Calibración y Regresiones

DEPARTAMENTO DE QUMICA Y CCMM
Prof. J.C. Vilchez Martn

TEMA 4 Calibraciones y regresin
Mtodos clsicos (va hmeda)
Mtodos Volumtricos
Mtodos gravimtricos
Ventajas
Anlisis de buena precisin
Anlisis de materiales patrones
Mtodos absolutos
Inconvenientes
Lentos
Sensibilidad limitada
Mtodos instrumentales
Cromatografa de gases (GC)
ICP
HPLC
Absorcin atmica de llama (AAS)
Ventajas
Gran sensibilidad
Potencia de anlisis
Ms rpidos
Automatizacin
Control computarizado
Tratamiento de datos
Datos grficos
Evaluacin estadstica
Comparacin espectros
Control de parmetros

Tcnicas electroqumicas
Algunos ejemplos
Absorcin molecular UV-vis (EAM)
Espectrometra de masas
Qu tienen en comn?
Patrones secundarios de concentraciones conocidas o
Patrones primarios certificado
Hay que establecer la relacin
Seal / Concentracin
Calibracin
Patrn primario certificado
Y en el ensayo
Muestra
Concentracin?
Interpolar la seal en la
curva de calibracin
Patrones de calibracin
Concentracin conocida
Cubrir el rango de concentracin de las muestras a analizar en los ensayos
Mismos disolventes y reactivos que en el ensayo
Matriz lo ms parecida posible que la muestra real
Incluir el blanco en la curva (no restar)
Grfica de calibracin
Seal instrumental en ordenada
Concentracin, cantidad en abcisa
Habitualmente lineal y = a + bx (no siempre)
Errores
Coeficiente variacin de seal instrumental 2-3%
Preparacin del patrn < 0,1% (despreciable)
Si se realiza varias medidas punto calibracin : Distribucin gaussiana normal
Centro de gravedad de la calibracin
(x , <)
Se establecen pares (x
i
, y
i
)
Se incluye el blanco (0, y
0
)
La calibracin es realmente lineal?
Rango de valores -1 r +1
+1 Correlacin positiva perfecta. Ajuste perfecto
-1 Correlacin negativa perfecta. Ajuste perfecto
0 No existe correlacin
Que valores de r indican una buena calibracin?
Se puede realizar un contraste estadstico en funcin del nmero de puntos de calibracin
H
0
r es pobre, x e y no guardan relacin t
calc
< t
crit
H
1
r es significativo, buena correlacin t
calc
> t
crit
Para t crtica = t
n-2, 0.05
(tabla dos colas)
t
calc

Generalmente para alrededor de 5 puntos de calibracin
r
2
> 0,995 Es aceptable
Asegura una relacin lineal? No
Malinterpretaciones de r
Estupendo r
2
> 0,995 = Relacin lineal
Falso
La relacin entre x e y es una funcin
polinmica de segundo grado
y = cx
2
+bx
2
+a
2
Malinterpretaciones de r
r =0 No existe relacin entre x e y
Falso
Si hay relacin entre x e y
pero no es lineal sino parablica
i i i
e y y Residuos
Para un x
i
de un patrn, diferencia entre el
valor de seal y
i
y la que le correspondera
en la recta de calibracin
Correlacin lineal
Distribucin de residuos gaussiana y de media 0
(simtricas)
Correlaciones no lineales
Distribucin de residuos no gaussina normal
Linealidad de la grfica de control
Homocedasticidad de residuos
Homocedasticidad
La dispersin (desv.std) de la poblacin
independiente de x (concentracin)
Todos los puntos en calibracin igual peso
Calibracin no ponderada
Heterocedasticidad
La dispersin (desv.std) de la poblacin
depende de x (concentracin)
Los puntos en calibracin no deben de tener igual
peso al realizar la regresin
Calibracin ponderada
Calibracin ponderada
Ponderar o no ponderar
Como podemos evaluar si las
desviaciones de la seal a lo largo de las
concentraciones difieren o no?
Repitamos n
1
veces un patrn de calibracin a baja concentracin del rango
Calculemos s
1

Repitamos n
2
veces un patrn de calibracin a alta concentracin del rango
Calculemos s
2

Dos s, averiguar si son significativamente la misma precisin
A que suena esto?

