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CONSERVACIN CULTIVOS

DE

PARA

LA

BIOTECNOLOGA LA INDUSTRIA

Claudio Voget

Porque y para que conservar los cultivos ?


El cultivo (cepa microbiana o viral, linea celular, etc), es el elemento vital de la investigacin o produccin industrial Conservar implica mantener la pureza, viabilidad y propiedades genticas del cultivo durante un determinado perodo de tiempo Consecuencias de una adecuada conservacin: estabilidad de las cepas de produccin, reproducibilidad de la investigacin. Reposicin

Los tres objetivos de la conservacin:

1.-Mantenimiento del cultivo puro (PUREZA) 2.-Que este vivo (VIABILIDAD) 3.-gentica estable (ESTABILIDAD)

Conservacin de cultivos
Espacio fsico e infraestrutura Personal capacitado Recursos econmicos
Inversin

Potencial limitacin de los mtodos para conservar

Dao econmico Prdida del cultivo

Historia y evolucin de las tcnicas de conservacin (1)


1677 van Leewenhoek (Holanda): animalculos en agua y cerveza 1830 Cagniard-Latour (Francia): alcohol es producido por bacterias 1860 Pasteur (Francia): fermentacin = microorganismos. Emplea como medios slidos, papa y meln 1870 O. Brefeld emplea gelatina para solidificar los medios. Describe el cultivo de P. Glaucum (cultivo monosprico micelio conidios) 1881 Loeffler caldo nutritivo, Koch le incorpora agar (Mrs. Hesse) 1890 Hansen desarrolla la tcnica del cultivo puro con levaduras 1900 Cultivos puros de bacterias y levaduras de mantienen en medios slidos a base de caldo nutritivo y extracto de malta y se propagan peridicamente. Se requiere conservacin a largo plazo para preservar las caractersticas de los cultivos

Historia y evolucin de las tcnicas de conservacin (2)


1907 Will preserva levaduras en 10 % sacarosa durante 8 aos, pero hay prdida de actividad 1909-1911 Shackel; Hammer: primeros mtodos de liofilizacin para bacterias y virus, empleo de suero y leche como protectores 1914 Lumiere y Cherrotier conserva cultivos de Gonococcus bajo una capa de parafina lquida, el mtodo es perfeccionado por Morton y Pulski (1938) 1945-1950 La produccin industrial de antibiticos estimula el desarrollo de nuevas tcnicas. Liofilizacin, crio-conservacin, adsorcin en suelo, etc; permite el mantenimiento de cultivos por 10 o 20 aos. 1950 Se descubre el efecto crioprotector de varios compuestos: glicerol, dimetilsulfxido, sacarosa 1958 Sakane desarrolla la tcnica para el secado desde el estado lquido (L-drying )

Historia y evolucin de las colecciones de microorganismos


1890 Frantisek Kral genera la primera coleccin de bacterias y hongos en Praga. Cepas de Mycobacterium (Koch). Cierra en 1911. Se pierden las cepas

Desarrollo de colecciones privadas 1906 Se publica el primer catlogo de cepas de hongos de la International Botany Association (Holland). Es el antecesor del CBS (Centraal Bureau voor Schimmelcultures) 1911 Coleccin de bacterias en el National History Museum of New York City. Es el antecesor del ATCC (American Type Culture Collection) fundado en 1925 1944 Takeda Chemical Industries, Ltd. funda el Institute for Aerial Fermentation para aislar, conservar y distribuir microorganismos, es el antecesor del Institute for Fermentation (IFO, Osaka) 2003 23 instituciones internacionales autorizadas para recibir material biolgico con una patente de aplicacin (Tratado de Budapest 1991)

Potenciales ventajas del depsito de material biolgico


Patentamiento
Conveniencia centralizado logstica del almacenamiento

Seguridad de abastecimiento del material ante prdidas eventuales


Adecuada informacin de los riesgos ambientales y para la salud Seguridad en la conservacin

