RECUENTO CELULAR MANUAL Y AUTOMATIZADO

LIC. TM Ronald Luis Len Soto

Los recuentos celulares son una serie de procedimientos que tiene por objeto determinar el numero de cada uno de los tipos celulares
Todos los recuentos constan de 3 fases
Dilucin de sangre Computo del numero de clulas Calculo del numero de clulas en 1mm3 de sangre

Recuento Manual

RECUENTO LEUCOCITARIO

La sangre anticoagulada se deposita en un lquido que permite evidenciar los leucocitos, mantenindolos visibles, mientras que los eritrocitos son hemolizados. El recuento del nmero de leucocitos o glbulos blancos se expresa por mm3

Equipos
Microscopio.

Hemocitmetro (Cmara de Neubauer).

Pipeta de glbulos blancos (De Thoma)

Pipeta Automtica

Reactivos
cido actico glacial 2,0 mL Solucin acuosa de violeta de genciana al 1% 1,0 mL Agua destilada c.s.p. 100 mL

Procedimiento
Mezclar los reactivos y guardar en frasco mbar en lugar fresco.

SOLUCIN DE TURK

Cmara de Neubauer

Consiste en una placa gruesa de cristal en forma de porta, cuya porcin central est dividida en tres bandas perpendiculares al eje longitudinal de la cmara.
De ellas, las dos laterales se hallan sobreelevadas 01 mm con respecto a la central, y en esta ltima hay grabado un retculo cuadrangular.

La banda central puede estar, a su vez, subdividida en dos semibandas idnticas y separadas por un surco paralelo al eje longitudinal de la banda.
En cada una de estas dos semibandas hay grabado un retculo idntico.

Cada cuadrcula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandes. Cada uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie, que se subdivide a su vez en 16 cuadrados medianos. El cuadrado grande central se divide en 25 cuadrados pequeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos. Cada cuadrado pequeo mide 0,2 mm de lado (0,04 mm2 de superficie), y cada cuadradito mide 0,05 mm de lado

3 mm

1mm2

1 5 9 13

2 6 10 14

3 7 11 15

4 8 12 16

Procedimiento

Aspirar la sangre con la pipeta de glbulos blancos hasta la marca de 0,5 y a limpiar la punta con papel absorbente. Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucin de Turk y absorber hasta la marca de 11 (no debe haber burbujas). Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente. Monte la laminilla de vidrio en la cmara para recuento que debe estar limpia y seca. Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocar una gota pequea de esta solucin en la cmara. Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las clulas se sedimenten.

Cuando se usa la pipeta automtica, se toma 20 mL (0,02 mL) de sangre total anticoagulada y se diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucin de Turk (aqu tenemos una dilucin 1:20). Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angulares

RECUENTO DE GLBULOS ROJOS

Equipos y reactivos
Microscopio. Hemocitmetro (cmara de Neubauer). Pipeta de glbulos rojos (De Thoma) o pipeta automtica (de 0-100 mL). Diluyente de glbulos rojos:
Cloruro de Sodio al 0,9% Diluyente de Hayem

Reactivos
Bicloruro de mercurio 0,5 g Sulfato de sodio 5,0 g Cloruro de sodio 1,0 g Agua destilada 200 mL

Procedimiento
Se mezclan todos los reactivos y se guarda en frasco de vidrio en lugar fresco.

SOLUCIN DE HAYEM

procedimiento

Llenar la pipeta de glbulos rojos con sangre hasta la marca de 0,5 para realizar una dilucin de 1/200, y si se carga hasta 1, la dilucin ser 1/100. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente. Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem) y llenar de lquido de dilucin hasta la marca de 101. Mesclar bien Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota pequea cerca de un extremo de la cmara para que por capilaridad se llene exactamente. Hacer el recuento con objetivo de 40x

Se puede realizar con la pipeta automtica, se toma 20 ul (0,02mL) de sangre total con 4 mL de solucin de Hayem (aqu se tiene una dilucin de 1:200). Se deja reposar aproximadamente 5 minutos y se procede a cargar la cmara con la misma pipeta usando un nuevo tip. Dejar en reposo por 3 minutos.

Recuento de Plaquetas

Se realiza
En un microscopio de contraste de fases Un microscopio convencional.

Materiales
Hemocitmetro o cmara de Neubauer. Solucin de procana (Anexo A). Pipetas automticas de 100 a 1000 mL y 0 a 100 mL. Cmara hmeda. Tubos de plstico de 12 x 75. Microscopio convencional.

