MTODOS DE ESTUDIO DE LA BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR

Inicia en el siglo XVI con el uso de lentes y microscopios compuestos Lewenhock aporta con investigaciones de la microfauna de los estanques y charcas. Las investigaciones de Robert Hooke, entre otros establecieron la microscopia como poderosa herramienta cientfica. Zacharias y Janssen construyeron en 1590 el primer microscopio registrado.

Desarrollo de la biologa celular y molecular

Se produce en forma paralela a la invencin de instrumentos y tcnicas biofsicas y bioqumicas. El perfeccionamiento de tecnologa y mtodos citolgicos. Extienden los sentidos a nuevos lmites y ampliando el conocimiento de la estructura y funcionamiento de la clula. Avance en el conocimiento de ultraestructura y funcin de la clula.

Microscopa
Microscopio, permite observar objetos pequeos que no pueden observarse a simple vista. Dos valores importantes en microscopia son el aumento y el poder de resolucin . Aumento, son las dimensiones aparentes de los objetos comparados con su tamao real. Poder de resolucin, medida de la nitidez de la imagen.

Lmite de resolucin

Limites de resolucin

Ejemplos de niveles de organizacin a nivel microscpico.

Diversos tipos de microscopa

Las tcnicas y equipos, desarrollo de nueva tecnologa, permiten avances microbiologicos Los alcances y mejoras llegan a nivel molecular. Actualmente contamos con equipamientos para diversos alcances visuales.

Microscopa

Campo claro Campo Oscuro

pticos

Contraste de fase Confocal Fluorescencia

Tipos de microscopios

Electrnicos

Transmisin
Barrido

Microscopa ptica
Estudio de la clula viva, requiere tcnicas pticas especiales. Ej: la microscopia de contraste de fase, campo oscuro o la de interferencia. Nivel macromolecular, la difraccin de rayos X es la tcnica ms adecuada para estudiar la configuracin molecular de protenas, de cidos nuclecos y virus. Los compuestos qumicos que constituyen la clula pueden ser detectados, descriptos y localizados dentro y fuera de la clula mediante mtodos adaptados de la Qumica Analtica.

Microscopio ptico
El microscopio ptico comn permite estudiar la morfologa celular de las clulas, vivas y fijadas. Forma y estructura de los organelos ms grandes. Los organismos que podemos observar con este instrumento son parsitos, bacterias y otras estructuras cuyo lmite de resolucin sea mayor a 0,2 um. Sus ventajas son la facilidad de manejo y alta disponibilidad.

Microscopio de contraste de fases

Observacin de clulas vivas, componentes transparentes por su alto contenido de agua. Al disecarla no presenta un significativo contraste. Los microscopio de contraste de fase y de interferencia son sistemas pticos especiales que logran intensificar la escasa interferencia. Proporcionan mayor contraste que el obtenido con un M.O comn.

Microscopio de polarizacin
Provee datos sobre la estructura a nivel molecular de las clulas y los tejidos. Aplica luz polarizada a la muestra observada Usados en clulas vivas y en preparados post-mortem.

Microscopio de campo oscuro

Facilita la observacin de clulas vivas. El haz luminoso se proyecta oblicuamente y los sistemas de lentes detectan la luz reflejada por la muestra que se ve como un objeto brillante contra un fondo oscuro. Logr un gran relieve de rasgos de la clula que son invisibles en el MO.

Mtodos Citoqumicos

Aplicados para el estudio de la composicin qumica de las clulas y sus procesos biolgicos moleculares. Mediante anlisis qumicos y fsicoqumicos que permitan su observacin. Objetivo es cualitativo y cuantitativo Estudia los cambios dinmicos producidos en el contenido qumico celular en las distintas etapas del metabolismo. La muestra debe ser:
a) inmovilizada (fijacin) b) Usar un procedimiento especfico (tincin). Fig. Celulas ovocitarias

Histoqumica
Ciencia que se dedica al estudio de los procesos qumicos de los tejidos y sus elementos constituyentes. Tcnica histolgica, conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada (tejido biolgico) para que sea posible su estudio por medio del microscopio.

Preparacin de tejidos para estudio microscpico

Inicia con la toma de muestra. La obtencin de la muestra puede ser de: Tejido vivo (biopsia) Tejido muerto (necropsia).

Tcnicas de obtencin de muestras

Raspado, obtencin de muestras de mucosa (bucal, vaginal). Aguja de biopsia, se obtiene porcin de tejido (hgado). Diseccin directa, en tejidos superficiales (piel). Endoscopia, para obtencion de muestras de rganos huecos o cavidades corporales. Cateter, se puede usar para toma de muestra de sangre.

