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CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PERFOMANCE

1. CONCEPTO Es un tipo de cromatogrfica que utiliza columnas de dimetro muy reducido, ( 2 mm ), rellenas de materiales especiales pulverulentos, cuyas partculas tienen un tamao no mayor de 30 40 m . Este tipo de columna es muy eficaz, pero ofrece una gran resistencia al flujo de la fase mvil, o sea una gran cada de presin . Es necesario emplear sistemas de bombeo de alta presin , hasta 400 atm , que hagan fluir la fase mvil a una velocidad razonable a travs de la columna .

2. CARACTERSTICAS > Elevada sensibilidad > Elevada aplicabilidad > Permite realizar anlisis cuantitativos exactos. > Adecuada para la separacin de especies termolbiles no voltiles.

3. INSTRUMENTACIN - Dispositivo de solventes. - Sistemas de bombeo - Sistemas de inyeccin - Columna - Horno termostatizado - Detector - Registrador de datos.

Componentes de un cromatgrafo HPLC

3.1. DISPOSITIVO DE DISOLVENTES * Frascos de vidrio inerte. * Tubos de tefln con filtro. * Sistemas de desgasificacin. (N2, He ) * Disolventes ( excentos de partculas )

* Filtracin a vaco de la fase mvil.


CARACTERSTICAS DE LOS SOLVENTES - Elevada pureza y estabilidad. - Baja viscosidad - Buen disolvente de la muestra. - No degradar o disolver la fase estacionaria.

- Compatible con el detector empleado. - Buena disponibilidad comercial y buen precio.

MODO DE TRABAJO : ELUCIN ISOCRTICA : Composicin de la fase mvil constante .

EN GRADIENTE : Composicin de la fase mvil variable en funcin del tiempo,

3.2. SISTEMA DE BOMBEO Sistema necesario para conseguir una presin y velocidad de flujo de la fase mvil regular durante el proceso analtico.

* Componentes resistentes a la corrosin por disolventes.


* Capz de generar presiones por encima de 6000 psi. * Flujo libre de pulsaciones.

Caudales reproducibles en el intervalo 0,1 10 mL / min.


* Fcil de desmontar y reparar.

3.3. COLUMNA CROMATOGRFICA > Elemento clave del sistema. > Tubo de acero inoxidable.

> Su capacidad de separacin viene marcada por :


Propiedades qumicas : Estabilidad qumica y sensibilidad ( t R ) Propiedades fsicas : velocidad. Eficiencia y

Dimensiones : Longitud : 10 30 cm y dimetro interno: 4 10 mm.

Figura

Columna cromtogrfica

SISTEMAS DE PROTECCIN Para eliminar partculas en suspensin. PRE-FILTROS : * Para el disolvente. * Para la columna. PRE-COLUMNAS * De columna 3.4. HORNOS TERMOSTATIZADOS > Lo ms habitual es trabajar a temperatura ambiente. > En aplicaciones especiales: - Se trabaja a temperatura constante y controlada. - Alcanzan temperaturas hasta de 150 C. 3.5. DETECTORES Dispositivos que generan una seal elctrica proporcional a la cantidad de analito eludo. Miden la propiedad fsica de la fase mvil, la cul vara con la presencia de pequeas cantidades de analito .

CLASIFICACION * Universales : Generan seal para cualquier sustancia eluida. * Selectivos : Detectan sustancias con determinada propiedad fisicoqumica. * Especficos : Detectan sustancias que poseen determinado elemento o grupo funcional en sus estructuras. DETECTORES PARA HPLC En la cromatografa de lquidos no hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables , como lo son el de ionizacin de llama y de conductividad trmica, en la cromatografa de gases. Un detector en HPLC debe tener un volumen interno mnimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda.

TIPOS DE DETECTORES Son de dos tipos bsicos: - Detectores basados en una propiedad de elucin : Responden a una propiedad de la fase mvil ( ndice de refraccin , constante dielctrica, o la densidad ), que se modifica por la presencia de los analitos. - Detectores basados en una propiedad del soluto . Responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusin, no propias de la fase mvil.

DETECTOR DE INDICE DE REFRACCIN - Elucin isocrtica. - Dan respuesta a casi todos los salutos pero con baja sensibilidad. - Anlisis termostatizado,. Muy sensible a la variacin de temperatura .

DETECTOR DE ABSORBANCIA UV VISIBLE * El de mayor uso. * Vlido para la determinacin de sustancias que absorben radiacin UV Visible. * Lmparas de Deuterio, Xenon o Wolframio. * Longitud de onda : 190 - 900 nm.

DETECTOR DE FLUORESCENCIA - Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados fluorescentes. - Poseen alta sensibilidad. - No son interferidos por los solventes que no poseen naturaleza fluorescente.