Recuento en Cmara

Mezclar bien la muestra de sangre obtenida con EDTA. Hacer una dilucin de 20 uL de sangre total con 380 uL de solucin de procana en un tubo de plstico de 12 x 75 (dilucin 1/20). Dejar en reposo por 15 minutos en una gradilla. De esta dilucin, llenar en cmara de Neubauer. Dejar en reposo por 15 minutos en cmara hmeda. Enfocar con objetivo de 40x y contar las plaquetas en el retculo central de 1 mm2 cuadrado. Mtodo

Resultados

Valores de referencia 150 000 - 450 000 plaquetas/mm3

Se cuentan 10 campos con objetivo de 100x y se multiplica por 1000 que es la

Valores de referencia
150 000 - 450 000 plaquetas/mm3

Recuento en Lmina

Recuento Automatizado

La automatizacin proporciona mayor exactitud y precisin que los mtodos manuales. Resultados en menos Tiempo Muchos mas parmetros que los habituales Menor volumen de sangre Mayor rendimiento Diagnstico y Tratamiento ms oportuno de la enfermedad.

Utilizan sobre todo dos principios bsicos:

La Impedancia Electrnica, o la Resistencia a la Corriente Continua (CC) de Bajo Voltaje Radiofrecuencia RF, o corriente electromagntica de alto voltaje La Dispersin ptica

Principios Generales del Equipamiento

La Impedancia Electrnica, o la Resistencia a la Corriente Continua (CC) de Bajo Voltaje

Desarrollada por Wallace Coulter 1950 Metodologa utilizada con mayor frecuencia Se basa en la deteccin y la medicin de cambios en la resistencia elctrica producida por las clulas cuando atraviesan una apertura pequea.

Las clulas suspendidas en un diluyente conductor de la electricidad, como solucin fisiolgica, se arrastran a travs de una apertura (orificio) en un tubo de vidrio. En la cmara de recuento, o ensamblaje del transductor, se aplica la corriente elctrica de baja frecuencia entre un electrodo externo (suspendido en la dilucin celular) y uno interno (alojado dentro del tubo de apertura). La resistencia elctrica entre los dos electrodos, o la impedancia en la corriente, se produce a medida que las clulas atraviesan la apertura, que tiene sensores y produce pulsos de voltaje medibles

El nmero de pulsos es proporcional al nmero de clulas contadas. El tamao del pulso de voltaje es directamente proporcional al tamao de la clula Los datos se trazan en un grfico de distribucin de frecuencia, o histograma de distribucin de tamao

El Tamao de la Apertura:
La Acumulacin de protenas
Recuentos celulares ms bajos con volmenes celulares con elevaciones falsas.

El pasaje coincidente de ms de una clula

La orientacin de la clula en el centro de la apertura y la capacidad de deformacin de los eritrocitos La recirculacin de las clulas hacia atrs
Recuentos celulares con elevaciones falsas volmenes celulares aumentados falsos y recuentos celulares disminuidos falsos.

Factores que Afectan la Medicin

La impedancia de CC de bajo voltaje puede utilizarse junto con la resistencia de RF, o corriente electromagntica de alto voltaje El volumen total de la clula es proporcional al cambio en la corriente continua, la densidad interna celular (volumen nuclear, etc.) es proporcional al tamao del pulso o el cambio en la seal de RF. La conductividad, medida por esta sonda electromagntica de alta frecuencia, se atena por la relacin ncleo-citoplasma, la densidad nuclear y la granulacin citoplasmtica. RF, o corriente Radiofrecuencia

Electromagntica de alto voltaje

El uso de varios mtodos en un equipo dado para la determinacin de por lo menos dos propiedades celulares permite la separacin diferencial de los leucocitos en cinco componentes (neutrfilos, linfocitos, monocitos, eosinfilos y basfilos)

Por lo Tanto

En los sistemas de dispersin ptica (citmetros de flujo) una masa de muestra (centrada en forma hidrodinmica) se dirige por un canal de cuarzo que genera un flujo celular (de a una por vez), sobre el que impacta la luz tambin centrada. La fuente suele ser de luz halgena, de tungsteno, o laser de helio y nen. Esto permite la deteccin de interferencia en el haz de luz y posibilita su cuantificacin, de modo tal de dar valores que caracterizarn a cada tipo celular. Este sistema de dispersin ptica permite identifica leucocitos, plaquetas y eritrocitos.

