01-08-2014 21:18:21

Departamento de Anlisis Instrumental

Facultad de Farmacia 1
Absorciometra en el UV cercano
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 2
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 3
1
0
10
0
1
0
1
log log
% 100 %
I
I
T A
I
I
T
I
I
T

01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 4
Ley de LambertBeer
A = abc
a: absortividad o coeficiente de absorcin (L g
1
cm
1
)
b: paso ptico (cm)
c: concentracin (gL
1
)


A = bc
: absortividad molar o coeficiente de extincin molar (L mol
1
cm
1
)
b: paso ptico (cm)
c: concentracin molar (M mol L
1
)


01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 5
Zona Visible del EEM
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
400 450 500 550 600 650 700 750 800
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
400 500 600 700 800 900
CuCl
2
ROJO CONGO
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 6
Zona visible del EEM
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
400 450 500 550 600 650 700 750 800
CrCl
3

01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 7
Curva de Calibrado
Concentracin
A
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 8
Qu hacer cuando la disolucin de una
sustancia no es coloreada?
1) Buscar un reactivo cromognico para
desarrollar un color.
2) Verificar la zona UV en el espectro de
absorcin de la sustancia para ver si
presenta mximos de absorcin.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
400 450 500 550 600 650 700 750 800
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 9
Espectro UV cercano de cafena
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
220 240 260 280 300 320
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 10
Zona UV del Espectro electromagntico
Nombre Longitud de onda (nm)
UV cercano 380 200
UVA (luz negra) 380 320
UVB 320 280
UVC 280 200
UV lejano o de vaco 200 10
Extremo o profundo (deep UV) 30 - 1
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 11
A qu se debe la presencia de bandas de
absorcin en la zona del UV cercano?
Presencia de transiciones electrnicas
UV
ORBITAL DE ALTA ENERGA
ORBITAL DE BAJA ENERGA
ORBITAL DE ALTA ENERGA
ORBITAL DE BAJA ENERGA
Fundamental Excitado
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 12
Qu tipos de orbitales ocupan los
electrones en una molcula orgnica?
C O
H
H




n
ENLAZANTES:
: Forman enlaces simples
: Forman enlaces dobles y triples

NO ENLAZANTES:
n: Ocupados por electrones que no forman
enlaces

ANTIENLAZANTES:
* y *: Orbitales moleculares resultantes
de la unin de dos orbitales atmicos

01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 13
Dnde se ubican los electrones de una
molcula en estado fundamental?
E
N
E
R
G

A

*
* ANTIENLAZANTE
n
NO ENLAZANTE
ANTIENLAZANTE
ENLAZANTE
ENLAZANTE
n

*


n

*

01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 14
De qu depende la energa de cada una de
estas transiciones electrnicas?
Naturaleza de la molcula orgnica
Ambiente que la rodea (solvente)

* , n * : UV Lejano.
(sin importancia para el presente estudio)

*, n * : UV Cercano (sobre 200 nm)
(ambas requieren que la molcula posea un enlace mltiple)

01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 15
Ejemplos de transiciones electrnicas
Transicin
Regin del
espectro
Ejemplo
* UV de lejano CH
4
a 125 nm
n * UV lejano o UVC H
2
O a 167 nm
* UVC 1octeno a 177 nm
n * UVC visible propanona a 280 nm
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 16
Transiciones electrnicas *, n *.

Cromforos
Grupos funcionales responsables de la
absorcin en la zona del UV vis
Contienen electrones de valencia fciles de
excitar (baja energa)
Responsables de las bandas de absorcin de
las molculas orgnicas entre los 160 nm y
700 nm aproximadamente
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 17
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 18
Ejemplos de espectros de compuestos
orgnicos
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 19
Caractersticas de las transiciones
* y n *

Absortividad Molar n * ~ 10 100 L cm
1
mol
1
Para * ~ 1.000 10.000 L cm
1
mol
1
Al aumentar la polaridad del solvente los picos
n * se desplazan hacia longitudes de onda
menores (desplazamiento hipsocrmico)
Normalmente, frente a un aumento de polaridad en
el solvente, los picos * se desplazan hacia
longitudes de onda mayores (desplazamiento
batocrmico)

