un
fluorocromo que emite luz en un espectro distinto

-Los productos de la reaccin se someten a electroforesis
y a medida que se desplazan por una ventana, son
excitados por un haz de luz lser

-La luz que emiten es captada por una cmara digital, que
la traduce a una seal electrnica, generndose una
imagen compuesta del gel

-Obtenindose un grafico , en el que cada uno de los cuatro
nucletidos esta representado por un pico de distinto color
SECUENCIACION
TECNOLOGIA PARA EL DIAGNOSTICO MULTIGENICO O GENOMICO
MICROARREGLOS DE ADN