Al clsico test de Fischer
H
0
Fcal < Fcrit s
1
=s
2
Se asume que la precisin en el rango de concentraciones
de calibracin es la misma ( homocedstico, no ponderar)
H
1
Fcal > Fcrit s
1
=s
2
Son diferentes a lo largo del rango (heterocedstico,
ponderar)
Condiciones del modelo
Ya hemos ido viendo algunas
1. Calibraciones donde los errores de concentracin (cantidad) en la preparacin de los
patrones (0,1%) es despreciable frente a los errores aleatorios de la seal instrumental

2. La relacin con la seal es lineal en el intervalo de concentracin considerado

3. Los residuos son homocedsticos, misma precisin independiente de la concentracin

4. La distribucin de los residuos es normal y su media es cero
No No
Es la recta que minimiza la suma de los cuadrados de los residuos

Se establece una recta lineal que relaciona x e y
y = bx + a

Donde
Pendiente/ sensibilidad
instrumental
Ordenada en el origen
Ejemplo
La recta pasa necesariamente por (x ,
<)
Centro de gravedad de la calibracin
Recordad condicin 1, el error en la preparacin de patrones es despreciable (< 0,1%)
respecto a la dispersin de la seal (2-3%)

Utilicemos los cuadrados de los residuos para hallar una medida de los errores aleatorios
en la ordenada (seal)

Parecida a la desviacin
estndar de medidas repetidas
de una distribucin gaussiana
excepto que ahora trabajamos
con una recta (n-2)
Ahora podemos hallar los errores y lmites de confianza de la
pendiente y de la ordenada en el origen
Desviacin estndar de la pendiente Desviacin estndar de la ordenada en el origen
Intervalo de confianza de la pendiente

b t
(n-2)
s
b
Intervalo de confianza de la ordenada en el origen

a t
(n-2)
s
a
Para n-2 grados de libertad y la confianza/probabilidad deseada
(preferiblemente al 95%)
Tenemos la relacin lineal entre concentraciones y seal del instrumento

Analicemos una muestra de concentracin desconocida
Cual ser el error de la medida de concentracin interpolada?

Depende de la precisin de la seal instrumental (recuerda que era apreciable)
Depende de la incertidumbre/error de la calibracin efectuada (s
b
y s
a
)
Expresin del error global muy compleja !!!
Se utiliza una expresin aproximada
Siendo
y
0
valor de la seal experimental de la muestra
n N de patrones utilizados en calibracin
x
i
Concentraciones de patrones de calibracin
Que se puede transformar en
Siendo
m Repeticiones de la medida de la muestra

Si realizamos ms de una medida de la muestra
Intervalo de confianza de la concentracin interpolada (x
0
)
x
0
t
(n-2)
s
x
0
Para n-2 grados de libertad y la confianza/probabilidad deseada
(preferiblemente al 95%)
Tiende a 0 cuando la seal se
encuentra en la zona central de
la calibracin
Se minimiza s
x
0
Se minimiza los errores y la incertidumbre
x
0
t
(n-2)
s
x
0

Los menores errores en el centro de la calibracin
Interesa seleccionar bien cual es el rango de
concentracin que queremos cubrir antes de calibrar

Zona central calibracin = Rango de concentracin
esperado de las muestras
x
0
t
(n-2)
s
x
0
mnimo Medida con bajo error asociado
x
0
t
(n-2)
s
x
0
mximo Medida con alto error asociado
Como se calculan?
Definicin
Aquella concentracin de analito que proporciona una seal en el instrumento
significativamente diferente de la seal de ruido de fondo o seal de un blanco
Donde situar la frontera entre ruido y seal de analito?
Definicin abierta a interpretacin
Situmoslo en Lc para (p.e. 0,05) distribucin normal de la seal de ruido o blanco (y
b
)
Imaginemos que son 2 ppb
Cualquier seal que de una
concentracin > 2 ppm se debe al
analito y no a ruido

Podemos cometer error !!!
Hay ocasiones () en las que damos
por seal de analito lo que es ruido
Estamos diciendo que nuestro tcnica ve
a partir de 2 ppb pero
Qu pasa con los valores de seal y concentracin < 2 ppb que se deben a analito?