Dispersin Optica

A medida que las clulas circulan por la regin sensora, la luz impacta sobre ellas y se interrumpe el flujo lumnico unidireccional. La luz se dispersa en todas direcciones con ngulos de desvo relativos a las caractersticas (densidad y tamao) del cuerpo golpeado. Se generan a su vez procesos de absorcin, difraccin y de dispersin lumnica

Por lo Tanto

Principales Instrumentos para el Recuento de Clulas

Abbott Laboratories ABX Diagnostics Bayer Diagnostics Beckman Coulter, Inc Sysmex Corporation.

Son Fabricados

Los analizadores hemticos tienen algunos componentes bsicos comunes, como los sistemas:
Hidrulicos Neumticos Elctricos

Componentes

Sistema Hidrulico
La unidad de aspiracin Los dispensadores Los diluyentes Las cmaras de mezclado Los baos de apertura El flujo de clulas o ambos Un hemoglobinmetro.

Componentes

El sistema Neumtico
Se incluye el sistema de vaco y las presiones requeridas para que operen las vlvulas y transporten la muestra a travs del sistema hidrulico

El sistema elctrico
controla las secuencias operacionales del sistema total e incluye analizadores electrnicos y circuitos computarizados para el procesamiento de los datos generados

Componentes

El Grado de Automatizacin.
Depende de cmo se manejen las muestras

Los equipos varan desde

Los Analizadores "paso a paso" SemiAutomatizado Los Sistemas fciles de usar con capacidad de "carga frontend Totalmente Automatizado

SemiAutomatizado

Totalmente Automatizado

Las funciones de la computadora tambin varan

Los software pueden incluir
Inicio y Apagado Automticos Autocontroles internos de diagnstico Cierto grado de mantenimiento Control de calidad (QC), con revisin automtica de datos del QC Clculos Grficos Promedios Dinmicos Almacenamiento de Archivos del QC Almacenamiento y Recuperacin de datos del Paciente Sealizacin de los valores de Emergencia o Crticos Sistema de informacin del laboratorio o del hospital

Equipos Coulter
Beckman Coulter, lnc

La Serie ONIX
Anlisis completo de eritrocitos, plaquetas y leucocitos con recuento diferencial de tres componentes

MAXM y STKS
RCS con recuento diferencial de cinco componentes y anlisis de Reticulocitos

GEN-S System
Anlisis de Reticulocitos en lnea Automatizado por completo. Realizar recuento de CD4 y CD8

Los Recuentos de Eritrocitos y Leucocitos, y la determinacin de Hemoglobina (HGB) se miden en forma directa El VCM es un promedio tomado de los datos de distribucin de tamao. El Hto, la HbCM, la CHbCM, EL RDW se calculan

Recuento de Hemates y Plaquetas

Por la Impedancia Elctrica Las partculas entre 2 y 20 fL se cuentan como plaquetas Las partculas de ms de 36 fL, como Eritrocitos

Determinacin de la concentracin de la Hemoglobina

Despus de que se completan los ciclos de recuento, la dilucin de leucocitos pasa al hemoglobinmetro para la determinacin de la concentracin de la hemoglobina

Basado en su Impedancia
En Tres Componentes
En Linfocitos Clulas Mononucleares Granulocitos

Entre 35 y 90 fL Linfocitos " Entre 90 y 160 fL Mononucleares" (monocitos, blastos, granulocitos inmaduros y linfocitos atpicos) Entre 160 y 450 fL Los Granulocitos maduros "

Recuento de Leucocitos

Usa Tecnologa VCS

La CC de baja frecuencia Sonda electromagntica de alta frecuencia Luz lser monocromtico En cada muestra se analizan ms de 8.000 Recuento leucocitos Diferencial

Leucocitos

de

VOLUME: La CC de baja frecuencia mide el tamao

CONDUCTIVIT Y: sonda electromagntic a de alta frecuencia mide la conductividad, un indicador del contenido interno celular

SCATTER: Cada clula tambin se analiza con luz lser monocromtic o que revela informacin sobre la superficie celular como su estructura, forma y reflectividad

Equipamiento Sysmex
Sysmex Corporation, antes TOA Medical Electronics, Co., Ltd ahora ROCHE

El KX-21 pequeo y El K-4500

Proporcionan anlisis completos de eritrocitos, plaquetas y leucocitos con recuento diferencial de tres componentes

