Facultad de Ciencias Mdicas

Escuela de Tecnologa Mdica

Carrera de Laboratorio Clnico e Histotecnolgico

Tema: PCR

Integrantes:
Nathaly Gaibor
Jimmy Tafur

Quinto Semestre
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL
ECUADOR
AMPLIFICACIN
DE DNA IN VITRO:
PCR (POLYMERASE CHAIN
REACTION)
PCR
Polymerase Chain Reaction

Es la amplificacin de DNA in vitro por medio de la
polimerizacin en cadena de DNA utilizando un
termociclador.

El propsito del PCR es hacer muchas copias de un
fragmento de DNA.

Se realiza la amplificacin de un segmento especfico
de DNA, teniendo poco material disponible.

Polimerasa Chain Reaction: Reaccin en
Cadena de la Polimerasa

Fue diseada por el Dr.
Kary Mullis en 1987.

Gan el premio Nbel de
Qumica en 1993 por su
invento.

Utilizo el PCR para
amplificacin del gen de
-hemoglobina humana, y
el diagnostico prenatal de
anemia falciforme.
Termociclador
La PCR se realiza
en un Thermo
Cycler
Termociclador.

Es una mquina
que calienta y enfra
la reaccin en
periodos cortos de
tiempo.

1. Desnaturalizacin: Consiste en separar la doble hebra de
DNA y convertirla en hebra sencilla.
-Tpicamente se usa una temperatura de 95C - 97C, por 15 a
40 segundos el tiempo depende del tamao del genoma-


El proceso de PCR incluye 3 pasos
bsicos que se repiten 25 veces o ms:
2. Apareamiento o anneling:
Los cebadores primers previamente diseados,
reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se
pegan en lugares especficos por
complementariedad de bases. Para esto, se baja la
temperatura -ej: 55C por 30 segundos-. La
temperatura y el tiempo puede variar entre
cebadores segn sea el caso.
3. Polimerizacin o Extensin.
Una Polimerasa de DNA extiende los primers, en el
espacio comprendido entre ambos primers, y coloca
dinucleotidos trifosfatados (dNTPs) de 5a 3 leyendo el
DNA de 3a 5. De estas forma sintetiza la secuencia
complementaria de las hebras de DNA molde

Se efecta a 70C por 1 minutos (puede variar segn
sea necesario)
Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.
En el PCR hay una amplificacin exponencial
Reactivos necesarios para PCR:
Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH
8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2.
MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se
usa 25mM -Es un cofactor para la funcin de la
polimerasa-
dNTPs (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP,
dCTP, dTTP.
-La concentracin de dNTPS, es proporcional al tamao
del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a
amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb,
necesitamos ms concentracin de dNTPS para el de
5500pb.
-Generalmente, se usa una concentracin de 200M de
cada uno.

Reactivos necesarios para PCR:
Cebadores primers: Son secuencias cortas
de nucletidos 20-24 nucletidos de longitud,
complementarias a una regin del DNA que se
quiere amplificar. -Se usa a concentracin de
1M-
DNA molde: El DNA a amplificar puede tener
desde 50 a 2,000 nucletidos de longitud.
El mnimo va de 10-100 ng. y el mximo entre
400-500 ng.
Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades
por reaccin.

ADYUVANTES DE LA PCR

Son elementos que mejoran el rendimiento y la
especificidad de la PCR.

Se usa DMSO, glicerol o BSA.

El adyuvante ms utilizado es el BSA. A
concentraciones por encima de 0.8 g/l el BSA
incrementa la eficiencia de la PCR ya acta como
una protena captadora de iones que pueden ser
inhibidores de la Taq polimerasa

En un principio, la polimerasa de DNA que
se utilizaba era de la bacteria E. coli, pero
esta es sensitiva a alta temperatura, por lo
que haba que aadir enzima fresca al
comenzar el tercer ciclo.

Se reemplazo la enzima por la de la
bacteria Thermus aquaticus conocida
como Taq pol
Polimerasa
Anlisis de la Muestra
La deteccin del producto de la
PCR se realiza normalmente
mediante corrido
electrofortico.

Dependiendo del tamao de la
amplificacin y la resolucin
que deseemos utilizaremos
diferentes medios (agarosa,
poliacrilamida) a distintas
concentraciones.