Errneamente decimos que es ruido cuando es seal de analito
No podemos definir LOD de esta forma, demasiado error
Debemos aumentar el lmite de deteccin para tener
menos errores y
Si distancia L
D
Y
B
= 3 S
blanco
Se demuestra que los errores y < 7%
Error razonable que es asumible

0
=
D
Recuerda !!! que s es
igual en todo el rango de
concentracin calibrado
HOMOCEDASTICIDAD

Hemos definido LOD
Y
LOD
= Y
B
+ 3 S
Blanco
Tambin se utiliza LOQ
Y
LOQ
= Y
B
+ 10 S
Blanco
El criterio de utilizacin es puramente
arbitrario, pero hay que indicar el
mtodo utilizado

Interpolar en recta
calibrado para averiguar
concentraciones
LOD o LOQ
Recuerda!!! HOMOCEDASTICIDAD de residuos

Obtencin del valor de Y
Blanco
Podemos tomar el valor a (ordenada en el origen) de la calibracin

Podemos pasar 10 veces un disolucin blanco y realizar promedio de seal
Obtencin del valor de S
Blanco
S es igual en todo el rango de concentracin
calibrado
Podemos tomar S
Blanco
= S
y/x
de los puntos de calibracin

Podemos realizar la S de las 10 medidas de seal de blanco
Interpolar en recta
calibrado para
averiguar
concentraciones
LOD o LOQ
La adicin de patrn es apropiada cuando la composicin de la
muestra es desconocida o compleja y afecta a la seal analtica
No siempre podemos aislar el analito de
inters del resto de componentes que lo
acompaan en la muestra

Influirn en la seal del analito?
ICP
Influirn en la seal del analito?
La respuesta es posiblemente s

En funcin de
Tcnica analtica empleada
Naturaleza de componentes que acompaan
Concentracin de estos componentes

pueden influir en la seal del analito:
Interfiriendo directamente la seal de analito
Inhibiendo/activando el proceso fisico-
qumico que produce la seal
Si realizamos calibracin con disoluciones puras de Zn (II) en agua destilada
estaramos cometiendo un error ya que la relacin Seal/concentracin Zn(II) nada
tiene que ver el de las muestras reales (interferidas por Na
+
)
Queremos analizar Zn en agua de mar
Alrededor de 11000 ppm Na
+
Solucin
Reproduzcamos lo mejor posible
condiciones de salinidad de muestras
aadiendo 11000 ppm de Na
+
a cada patrn
Ahora queremos analizar Zn en agua de ra
ppm Na
+
?

En funcin de las mareas y entrada de agua de mar a la ra
Rango desde unos pocos ppm hasta 11000 ppm

Solucin
Mtodo de adicin de patrn
No podemos realizar unas condiciones de calibracin que reproduzca
el nmero infinito de posibilidades de concentracin en Na
+
en
muestras a distinta salinidad
En que consiste?

Adicin de cantidades conocidas (excepto a una)
de concentracin de analito de inters a
volmenes iguales de la muestra a analizar
Concentracin en
Zn de la muestra
analizada?
Extrapolar
Extrapolacin
Sx
E
algo diferente a la expresin para una
calibracin normal por interpolacin
Cmo mejorar la precisin?

Aumentando en nmero de adiciones n (al menos n=6)

Maximizando (x
i
- x)
2
, Deben cubrir un intervalo suficientemente grande

Si No
Intervalo de confianza de la concentracin extrapolada (x
E
)
x
E
t
(n-2)
s
x
E
Cantidad de muestra disponible grande

Cada muestra requiere su propia grfica de calibracin

La extrapolacin es menos precisa que interpolacin
Cmo comprobar si existe efecto matriz y si debemos realizar adicin patrn?
Se representa calibracin normal
(disoluciones de analito puro) y adicin
de patrn sobre una muestra
No hay efecto matriz
Pendientes iguales (lneas paralelas)
Hay efecto matriz
Pendientes desiguales
Desventajas de adicin de patrn
til para la calibracin de impurezas de disolvente orgnico
Cromatografa de gases (GC)
Queremos calibrar las impureza DAA y otras de la acetona
Utilizamos patrones en acetona (idntica
matriz que muestras) aadiendo
concentraciones conocidas de DAA y dems
impurezas
Problema
No existe una acetona
perfectamente pura, siempre
tiene DAA y dems impurezas
Obtendremos una curva de calibracin similar a las de
adicin de patrn (igual para resto de impurezas)
DAA
En este tipo de casos no hay mayor efecto
matriz una vez los patrones se preparan en
el propio disolvente