01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 20
Efectos hipsocrmico y batocrmico
(blue shift y red shift)
150 200 250 300
Longitud de onda (nm)
A
150 200 250 300
Longitud de onda (nm)
A
En solvente NO POLAR
(hexano, ter, etc)
En solvente POLAR
(agua, alcoholes, etc)
n *
n * *
*
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 21
Conjugacin de cromforos
Dos insaturaciones estn conjugadas cuando
hay entre ellas un enlace simple
C = C C = C
Como consecuencia de la deslocalizacin de
electrones en cuatro centros atmicos, la
energa de los OM antienlazantes disminuye,
por lo que los mximos de absorcin se
desplazan a longitudes de onda mayores
(efecto batocrmico)
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 22
Multicromforos
42.000
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 23
Absorcin por sistemas aromticos
Auxcromos
Sistemas aromticos presentan tres bandas
caractersticas, dos de ellas en la regin de
utilidad analtica (Bandas E
2
y B). Su ubicacin
e intensidad depende de los sustituyentes
presentes en el anillo (Auxcromos)
X
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 24
Auxcromo es un grupo funcional que no
absorbe en la regin ultravioleta pero tiene el
efecto de desplazar los picos de un cromforo
hacia longitudes de onda ms largas y
normalmente incrementar sus intensidades
(efecto hipercrmico).

01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 25
Solventes
Transparencia
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 26
Interacciones Estructura fina del espectro
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 27
Efecto batocrmico (red shift)
*
*


Solvente
apolar
Solvente
polar
E
N
E
R
G

A

01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 28
Efecto hipsocrmico (blue shift)
*
*
n
n
Solvente
apolar
Solvente
polar
E
N
E
R
G

A

01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 29
Resumen de trminos
Efecto batocrmico
Efecto hipsocrmico
Efecto hipercrmico
Efecto hipocrmico
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 30
Efecto del pH
En los compuestos ionizables, el
desplazamiento del equilibrio debido al pH
puede afectar sus propiedades de absorcin.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
460 480 500 520 540 560 580 600
ALCALINA
CIDA
Fenolftalena
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 31
Aplicaciones cualitativas
Es limitada, la identificacin inequvoca de
compuestos en base a su espectro en la zona
del UV cercano es a menudo imposible. til
para confirmar la identidad de un compuesto.

Dos criterios:
1) Longitud de onda del mximo de absorcin
2) Clculo de a
prctico
y comparacin con a
terico
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 32
Aplicaciones cuantitativas
1) Gran aplicabilidad en sistemas orgnicos e
inorgnicos
2) Sensibilidades de 10
4
M a 10
5
M
3) Selectividad de moderada a alta
4) Buena precisin (incertidumbre 1 3 %)
5) Fcil adquisicin de datos
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 33
Procedimiento
a) Establecimiento de las condiciones de trabajo
Seleccin de la longitud de onda de trabajo
Naturaleza del disolvente
pH de la disolucin
Temperatura
Estudio de la presencia de interferentes
Material utilizado

b) Determinacin de la relacin entre Absorbancia y
concentracin

01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 34
Caractersticas pticas de los materiales
Cuando se trabaja en la zona del UV se deben emplear celdas de slice fundida
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 35
Mtodo de cuantificacin
Recta de calibrado:
A = f(c)

