Cromatografa

Cromatografa

Cromatografa

Cromatografa

Cromatografa

Descubridor
El botnico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich Tsvett !"#$%!&!&'

Definici(n
Cromatografa es un m)todo de se*araci(n en el +ue se a*rovechan las diferencias en el com*ortamiento de *artici(n entre una fase m(vil , una fase estacionaria *ara se*ara los com*onentes de una me-cla.

Cromatografa definici(n (cont.' /na columna u otro so*orte mantienen a la fase estacionaria , la fase m(vil acarrea a la muestra. 0os com*onentes de la muestra +ue *articionan fuertemente con la fase estacionaria estarn ms tiem*o dentro de la columna.

Si es en columna 1
Conforme los com*onentes son eluidos de la columna *ueden ser cuantificados *or un detector , colectados *ara anlisis *osterior

M)todos cromatogrficos
De gases En ca*a fina En l+uidos inmovili-ados De e2clusi(n molecular 3ntercambio i(nico 4idro2ia*atita 4idrof(bica 5finidad 460C

E2clusi(n molecular
7ase estacionaria1
8 De2trn con enlaces cru-ados 8 5garosa con enlaces cru-ado 8 6oliacrilamida

0as mol)culas grandes flu,en ms r*ido +ue las *e+ue9as.

Desarrollo de una cromatografa de e2clusi(n molecular

Determinaci(n del tama9o de columna 4idrataci(n , lavado de la resina Em*a+ue de la columna Determinaci(n del volumen vaco Corrimiento de la muestra la

Cromatograma de e2clusi(n molecular (EM'

Elusi(n de una columna de cromatografa de EM

Cromatografa de e2clusi(n

Caractersticas de las resinas de EM clsicas

Aombre :io;el C(digo 6%<= 6%!== 6%$== 6%>== ;%?= ;%!== ;%!?= ;%$== Bango de 7raccionamiento (kDa' >%<= ?%!== >=%$== <=%>== $%>= @%!?= ?%>== ?%<== 7luCo m2imo (cmDhr' ? ? @ > ? ? > $

Se*hade2

3ntercambio i(nico

3ntercambio i(nico
0as *rotenas difieren mucho en su afinidad *or materiales cargados *ositiva o negativamente. 0os so*ortes *ueden ser1
8 De2trn con enlaces cru-ados 8 5garosa con enlaces cru-ado 8 6oliacrilamida 8 Celulosa 8 6oliestireno 8 Slice

;ru*os intercambiadores
7osfato (6'
E6G>% EC4$ ECGG% + E(C4$'$EA4 C4$ EC4>

Carbo2imetilo (CM'

Dietilaminoetil (DE5E' Mono H

EC4$ E AFE (C4>'>

C4$ EC4>

6rinci*ios del intercambio i(nico

0a afinidad de una *rotena es *ro*orcional a la concentraci(n de sal re+uerida *ara liberarla del material. /na columna se carga (de *rotenas' con un amortiguador de baCa fuer-a i(nica , la elusi(n se inicia *or incremento de la concentraci(n del amortiguador de elusi(n.

Desarrollo de una cromatografa de intercambio i(nico

4idrataci(n , 0avado de la resina 5ctivaci(n (lavado con cido , base fuerte diluidos 4Cl !M seguido de AaG4 !M , finalmente con la sal +ue se usar eC. AaCl !M , e+uilibrar con buffer sin sal' Iolumen de la columna , ca*acidad de retenci(n de la resina.

Diferentes sales tienen diferentes fuer-as de eluci(n cuando se usan en cromatografa de intercambio i(nico. 3ntercambio del ani(n
8 citratoJsulfatoJo2alatoJ3%JAG>%$JCrG@%J:r% J SCA% J Cl% J 7ormiato

3ntercambio del cati(n

8 :a$F J 6b$F J Sr$F J Ca$F J Ai$F J Cd J Cu J Co J KnJMgJTiFJ 5g J BbFJCsFJLFJA4@FJAaFJ4FJ0iF

5mortiguadores
6ara intercambiadores ani(nicos se deben usar amortiguadores cati(nicos o -witterionicos Ao usar amortiguadores ani(nicos *ues se unen a la resina. /sar detergentes cati(nicos o no i(nicos.