Misma pendiente de respuesta que si la
acetona para preparar patrones de
calibracin fuera totalmente pura

Se le descuenta la seal en el origen que
pertenece a la concentracin de DAA que
lleva la acetona con la que se prepararon los
patrones
DAA
y = a + bx
y = bx
Nos quedamos con el
factor de respuesta
instrumental respecto
a la DAA
Heterocedstico
La desviacin estndar
aumenta con la concentracin
Los puntos de calibracin a baja concentracin
son ms de fiar que los de alta

Debemos darle ms peso en la calibracin
PONDERAR
Como lo haremos?
Aplicando un factor de peso
inversamente proporcional a
desviacin estndar de cada
punto
Necesitamos ms informacin (s en cada punto)

Clculos ms complicados
Como cambian las parmetros de recta de calibracin?
Siendo ahora los valores del
centro de gravedad
Y el error de concentracin en la interpolacin sobre la recta de calibracin?
En la direccin y En la concentracin tras interpolacin
Los valores de centro gravedad en
calibracin ponderada ms prximos a
valores bajos
(x
w
, <
w
)
En la prctica para simular el
efecto de ponderacin en
regresiones no ponderadas se
suelen utilizar concentraciones
que no varan de forma
uniforme forzando la recta a
ajustarse a valores bajos de
concentracin
0
200
400
600
800
1000
1200
0 20 40 60 80 100 120
Qu es un patrn interno?

Compuesto que no pertenece ningn componente de la muestra a analizar que se
aade siempre en la misma cantidad a todas los patrones y muestras a analizar
Patrn Interno
+ 10 ppm P.I.
Para qu?
Para corregir la fluctuacin de seal de respuesta del equipo,
especialmente en aquellas tcnicas con un S
y/x
alto
Errores aleatorios de detector
Errores de caudal de lquidos/gases portadores
Errores aleatorios de control de parmetros de equipo
Fluctuaciones de tensin elctrica, etc.
Cmo?

El P.I. se aade siempre en la misma cantidad, debe dar siempre misma seal Y
Las variaciones de Y del P.I. sern las mismas que sufran las de nuestros analitos
Con esta informacin se realiza correccin
y = 20,3x + 6,5
R = 0,9932
0
100
200
300
400
500
600
700
0 5 10 15 20 25 30 35
ppm Analito Area pico
Pat 0 0 0
Pat 1 5 107
Pat 2 10 223
Pat 3 15 288
Pat 4 20 433
Pat 5 25 532
Pat 6 30 594
Mala calibracin debido a la mala precisin
de la seal del equipo?

Aadamos P.I. a cada patrn de calibracin
ppm analito
rea pico
ppm Analito Area pico Area P.I. A Pico/ A P.I.
Pat 0 0 0 101 0,00
Pat 1 5 107 105 1,02
Pat 2 10 223 115 1,94
Pat 3 15 288 95 3,03
Pat 4 20 433 108 4,01
Pat 5 25 532 109 4,88
Pat 6 30 594 98 6,06
y = 0.1998x - 0.0060
R = 0.9992
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
0 5 10 15 20 25 30 35
rea pico Analito / rea P.I.
ppm analito
Se divide el rea de pico del analito por el
rea de pico del P.I. cancelndose
mutuamente las fluctuaciones del equipo
en un nuevo ndice libre de ellas

La precisin de la calibracin mejora
enormemente

Se procede igual para muestras
(aadiendo la misma cantidad de P.I.),
ahora la seal de interpolacin ser

rea analito muestra/ rea P.I.
+ 10 ppm P.I.
Requisitos patrn interno

No debe ser un componente de la muestra

Zona de seal libre de interferencias de los componentes de la muestra

Con caractersticas fisico-qumicas similares a los analitos que se analizan
Deben sufrir con la misma intensidad las fluctuaciones de seal del equipo
En ocasiones se utilizan ms de 1 patrn interno para cubrir distintas zonas
del espectro o cromatograma

No reactivos con ninguno de los componentes de la muestra

Estables

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