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BIOLOGIA MOLECULAR
Solange Oliveira
OBJECTIVOS:
-Aprofundar os conhecimentos de biologia e gentica molecular, -Abordar as implicaes das descobertas da gentica molecular, relativas nomeadamente ao controlo da expresso gentica e replicao do DNA, na compreenso dos fenmenos celulares, quer em procariotas quer em eucariotas. -Abordagem das tcnicas de biologia molecular e bioinformtica, essenciais quer no estudo de questes genticas fundamentais, quer na engenharia gentica aplicada.
Contedo Programtico
Introduo. Questes, tcnicas experimentais. Aplicaes prticas em Engenharia Gentica e Biotecnologia.
Parte I
PERPETUAO do DNA
1. Genes e Cromossomas -Estrutura e superenrolamento do DNA. Cromatina, nucleossomas e histonas. -Organizao gentica em procariotas, eucariotas e vrus. Tipos de genes; operes; famlias multignicas; pseudogenes; DNA repetitivo. -Genomas: dimenso, organizao e nmero de genes -Genoma de mitocndrias e cloroplastos.
2. Replicao do DNA -Mecanismo geral: cadeia contnua e descontnua; direco de sntese. -Enzimas envolvidos: helicases, primases, topoisomerases, girases, polimerases de DNA e ligases. -Mecanismos de iniciao em molculas lineares e circulares (priming, crculo rolante, etc). Origens de replicao em procariotas, eucariotas e vrus. -Controlo da iniciao da replicao-metilao do DNA -Fidelidade e proofreading -Segregao. -Terminao; replicao de telmeros (telomerase) 3. Recombinao e transposio -Recombinao homloga e no homloga. RecA. -Elementos genticos mveis. Transposes e elementos IS (insertion sequences). Transposase e resolvase. -Retrovirus. 4. Mutao e reparao -Agentes mutagnicos e tipos de mutaes. Taxas de mutao -Reparao por exciso, recombinao e fotoreactivao
Parte II
EXPRESSO GENTICA
5. Transcrio -Incio: Promotores, enhancers e factores de transcrio -Polimerases de RNA de procariotas e eucariotas. -Funo e estrutura dos RNAs (mRNA, tRNA, rRNA e snRNA). -Elongao e terminao. -Processamento dos pr RNAs (splicing de intres, capping e poliadenilao). Splicing alternativo. Auto-splicing-ribozimas. Transporte dos RNAs. -Regulao da transcrio em procariotas e eucariotas: regulao positiva e negativa (opero da lactose, arabinose e triptofano). Regulao por controlo da terminao.
6. Traduo -Cdigo gentico. Cdigos genticos alterados. Wobbling no reconhecimento codoanticodo. -Sintetases de aminoacil-tRNA. -Ribossomas: estrutura e subunidades. -Iniciao, elongao e terminao da sntese proteica. -Proofreading na traduo
7. Regulao da expresso gentica -Iniciao; estabilidade/degradao dos mRNAs. -Modificaes ps-traducionais. Chaperoninas no folding das protenas. -Transporte e direccionamento das protenas. Sequncias leader, sinal e ncora. -Degradao das protenas nos proteasomes
Parte III
TCNICAS E APLICAES
8. Mtodos analticos e preparativos em biologia molecular -Centrifugao - Electroforese (agarose e poliacrilamida) -Cromatografia 9. Engenharia Gentica e aplicaes -Clonagem de genes. Extraco de DNAs. Enzimas de restrio e mapas de restrio. Vectores de clonagem (plasmdeos, fagos, cosmdeos, YACs). Ttransformao de bactrias. Bibliotecas genmicas e de cDNA. PCR. Marcao de sondas de DNA. Seleco de clone especfico. Hibridao-Southern e Northern. -Sequenciao de DNA. Sequnciao automtica e manual. -Bioinformtica Anlise de sequncias: pesquisa de motivos, homologias, alinhamento de sequncias e relaes filogenticas -Expresso de genes. Vectores de expresso. Mutagnese dirigida. Protenas recombinantes. Transcrio e traduo in vitro. -Organismos transgnicos (animais e plantas); mtodos para introduzir DNA em clulas animais e vegetais. -Terapia gentica
AULAS PRTICAS Bloco 1-Anlise de artigos cientficos selecionados Tcnicas de biologia molecular-fundamentos e aplicaes
Bloco 2-Prticas Laboratoriais Avaliao de diversidade gentica em bactrias A) Extraco de DNA bacteriano B) Amplificao de gene por PCR C) Anlise do produto amplificado por electroforese em gel de agarose D) Digesto com enzimas de restrio E) Anlise por electroforese