Fijacin
Evita la destruccin enzimtica de las clulas por autlisis, impide la proliferacin bacteriana. Mantienen la estructura y evita descomposicin del tejido. Endurece las estructuras celulares y se aumenta la afinidad hacia los colorantes. Se puede realizar por medios fsicos como el calor o desecacin o por medios qumicos.

Fijadores qumicos
Por medios qumicos: alcohol, acetil alcohol,formol, Acido actico, tetraoxido de osmio, entre otros en diferentes combinaciones.
Formaldehdo:

fijador ms empleado en microscopa comun. Glutaraldehdo: fijador de uso frecuente en microscopa electrnica.

Cortes finos, resinas y ultramicrtomo

La mayor parte de las clulas se encuentran formando parte de los tejidos, por lo que es necesario hacer cortes en secciones finas, para un examen al microscopio. Los cortes se realizan por un micrtomo, para lo cual se debe fijar el tejido e incluirlo en parafina, Proceso que facilita el corte en el micrtomo. Los cortes obtenidos, con espesores de 3 a 6 micras se pueden observar en microscopios compuestos y en electrnicos.

Proceso de fijacin y corte

Coloraciones
Sirven tambin para diferenciar en los tejidos las diferentes estructuras o sustancias. Mediante tinciones o coloraciones es posible identificar compuestos orgnicos celulares, como lpidos, enzimas, cidos nucleicos, etc.

Tipos de coloracin
Colorantes vitales, no alteran la fisiologa celular y facilitan la identificacin de organelos. Se usan para teir clulas vivas, se ponen entre el porta y cubre objetos e ingresa en la muestra por difusin. Colorantes supravitales, son aquellas que se usan in vitro, tiendo clulas vivas que han sido separadas del organismo. Tincion "de rutina, de uso frecuente, hematoxilina y eosina (H&E), .

Tincin de Gram
Tipo de tincin diferencial. Para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Se utiliza tanto para distinguir la morfologa celular bacteriana y para poder realizar la diferenciacin bacteriana Bacteria Gram positiva, a las bacterias que se visualizan de color moradas. de Bacillus anthracis. Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella Ej E.coli

Radioautografa
Tcnica citoqumica, para detectar Isotopos radioactivos, que previamente fueron introducidos como marcadores de diversas sustancias en las clulas. Se emplean para estudiar la duracin del ciclo celular, secrecin de sustancias y sntesis de compuestos como el ADN y el ARN. Procedimiento que introduce un istopo especfico, que se asocia a la sustancia que se pretende localizar, de la que se obtiene una placa microfotogrfica.

Fraccionamiento celular
Tcnicas que permiten la obtencin de fracciones relativamente puras de organelos e inclusiones. En la centrifugacin de un homogeneizado de clulas, las membranas plasmticas se rompen y sus constituyentes quedan dispersos en un medio lquido, que gralmente es la sacarosa, a diferentes concentraciones. Velocidades de 80000 (RPM). Fuerzas sobre las partculas de 500000 veces mayores que la fuerza de la gravedad (500000g).

Centrifugacin
Los organelos mayores y ms densos se extraen primero. Se vuelve a centrifugar el sobrenadante a mayor velocidad, obtenindose diferentes fracciones celulares, por centrifugaciones sucesivas. Primera fraccin: ncleos Segunda mitocondrias y lisosomas Tercera endomembranas membranas Finalmente los ribosomas.

Esquema de proceso de centrifugacin

Anlisis molecular del ADN e ingeniera gentica

Tcnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza Visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo Permite amplificar una regin en una enorme cantidad de molculas. Aplicaciones: diagnstico de enfermedades hereditarias, bsqueda de alelos ms o menos frecuentes asociados a una caracterstica que nos interesa seleccionar.

Aplicaciones mdicas
Diagnstico de contaminacin bacteriana en alimentos (deteccin de E. coli, cepas diferentes de Salmonellas, Mycobacterium sp.) Diagnstico viral o de infeccin viral (HIV, Hepatitis C, PIF, otros). Seleccin de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento gentico de una especie. Test de paternidad, diagnstico de identidad forense, etc.

TAREA Investigar Usos, resolucin, aplicaciones en medicina.

Microscopio

de interferencia Microscopio confocal Microscopa electrnica

- Microscopa electrnica de transmisin - Microscopa electrnica de barrido