Cromatograma de intercambio i(nico

b 53
500

30

60

90

Tiempo de retencin (min)

NaCl mM

280 nm

4idro2ia*atita (45'
3ntroducida *or Tiselius et al. en !&?< :ernardi reali-( un estudio sistemtico (Meth. 3n En-imol. Iol. $$ , $#'

Tiselius A et al., (1956) Protein chromatography on calcium phosphate columns, Arch Biochem Biophys 65, 132155

7(rmula
7orma cristali-ada de fosfato de calcio (Ca10(PO4)6(OH)2)

Kawasaki T et al., (1985) Hydroxyapatite high-performance liquid chromatography: column performance for proteins, Eur J Biochem 152, 361371

/ni(n selectiva de *rotenas a la hidro2ia*atita

5 es una *rotena bsica. : es una *rotena acdica El tringulo indica enlaces de coordinaci(n. 0os dobles *ar)ntesis indican re*ulsi(n. 0as lneas *unteadas indican enlaces i(nicos.

Los grupos amino son atrados por los sitios fosfato pero repelidos por los sitios carboxilo. Esto es al contrario para los carboxilos.

5dsorci(n de gru*os amino

Se debe a interacci(n electrosttica no es*ecfica entre su cargas *ositivas , las cargas generales negativas de la columna de 45 cuando la columna es e+uilibrada con amortiguador de fosfato.

3ncremento de la uni(n de aminas *or blo+ueo de la re*ulsi(n.

5 es una *rotena bsica. : es una *rotena acdica El tringulo indica enlaces de coordinaci(n. 0os dobles *ar)ntesis indican re*ulsi(n. 0as lneas *unteadas indican enlaces i(nicos.

Los grupos fosfatos en solucin pueden cubrir a calcios que repeleran a los grupos aminos.

Disociaci(n selectiva de la hidro2ia*atita

5 es una bsica. : es una acdica El tringulo enlaces coordinaci(n. +ue estos afectan. *rotena *rotena indica de Aotar no se

Efecto de la concentraci(n de fosfato en la uni(n de *rotenas

El *erfil su*erior fue cargado con fosfato ! mM El inferior con fosfato ?= mM. 0a ca*acidad de uni(n de las 3g; se meCor( reduciendo la com*etencia de contaminantes.

:arrido con dos gradientes

El *rimer gradiente va de = a ?== mM de cloruro de sodio. El segundo de = a ?== mM de fosfato de *otasio. El amortiguador base es =.? M MES !mM fosfato *4 <. 0a elusi(n de la 3g; se observa en gris

/sos
6urificaci(n de1
8 6rotenas 8 Mcidos nucl)icos 8 Iirus

:ases de la T)cnica
Su selectividad no de*ende de la masa molecular densidad de carga o *unto isoel)ctrico.

:ases de la t)cnica
0a adsorci(n , la eluci(n de las *rotenas no son *rocesos en reversa de un solo efecto. 0os gru*os amino , carbo2ilo actNan de manera diferente en la adsorci(n de las *rotenas a la 45. 0a eluci(n de *rotenas cidas , bsicas *or diferentes sales tiene deferentes mecanismos.

IentaCas
45 tiene *oco *oder de adsorci(n de mol)culas de masa molecular baCa como nucle(tidos sales , aminocidos. Es relativamente incom*resible. E2isten variantes cermicas ms fciles de trabaCar *ues no se com*actan.

Cromatografa hidrof(bica

Cromatografa 4idrof(bica
0os gru*os adicionados al so*orte son el alcohol octlico gru*os bencnicos u otros gru*os hidrfobos como hidrocarburos (C4, C8 o C18). 0os centros hidr(fobos de las *rotenas son e2*uestos *or e2ceso de salinidad , son atra*ados *or la columna.