BIBLIOGRAFIA
-Azevedo, C. e Sunkel, C. (2012) Biologia Celular e Molecular 5 edio, Lidel -Lewin, B. (2009) Genes X, 9 edio, Oxford University Press, Oxford -Hartl, D., Jones, E. (2009) Genetics. Analysis of Genes and Genomes 7th Ed., Jones and Bartlett Publishers, Sudbury
-Brown, T.A. (2006) Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. 5 edio, Blackwell Science Inc, London
-Watson J. D. et al (2008) Molecular Biology of the Gene 6th edition Menlo Park, Calif: Benjamin/Cummings -Brown, T. A. (2002) Genomes, 2 edio, Wiley-Liss -Griffiths, A., Gelbart, W., Miller, J., Lewontin, R.C., (2002) Modern Genetic Analysis 2 edio, Ed. W. H. Freeman, New York -Oliveira, S. (2000) Introduo Biologia Molecular- Textos de apoio da disciplina de Gentica, Departamento de Biologia, Universidade de vora -Lodish et al. (2000) Molecular http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21475/ and Cell Biology 4rd edition, W.H. Freeman
Base geral de artigos cientficos: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/advanced -Glossrio de Biologia Molecular: http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/educ/dnapr/mbglossary/mbgloss.html -NCBI Bookshelf http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/advanced http://www.dnaftb.org/dnaftb/
http://nobelprize.org/educational_games/medicine/dna/sitemap.html
BIBLIOGRAFIA Bioinformtica: Acesso a bases de sequncias nucleotdicas e de aminocidos: http://srs.ebi.ac.uk/ Bases de genomas sequenciados:
-http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html
-http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/Genome/org.html Programas para anlise de sequncias:
PLANEAMENTO DAS AULAS Semana 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 (11-15 Fev) (18-22 Fev) (25 Fev-1 Mar) (4-8 Mar) (11-15 Mar) (18-22 Mar) (25-29 Mar) (2-5 Abr) (8-12 Abr) (15-19 Abr) (22-26 Abr)Qui Tericas Apresentao Genes e Genomas Genes e Genomas Replicao de genomas Replicao de genomas Mutaes e Reparao ----Frias---Transcrio Transcrio Traduo
-----------------
Prticas ----------Inscries---------Introduo Mtodos- Extraco de DNA e RNA Mtodos- Electroforese e Hibridao Mtodos-Clonagem, enzimas Mtodos-Vetores de clonagem/expresso ------Frias------Mtodos-PCR e derivadas Mtodos-Sequenciao Mtodos-Knockout , mutagnese Prtica Prtica Prtica Prtica Prtica-Bioinformtica Prtica-Bioinformtica
Atendimento dos alunos: Quartas 9-11H Lab. Microbiologia do Solo, Mitra Ou contactar ismo@uevora.pt
(29 Abr-3 Mai)Qua Controlo da Expresso (6-10 Mai) (13-17 Mai) (20-24 Mai) (27-31 Mai) ------1 Frequencia---Aplicaes Aplicaes Bioinformtica
Clula eucariota
Clula procariota
Neurospora
Arabidopsis
Caenorhabditis elegans
Replicao
-mutao -recombinao
Hereditariedade e variabilidade
DNA (gentipo)
Expresso gentica
1.transcrio DNA->RNA 2.traduo
Fentipo
Biodiversidade
Bactrias fossilizadas com 3.5 - 3.6 bilies de anos Bacteria, Archaea e Eucarya Maior diversidade gentica entre Bacteria e Archaea do que entre organismos multicelulares Plantas e animais so relacionadas mais proximamente do que metanobacteria e green sulfur bacteria
O Dogma Central O fluxo de informao gentica na direco DNA -> RNA -> Protena "dogma central " porque se julgava comum a todos os organismos. Contudo, nos vrus de RNA o fluxo de informao gentica comea do RNA
DNA Nucletidos
Dados experimentais que elucidaram a estrutura da molcula de DNA: -dimetro constante (purina-pirimidina) %G=%C %A=%T
- %(A+G)=%(T+C)
DNA
Estrutura da dupla hlice
James Watson e Francis Crick, 1953
Uma volta de 3.4 nm em 3.4 nm Distncia entre pares de bases 0.34 nm 10 pares por volta
Estrutura normal right-handed da dupla hlice de DNA, conhecida como forma B