Esquema del proceso de conservacin y sus etapas crticas

Aislamiento primario

Microorganismo viable (gentica/fenotpo)

Reactivacin

cultivo

Almacenamiento

Tipo de propgulo Estado fisiolgico

Proceso de conservacin

Mtodos de conservacin de cultivos


1. con crecimiento
transferencia seriada

2. con metabolismo limitado


agua destilada bajo aceite mineral (control por O2)

3. con metabolismo detenido


3.1 Congelamiento (crioconservacin) 3.2 Deshidratacin
L-drying: secado desde la fase lquida,
silicagel, celulosa (papel), suelo, perlas de porcelana

Liofilizacin (freeze-drying)

CRIOCONSERVACIN
Crioconservacin es la conservacin de material biolgico a muy bajas temperaturas Rango -20 C a -196 C (nitrgeno lquido)
El nitrgeno lquido es la temperatura

prctica mas baja disponible. A la temperatura de equilibrio, la difusin molecular es extremadamente lenta y la probablilidad de que ocurran reacciones qumicas es prcticamente nula

CRIOINJURIA
El proceso de congelamiento y descongelamiento produce cambios en las cluas que pueden resultar letales Los procesos perjudiciales son: formacin de cristales de hielo, exosmsis, aumento de la solubilidad de gases, deshidratacin, aumento de la concentracin de osmolitos, disminucin del pH,

alteraciones

de

la

actividad

enzimtica,

acumulacin

de

metabolitos, incremento del contacto entre molculas, ruptura de puentes de H, distorsin de macromolculas, solidificacin, prdidad de la integridad de membranas, ruptura de emulsiones, etc La formacin de hielo intra o extracelular es quizs el evento mas crtico de la crioinjuria.

INJURIA POR CONGELAMIENTO


Congelamiento lento (efecto soluto) exosmsis
Hielo extracelular

shrinkage (efecto soluto)

Congelamiento rpido ( efecto hielo )

Hielo intracelular

Dao mecnico

CRIOPROTECCIN
Control de la velocidad de enfriamiento
Balance ptimo entre el efecto soluto y la formacin e hielo. En la prctica es aceptable 10 C/min. El descongelamiento debe ser lo mas rpido posible

Incorporacin de crioprotectores (CPs)


CPs que permean la pared y membrana celular

Me2SO ( Tp < 30 min), Glicerol, Metanol


Cps que permean la pared pero no la membrana mono y disacridos, aminocidos, polmeros de bajo PM(PEG 600-1000) Cps no permeantes Polmeros de alto PM: protenas, polisacridos, PVP

CRIOPROTECCIN
El tipo de proteccin que ejerce el CPs depende de su permeabilidad

Todos los CPs son altamente hidroflicos


CPs que permean totalmente ligan agua intracelular y reducen el efecto soluto

CPs semipermeables forman entre la pared y la membrana celular una capa que proteje la clula del dao mecnico CPs no permeables se adorben en la superficie celular incrementando la viscosidad local lo cual manteniendo el hielo en forma amorfa evitando dao mecnico

Empleo de CPs en criopreservacin Frecuencia de uso de CPs


Virus: Me2SO, Suero sanguneo, Sacarosa Glicerol Bacterias: Me2SO, Suero sanguneo, Sacarosa, Glicerol, leche descremada Hongos: Me2SO, Glicerol Algas: Me2SO, metanol, Glicerol, PVP Protozoarios: Me2SO, Suero sanguneo, Glicerol, Sangre desfibrinada

Rango de concentraciones de CPs


Me2SO: 1-32 % (media 10 %) Glicerol: 5-50 % Sacarosa: 1-68 % (media 10 %) Metanol: 2-10 % (media 5 %)

Tiempos de contacto CPs-clula:


Glicerol, Metanol, Me2SO : 10-60 min a 0-10C

CONSERVACIN POR DESHIDRATACIN


Este mtodo implica la remocin de agua de las clulas (humedad final tpica: 0.06-5.0 % de agua). La deshidratacin puede llevarse a cabo desde la fase lquida (L-drying) o por sublimacin desde el estado congelado (liofilizacin) Las prdida de viabilidad durante la deshidratacin es atribuida a alteraciones de la membrana celular. principalmente