Cromatograma hidrof(bico
b 53
500

30

60

90

Tiempo de retencin (min)

(NH4)2 !4 mM

A 280 nm

Series caotr(*icas
5niones 6G@8JSG@8JC4>CGG8JC08J:r8JAG>8 JClG@8J3JSCA8 Cationes A4@FJBbFJLJAaFJCsFJ0iFJMgJCa$FJ:a$F

Cromatografa de 5finidad
Sistema mu, *oderoso de *urificaci(n Sistema restringido Se basa en la interacci(n es*ecfica de dos com*uestos
85ntgeno % 5nticuer*o 8En-ima % sustrato 8Bece*tor % 0igando

460C
Cromatografa l+uida de alta resoluci(n 4igh%*erformance li+uid chromatogra*h,

0imitaciones de la cromatografa a baCas *resiones

3m*osibilidad fsica de aumentar el fluCo
8 Besinas com*resibles

Corridas de muchas horas ;randes volNmenes

Descubrimientos +ue facilitaron la 460C

Sntesis de resinas incom*resibles Auevas t)cnicas en el em*a+ue de las columnas Micro*articulaci(n de las resinas 5delantos en la tecnologa es*ectrofotometrica

Ti*os de 460C
De e2clusi(n molecular 3ntercambio i(nico 4idrof(bica 5finidad De fase reversa

3nstrumentaci(n
Sistema de bombeo
8 Besistente a +umicos 8 6oca variabilidad 8 6resiones de >= as @== atm 8 7luCo constante (libre de *ulsos' 8 :uen me-clado de los solventes 8 Be*roducibilidad en la formaci(n de los gradientes

Ti*os de bombas
Oeringa 6ist(n rec*roco Diafragma 6resi(n constante

Detectores
Detectores de /I%Iisible +ue *ueda leer $ o ms longitudes de onda al mismo tiem*o Detector de arreglo de diodos. Es*ectro de $== a <== nm en menos de ! segundo.

Cromatografa de fase reversa

Se basa en las *ro*iedades hidrof(bicas de las *rotenas. El *roceso de eluci(n es diferente +ue en la cromatografa hidrof(bica 0a fase m(vil es un solvente orgnico (metanol $%*ro*anol o acetonitrilo' acidificado (T75 cido fosf(rico ac)tico o hidro2ibutrico'.

7ase estacionaria
Slica aco*lada con un derivado al+uilsilano. 0a longitud de la cadena al+uilo *uede ser de C@ C" C!". 0a *orosidad del so*orte es variable se recomienda +ue sea entre >== o !=== 5 El tama9o de las *artculas es de ? $= m , a a

7ase m(vil
0a acide- de la fase m(vil1
8 3nfluencia el estado i(nico de la *rotena 8 Controla la ioni-aci(n de la su*erficie silanol 8 7orma *ares i(nicos con la -ona cati(nica de la *rotena 8 7avorece la e2*osici(n de -onas hidrof(bicas de la *rotena

Cromatograma de fase reversa

"# a 80

2"5

40 AcN ($) 0 0 20 Tiempo de %etencin (min) 40

460C de 7ase Beversa

Se*araci(n eficiente aNn con concentraciones altas de *rotenas :aCo ruido de fondo Solventes voltiles 7cil formulaci(n de la fase m(vil Be*roducibilidad de gradientes.

Diagrama del sistema 460C

Termostato de la columna

Celda Microbore Columna Celda 5naltica Celda 6re*arativa

ManeCador de muestras ManeCador de solvente

460C P5TEBS modelo antiguo

460C P5TEBS

Cromatgrafo de Gases

6rinci*ales com*onentes
;as de acarreo Controladores de fluCo 3n,ectores Columnas Detectores Sistema de datos

Gas de acarreo
Con ciertos ti*os de columnas , detectores se re+uiere el uso de un gas de com*lemento en el detector (Qmake% u*R'. El Qmake%u*R es un gas de arrastre adicionado al efluente de la columna antes de +ue *ase al detector. El sistema del gas *ortador *or lo general contiene uno o varios tamices con el obCeto de eliminar humedad hidrocarburos , o2geno. 0os caudales utili-ados en las columnas em*acadas oscila entre $? , &= m0Dmin , de ! a $ m0Dmin en las ca*ilares.