Recta de adicin patrn:
A = f(c) + b


Se usa para eliminar las interferencias provenientes de
la matriz
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 36
Mtodo de la adicin patrn (estndar)
Todos los puntos de la recta de adicin se
preparan con un volumen constante de
muestra.
Adems de la muestra cada punto de la curva
de adicin lleva volmenes crecientes de
patrn partiendo de volumen cero, es decir,
slo la muestra (cero de adicin)
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 37
Clculo de la concentracin de una muestra problema
mediante una recta de adicin patrn (estndar)
A = m*C + b
Concentracin
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
C
M
= |b/m|
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 38
Ejemplo de cuantificacin por medio de
rectas de calibrado y adicin
Para la cuantificacin de cafena en una muestra de RedBull
por medio de espectroscopa UV a 275 nm se procedi de la
siguiente manera. Se prepar una recta de calibrado a partir de
un patrn acuoso de cafena de concentracin 50 mg L
1
.
Paralelamente se prepar una recta de adicin patrn,
agregando a cada matraz 2.00 mL de RedBull y el volumen de
patrn correspondiente. La lectura de la muestra problema se
realiz tomando 2.00 mL de RedBull y el que se llev a un
volumen final de 50.00 mL en un matraz aforado.
Las medidas de absorbancia se resumen en las siguientes
tablas:
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 39
Recta de calibrado
Matraz V
PATRON
(mL) V
MUESTRA
(mL) V
FINAL
(mL) A
C 1 4.00 - 50.00 0.191
C 2 8.00 - 50.00 0.407
C 3 12.00 - 50.00 0.589
C 4 16.00 - 50.00 0.821
MP - 2.00 50.00 0.431
Recta de adicin
Matraz V
PATRON
(mL) V
MUESTRA
(mL) V
FINAL
(mL) A
A0 (MP) 0 2.00 50.00 0.431
A1 4.00 2.00 50.00 0.551
A2 8.00 2.00 50.00 0.694
A3 12.00 2.00 50.00 0.807
A4 16.00 2.00 50.00 0.946
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 40
Recta y ecuacin de Calibrado
A = 0.051*C - 0.0064
R
2
= 0.9988
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 4 8 12 16
Concentracin (mg L
-1
)
A
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 41
Recta y ecuacin de Adicin
A = 0.0322*C + 0.4286
R
2
= 0.9989
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 4 8 12 16
Concentracin (mg L
-1
)
A
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 42
Comparacin Calibrado y Adicin
A = 0.0510*C - 0.0064
R
2
= 0.9988
A = 0.0322*C + 0.4286
R
2
= 0.9989
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
-16 -12 -8 -4 0 4 8 12 16
Concentracin (mg L
-1
)
A
C = 12.8 mg/L C = 7.9 mg/L
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 43
Resultados
Usando recta de calibrado:
C
M
= 7.86 mg/L 25 = 196.4 mg/L

Usando recta de adicin
CM = 12.75 mg/L 25 = 318.8 mg/L

Valor reportado:
Cafena 0.032% m/v

01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 44
Sin efecto matriz
A = 0.0510*C - 0.0064
R
2
= 0.9988
A = 0.0510*C + 0.4246
R
2
= 0.9988
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
-16 -12 -8 -4 0 4 8 12 16
Concentracin (mg L
-1
)
A
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 45
Anlisis de mezclas
Dado que las
Absorbancias son
aditivas el
espectrograma de una
disolucin conteniendo
a las especies
absorbentes M y N
tendra la siguiente
forma:
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 46
Ley de Beer para 2 compuestos en disolucin
N
N
M
M

N
N
M
M

N

M

N

M

c b c b A
c b c b A
A A A
A A A
2 2 2
1 1 1
2 2 2
1 1 1




01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 47
Ejemplo
La absorbancia de una mezcla de dos componentes (A y
B) fue medida a dos longitudes de onda. Si la absortividad
molar del componente A es 240 dm
3
mol
1
cm
1
a la longitud
de onda de 232 nm y 9748 dm
3
mol
1
cm
1
a 286 nm, y la
absortividad molar del componente B es 6450 dm
3
mol

1
cm
1
a 232 nm y 390 dm
3
mol
1
cm
1
a 286 nm. Calcule la
concentracin de A y B en la mezcla, si las transmitancias
medidas a 232 nm y 286 nm corresponden a 0,353 y 0,137
respectivamente.
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 48
Instrumentacin
Instrumentos Monohaz
Ventajas
1) Mayor rendimiento energtico
2) Mayor cuociente Seal / Ruido (< LODs)
Limitaciones
1) Mayor lentitud en las medidas
2) Presentan ruido de parpadeo en fuentes y
detectores
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 49
Esquema Instrumento Monohaz
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 50
Esquema Shimadzu UV 12002
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 51
Instrumentos Doble Haz
Ventajas
1) Variaciones en fuentes y detectores
compensadas
2) Mayor rapidez en las mediciones
3) Compensan automticamente las seales del
blanco
Desventajas
1) Menor rendimiento energtico
2) Menor razn Seal / Ruido (> LODs)
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 52
Esquema Instrumento Doble Haz con
Separacin Espectral
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 53
Espectrofotmetro Shimadzu UV 1601 PC
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 54
Esquema Instrumento Doble Haz con
Separacin Temporal
01-08-2014 21:18:21
Departamento de Anlisis Instrumental
Facultad de Farmacia 55
Esquema Beckman DBGT