Las clulas deshidratadas son susceptibles al deterioro causado por oxgeno

El deterioro de las clulas durante la deshidratacin puede ser controlado por el agregado de aditivos. Algunos forman una matriz amorfa que dispersa los componentes txicos que la clula puede liberar durante el secado. Otro protectores interactan con las membranas, estabilizando su estructura en el estado anhidro
Los aditivos mas comunes son: leche descremada, aminocidos (glutamato) y azcares (sacarosa, trealosa)

Principios de la liofilizacin
muestra + protectores en ampollas
vaco 30-60 militorrs

manifold
-70 C - 5 C

trampa de agua congelamiento etilenglicol + hielo seco (- 40 C) etanol + hielo seco (-70 C)

Bomba de vaco de aceite

La muestra colocada en una ampolla estril con un plug de algodn, se congela entre - 40 C y -70 C. Una vez colocada la muestra en el manifold del equipo se comienza con el vaco y se retira el enfriamiento. La temperatuyra sube hasta -5 C. A esta temperatura y con un vaco entre 30 y 60 militorrs, el secado es rpido. El tiempo es variable y depende del volumen de muestra. Al finalizar el proceso se sella la ampolla al vaco

L-Drying
Impregnacin en soporte

Muestra

Secado sobre silicagel

perlas de porcelana, papel de filtro, suelo

Preservacin en suelo (sandy loam) para microorganismos filamentosos


Secar suelo 6 hs a 150 C Tamizar suelo seco mesh 10 y 20. Conservar en recipiente tapados Colocar en tubos Pyrex de 13 x 100 mm suelo seco tamizado hasta una altura de 20 mm y tapar con plug de algodn recubierto de gasa Autoclar 60 min 3 das consecutivos y secar Incorporar 1 ml de suspensin de esporos en agua ( no emplear caldo de cultivo) Secar a temp ambiente (24 C) un mes Conservar en fro

Consideraciones para la preservacin de cultivos


Debe definirse claramente el medio de cultivo y el tipo de agua (destilada, deionizada, corriente) empleados. Tener en cuenta el tipo de cultivo (agarizado, lquido, slido), el estado fisiolgico de las clulas al momento de la cosecha (cultivos lquidos cosechados en fase estacionaria suelen ser mas resistentes que los de fase logartmica), si se emplean clulas con medio lavadas. Determinar si el agente protector es txico.

Definir condiciones de proceso: concentracin de clulas, tiempo de secado, agregado de protectores


En procesos industriales la viabilidad no es lo nico importante. La cepa debe mantener sus propiedades productivas. Desarrollar un test de produccin o bioensayo Durante la recuperacin de la especie conservada deben determinarse: viabilidad, pureza, morfologa, formacin de producto, rasgos recombinates (plsmidos, resistencia a antibiticos, etc).

Comparacin de algunos mtodos de preservacin


Mtodo Almacenamiento (aos)
0.5-2

Ventajas
Simple, bajo costo, equipamiento requerido bajo bajo costo, equipamiento requerido bajo Equipamiento requerido bajo, buena estabilidad gentica Preparacin rpida, buena estabilidad gentica Bajo riesgo de contaminacin, buena a regular estabilidad gentica Simple , bajo costo, bajo equipamiento requerido Simple , bajo costo, bajo equipamiento requerido

Desventajas
Secado del agar, baja estabilidad gentica, riesgo contaminacin
trabajo moderado, baja estabilidad gentica Requiere protectores, Alto costo de freezer (-80C). Clulas pueden ser sensibles al O2 Suministro regular de N lquido Alto costo de equipamiento

Agar

Aceite mineral

2-20

Congelamiento

4-5

N lquido

infinito

Liofilizacin

15-20

Agua L-drying

1-5 3-10

Estabilidad gentica regular estabilidad gentica?