El SF-3000 ms grande y el SE-9000

Realizan un recuento diferencial de cinco componentes

Los sistemas ms nuevos que proporcionan adems un recuento de Reticulocitos El Sysmex XE-2100
Tiene citometra de flujo fluorescente agregada para aumentar la capacidad de anlisis celular del equipo. permite el recuento directo

Los Recuentos de Leucocitos Eritrocitos La Determinacin de Hemoglobina (Hb) El Hematocrito (Hto) Las Plaquetas (PL)

Se calculan de forma directa

Recuento de Leucocitos, Eritrocitos y Plaquetas

Mtodo de Impedancia (deteccin de CC) para el recuento y la determinacin del tamao celular Usando umbrales de Discriminacin

El hematocrito es entonces la altura del pulso acumulativa del eritrocito y se considera un volumen verdadero del porcentaje relativo de Eritrocitos La hemoglobina se convierte a Metahemoglobina q se convertirse en una molcula hemicromtica y se mide como absor - bancia a 555 nm.

En el microprocesador se calculan los siguientes ndices, que utilizan parmetros medidos en forma directa o derivados:
VCM HbCM CHbCM RDW-SD RDW-CV VPM Plaquetocrito (Pto).

Utiliza cuatro cmaras de deteccin las cmaras DIFF, IMl, Ea y BASO para Recuento diferencial de cinco componentes Los Leucocitos se analizan con mtodo de deteccin CC y RF La cmara DIFF permite separar los leucocitos en Linfocitos, Monocitos y Granulocitos En la cmara IMI establecer "informacin sobre (leucocitos) inmaduros a partir de los Granulocitos En las cmaras Ea y Baso se analizan y cuentan los Eosinofilos y Basofilo Por Diferencia se calcula los Neutrofilos

Equipamiento CELLDYN
Abbott Laboratories

El CELLDYN 1700 ms pequeo

Proporciona anlisis completo de eritrocitos, plaquetas y leucocito s con recuento diferencial de los tres componentes;

Los CELL-DYN ms grandes 3500R y 3700

Realizan un HC con recuento diferencial de cinco componentes y anlisis de reticulocitos

El CELL-DYN 4000 ms nuevo

Proporciona un anlisis de reticulocitos automatizado por completo

Usa la Impedancia para el Recuento celular Usa tres canales de medicin independientes para determinar el hemograma y el recuento diferencial Tiene un canal de impedancia adicional para determinar para control interno del recuento ptico de leucocitos primario Se consideran que los valores de leucocitos, eritrocitos, hemoglobina y plaquetas se miden en forma directa.

El VCM es obtenido de los datos de distribucin de su tamao. La Hemoglobina se mide en forma directa mediante el mtodo de cianhemoglobina El Hto, la HbCM y la CHbCM se calculan. La RDW, equivalente al coeficiente de variacin, es un valor relativo, derivado del histograma Otros ndices son el VPM y Pto

Los recuentos leucocitario y diferencial derivan del canal ptico que utiliza la separacin por dispersin polarizada con mltiples ngulos (M.A.P.S.S.)

Se utilizan varias combinaciones de estas cuatro mediciones para diferenciar y cuantificar las cinco subpoblaciones leucocitarias principales: neutrfilos, linfocitos, monocitos, eosinfilos y basfilos

Equipamiento Bayer (Siemmens)

Bayer Corporation

ADVIA 120
Los leucocitos, los eritrocitos, la hemoglobina y las plaquetas se miden en forma directa.

La HB se determina con el mtodo de cianmetahemoglobina El mtodo para Eritrocitos y PL utiliza mediciones de dispersin de la luz por citometra de flujo

Utilizan cuatro canales de medicin independientes para determinar el hemograma y el recuento diferencial:
Canal para eritrocitos y PL Canal para Hemoglobina Canal para Peroxidasa (PEROX) Canal para Lobularidad de Basfilos (BASO) para recuento Leuocitario y datos diferenciales.

Angulo bajo [2 a 3], se correlaciona con el volumen celular o e! tamao, Angulo alto [5 a 15] se correlaciona con la complejidad interna

El VCM y el VPM son la media del histograma del volumen eritrocitario y el histograma de las plaquetas El Hematocrito, la HbCM y la CHbCM se computan en forma matemtica a partir de los valores de eritrosis-tos, hemoglobina y VCM. La RDW se calcula como el CV del histograma de volumen eritrocitario La amplitud de distribucin de hemoglobina (HbDW), se calcula como la desviacin estrtdar del histograma de concentracin de la Hb eritrocitaria.