Estrutura de DNA pode alterar-se para forma A quando em soluo com maior concentrao salina ou com alcool. (right handed mas tem volta de 2.3 nm e 11 pares de bases por volta) Outra estrutura de DNA a forma Z (left-handed, volta de 4.6 nm e 12 pares de bases por volta)
Genomas
Eucariotas
-Genoma Nuclear-Cromossomas
DNA codificante
Genes e Famlias de Genes
DNA no codificante
Pseudogenes
DNA repetitivo
Repeties em tandem Repeties espalhadas
-Genoma de Organitos
Cloroplastos Mitocndrias
Procariotas
-Cromossoma -Plasmdeos
Vrus
27 Fev 2008
Dimenso de genomas
Organismo Bos taurus (bovino) Homo sapiens Canis lupus familiaris (co) Mb 3000 3038 2400
3100
3500 180 2365 12 5 ~102 000
-Homo sapiens -Canis lupus familiaris -Bos taurus (bovine) -Cavia porcellus (domestic guinea pig) -Equus caballus (domestic horse) -Felis catus (cat) -Gorilla gorilla -Mus musculus (house mouse) -Oryctolagus cuniculus (European rabbit) - Pan troglodytes (chimpanzee) -Oryza sativa (arroz)
-deteco de genes associados a doenas/defeitos humanos ou animais -polimorfismos-variao gentica em populaes estimada pelas diferenas em padres de restrio herdados (RFLP)
Cromossomas humanos
Cariograma humano
Cada cromossoma contm uma nica molcula de DNA. 1 Mb = 1 milho de pares de bases
Cromossomas Humanos
Propriedades das bandas com colorao standard Giemsa
Stain strongly with dyes that bind preferentially Stain weakly with Giemsa and to AT-rich regions, such as Giemsa and Quinacrine Quinacrine May be comparatively AT-rich DNase insensitive Condense early during the cell cycle but replicate late Gene poor. Genes may be large because exons are often separated by very large introns LINE rich, but may be poor in Alu repeats May be comparatively GC-rich DNase sensitive Condense late during cell cycle but replicate early Gene rich. Genes are comparatively small because of close clustering of exons LINE poor, but may be enriched in Alu repeats
Cromossoma humano
Cromossomas
a) Fibra de cromatina de 30 nm est associada com protenas (topoisomerase II) para formar loops (75 kb). Protenas associadas ao DNA em regies especficas ricas em A e T (scaffold attachment regions (SARs) b) Fibra de cromatina e protenas associadas enrolam em estrutura helical-cromossoma. Colorao com Giemsa (G-banding) Bandas escuras- ricas em AT Bandas claras -ricas em GC
unidade volta da qual o DNA est enrolado nos nucleossomas de cromossomas eucariotas
Scaffold (armao)
Aaron Klug
"for his development of crystallographic Histonas: H1 (ou H5), H2A, H2B, H3 e H4 electron microscopy and his structural H2A, H2B, H3 e H4 associam-se ao DNA: nucleossomas elucidation of ~ 100-150 resduos de aminocidos. biologically important nucleic acid-protein Nucleossoma =146 bp de DNA e oito histonas complexes" (duas cpias de H2A, H2B, H3 e H4) DNA enrolado volta do ncleo de histonas-quase duas voltas por nucleossoma
Nucleossoma
Histonas
Resduos de lisina no N-terminal->importantes na regulao da transcrio dos genes
Condies normais-grupo R da lisina positivo ->interage com DNA Grupo R pode ser neutralizado (acetilao) ->reduz fora da ligao histonas-DNA
Sequncia da histona H4 de bovino
Moderadamente repetitivo
~ 25-40% do DNA de mamfero reassocia a velocidade intermdia Inclui repeties espalhadas (interspersed)
Cintica de reassociao do DNA: 1-DNA clivado ao acaso at fragmentos ~1000 bp. 2-Aquecido para separar cadeias complementares 3-Temperatura reduzida para ocorrer reassociao de cadeias Fragmento com sequncia repetida muitas vezes no DNA total->reassocia mais rapidamente
Organizao geral de sequncia de DNA. A regio codificante constitui cerca de 3% do DNA total numa clula humana
Natural selection operating within genomes will inevitably result in the appearance of DNAs with no phenotypic expression whose only 'function' is survival within genomes. Prokaryotic transposable elements and eukaryotic middle-repetitive sequences can be seen as such DNAs, and thus no phenotypic or evolutionary function need be assigned to them.