Anlisis de la Muestra

La posterior visualizacin se puede realizar con
bromuro de etidio (lmpara de luz UV), tincin de
plata, fluorescencia, radioactividad
Ladder: pesos conocidos
1: Fragmento a 1857 pb
2 y 4: Fragmento a 800 pb
3: No hay producto
5: Multiples bandas (primers
inespecficos se pegan a
varios sitios)
Anlisis de la Muestra
En algunos casos, los productos
amplificados poseen secuencias que son
reconocidas por endonucleasas
Hibridacin, Southern Blot

Se puede amplificar directamente de:
ADN genmico
cDNA (RT-PCR)
Aplicaciones
Deteccin de agentes infecciosos como: hepatitis B
y C, papiloma virus, HIV, entre otros
Anlisis de DNA de cualquier organismo vivo o
muerto, anlisis de fsiles
Mutagnesis dirigida (cambios en la informacin
contenida a travs de primers con mutaciones)
Investigacin forense
Pruebas de paternidad

Utilidad del PCR

Ventajas del PCR
A partir de una muestra pequea de ADN se puede obtener
una cantidad considerable para el estudio que se vaya a
realizar.
El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y
anlisis.
Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o
muerto.
Sus aplicaciones son mltiples: medicina forense,
diagnsticos, anlisis prenatales, etc.
Desventajas del PCR
Se puede reproducir solamente partes del genoma en
donde se conoce por lo menos una mnima secuencia de
20 40 pb.
Se necesitan primers especficos que sean
complementarios al fragmento que se desea sintetizar.
La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el ADN
Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo
investigador o de cualquier otro)
Materiales Para PCR
Termociclador Thermo cycler
Microcentrfuga
Micropipetas de 2, 20 y 200 ul
Microtubos para PCR, estriles
Puntas estriles
Agua destilada, desionizada y
estril
ADN molde (ADN en estudio)
Primer Forward y Reverse
dNTPs (dATP, dTTP, dCTP,
dGTP de [25 M] c/u)
10X buffer para PCR (Solucin
amortiguadora para PCR)
MgCl
2
(25

mM)
BSA
Polimerasa Taq

Procedimiento para extraccin del DNA
genmico (previamente realizado)
Se realiz un frotis bucal
El contenido del hisopo swab se resuspende en 1000ul de NaCl 0.9%
Centrifugar por 5 minutos a 7K
Descarta sobrenadante
Resuspender el precipitado pellet en 500ul de chelex al 10%
Incubar a 100C por 20 minutos
Centrifugar por 5 minutos a 7K
Tomar el sobrenadante ( DNA en solucin)
Dejar la muestra a -20 grados hasta cuando se va a trabajar con ella
Nota: El chelex acta como agente desestabilizador de membranas y quelante.





























































































































Diagrama de la extraccin del DNA genmico
(previamente realizado)
Procedimiento para amplificar el DNA (PCR)
Aada los siguientes reactivos en el orden indicado:

Cantidad (ul) Componente
10.3 Agua estril (dH
2
O)
3.0 MgCl
2
25mM

0.5 BSA 100X

1.5 2.5 Mm de dNTPs
1.0 Primer H34. 5-3
1.0 Primer L15829. 3-5
2.5 Buffer 10X
0.2 Taq pol
5.0 DNA en estudio

Mix 1
17.3
Mix 2
2.7
Total: 25 ul
Condiciones para reaccin en el
termociclador:
1 ciclo : 94C por 2.5 minutos.
32 ciclos: 94 C por 30 segundos
54 C por 1 minutos
72 C por 70 segundos
1 ciclo: 72 C por 10 minutos

Lleve a reaccionar en el termociclador.
Secuenciacin de DNA
Mtodo enzimtico de terminacin de cadena
(mtodo dideoxi de Sanger)
Polimerizacin interrumpida de ADN
Se lleva a cabo polimerizacin de ADN en
presencia de derivados dideoxi que detienen
la polimerizacin en diferente momento,
obtenindose fragmentos de diferente tamao.
Se examinan en electroforesis, se lee
secuencia directamente del gel
Mtodo dideoxi de Sanger
Mtodo dideoxi de Sanger (2)
Mtodo dideoxi de Sanger (3)
Mtodo secuenciacin automtica
Electroferograma de la secuenciacin
automtica
Geles de secuencia
Secuencia automtica Secuencia Manual
WEBGRAFA
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisa
mples/molecularbiology/pcr.html
http://smcg.cifn.unam.mx/enp-unam/03-
EstructuraDelGenoma/animaciones/secuenci
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