Los analizadores hemticos de Bayer determinan el recuento leucocitario total y diferencial de seis componentes (neutrfilos, linfocitos, monocitos, eosinfilos, basfilos y clulas no coloreadas grandes por citoqumica y citometra de flujo ptica, utilizando los canales PEROX y BASO

Canal de Peroxidasa (PEROX)

En el canal PEROX, los eritrocitos se lisan y los leucocitos se tien por su actividad de peroxidasa (PX)

Los Neutrfilos y los eosinfilos contienen la mxima cantidad de PX y un cmulo a la derecha del citograma Los Monocitos adquieren una coloracin dbil y por consiguiente el cmulo se observa en la regin media del citograma. Los linfocitos, los basfilos y los LVC (que abarca los linfocitos atpicos y los blastos) no contienen PX y aparecen en la izquierda del citograma

Canal de Lobularidad de Basfilos (BASO)

En el canal BASO las clulas se tratan con un re activo, Los basfilos tienen una resistencia particular a la lisis, mientras que los eritrocitos y las plaquetas se lisan y otros leucocitos (no basfilos) se despojan de su citoplasma

Por diferencia se calculan el porcentaje total de leucocitos

Recuento Automatizado de Reticulocitos

El recuento de Reticulocitos fue el ltimo de los procedimientos manuales de conteo celular en automatizarse La imprecisin y la inexactitud del recuento manual de Reticulocitos se deben a numerosos factores, como:

Variabilidad de la coloracin Errores de distribucin en el porta objeto Errores estadsticos de muestreo Errores surgidos entre los observadores

Los analizadores automatizados de Reticulocitos pueden contar hasta 32.000 eritrocitos comparado con las 1.000 clulas del mtodo manual habitual. Equipos

Becton Dickinson FACS Culter EPICS Sysmex R-3S00, R-SOO y SE9S00/9000+RAM-1 Sistemas CELL-DYN 3500R, 3700 Y 4000 Coulter GEN-S, STKS Sistemas MAXM Sistemas Bayer ADVIA 120 Technicon H-3 RTC y RTX.

Todos estos analizadores evalan los Reticulocitos basados en la dispersin ptica o la fluorescencia despus de tratar los eritrocitos con colorantes fluorescentes o la coloracin del cido nucleico para teir el RNA residual en los reticulocitos.

Se Sintetizan los mtodos para la determinacin diferencial de los leucocitos en los mismos cuatro analizadores

Utilidad Clnica de los Equipos Automatizados en Hematologa

Mejoraron La disponibilidad, la exactitud y la utilidad clnica del Hg y el recuento leucocitario diferencial. Nuevos parmetros hematolgicos

La RDW CHb eritrocitaria VPM Recuento leucocitario diferencia Mayor Rendimiento en el Laboratorio Alerta de Hemates nucleados y plaquetas Agregadas Alarmas sobre patologas Leucocitaria e Eritrocitaria

Limitaciones Debidas a la Muestra

Incluye la presencia de factores como

Crioaglutininas
VCM aumentado (con frecuencia mayor que 130 fL) Recuentos de Eritrocitos notablement disminuidos CHbCM aumentada (con frecuencia mayor que 40 gldL).

Ictericia Lipemia

Tiempo de procesamiento

Afectan las mediciones de la Hb y los ndices relacionados Aumento de la fragilidad de los leucocitos Aumento del tamao celular Posible lisis Eritrocitaria Alteracin de las plaquetas

Anticoagulante usado y cantidad

Limitaciones del Equipo

Incapacidad de un instrumento para distinguir las clulas de otras partculas o fragmentos de clulas del mismo tamao de manera confiable Por ejemplo Pueden contarse los fragmentos celulares como plaquetas Los esquistocitos o eritrocitos pequeos pueden interferir en el recuento de las plaquetas Los cmulos de plaquetas ms grandes pueden contarse como leucocitos Los Micromegacariocitos pueden contarse como eritrocitos nucleados o leucocitos Los Eritrocitos que contienen alguna variante de hemoglobina como S o C a menudo son

CALIBRACION

Puede lograrse con el uso apropiado de mtodos de referencia, materiales de referencia, calibradores preparados en forma comercial o cualquier combinacin de ellos La calibracin debe realizarse en el momento de la instalacin inicial y debe verificarse al menos cada 6 meses Pueden requerirse calibraciones peridicas despus de reparaciones importantes del equipo que requieren alineacin ptica o 'reemplazo de partes.