Duplicao de genes
Famlias de Genes
Famlias multignicas
Conjunto de genes com sequncias idnticas resultantes de duplicao Exemplos: -famlia de genes de rRNA (todos excepto bactrias mais simples) -famlia de genes de histonas H2A, H2B, H3 e H4 (eucariotas) -famlia de genes da globina (mamferos)
Famlias de Genes
Pseudogenes
Genes no funcionais devido a alteraes no gene original
Convencional
Mutaes (codo stop precoce, desvio de grelha, etc)-protena alterada
Processed
Reintegrao aps transcrio reversa do mRNA em cDNA-no expresso Reintegrao em posio aleatria no genoma Elementos mveis- LINES
Hemoglobina
Organizao dos grupos de genes HOX em mamferos e Amphioxus sugere a possibilidade de uma ou duas duplicaes ancestrais no genoma
Amphioxus, o invertebrado considerado mais prximo dos vertebrados. Genes parlogos. O vertebrado ancestral teria 13 genes HOX mas a perda de genes individuais aps duplicao do cluster levou a que cada cluster de mamfero tivesses menos um ou mais dos genes originais
Exemplo: Sequncia de pequena parte de telmero localizado nos extremos de cada cromossoma humano
Telmero ~15 kb-> constitudo por milhares de repeties seguidas da sequncia "GGGTTA" Humanos Clula germinal -telmero 15 kb Clula somtica em envelhecimento- telomero menor
Centrifugao em gradiente de densidade de fragmentos de DNA com diferenas em composio de bases. Bandas satlite resultam de repeties em tandem.
Satlites
Geralmente no centrmero 100 kb - 1 Mb. Humanos Ex. DNA alphoid - centrmero dos cromossomas Unidade repetida-171 bp 3-5% do DNA de cada cromossoma
Minisatlites
1 kb -20 kb. Ex. - Variable number of tandem repeats (VNTR) Unidade 9 bp-80 bp Em regies no codificantes Nmero de repeties pode diferir entre indivduos- Fingerprinting de DNA -Repeties nos telmeros GGGTTA
Microsatlites
Short tandem repeats (STR) Unidade repetida: 1 - 6 bp Regio total <150 bp. Nmero de repeties pode diferir entre indivduos- Fingerprinting de DNA
FISH em cromossomas humanos na metafase. Vermelho-sonda CpG; Verde fluorescein isothiocyanate (FITC) - regies de replicao tardia reconhecidas pela incorporao de bromodeoxyuridine (BrdU).
LINEs
ORF Open Reading Frame Repeties directas (regio a vermelho) Alguns LINEs resultam de mRNA reconvertido em DNA- sem promotores-no expresso-pseudogenes Alguns LINES codificam transcriptase reversa e/ou integrase.
SINEs
Repeties espalhadas
Transposes
DNA que se move duma regio para outra milho Drosophila bactrias humanos
Retrotransposes
RNA->DNA (transcriptase reversa) DNA inserido em nova regio
Genoma Humano
International Human Genome Sequencing Consortium-Nature, 15 Fevereiro 2001 Celera Genomics-Science, 16 Fevereiro 2001
Nmero de Genes de protenas: ~30.000-38.000 1-2% DNA total Genesweep (Drosophila ~13.600) (C.elegans ~19.800) Mas =>Muitos genes humanos codificam mais de uma protena Em mdia cada ORF origina 2-3 protenas diferentes PROTEOMA humano (protenas totais) 5-10 vezes maior que Drosophila/C.elegans =>Maior proporo do nosso genoma codifica factores de transcrio e apresenta elementos reguladores
Genoma Humano
Genoma humano
Famlias de genes - duplicao de genes -genes da globina -genes de receptores do olfato
DNA repetitivo ~50% do total -LINES 16-19%
Famlia L1 ~ 60.000 - 100.000 elementos
-SINES ~12%
Famlia Alu ~700.000 - 1.000.000 elementos
-retrotransposes 5-8% -transposes ~3% Genes de bactrias 223 genes sem homlogos noutros animais mas semelhantes a genes de bactrias
Contedo em exes indicado como percentagem do comprimento dos genes. Geralmente, relao inversa entre comprimento do gene e percentagem de contedo de exes. CFTR, cystic fibrosis transmembrane regulator; HPRT, hypoxanthine phosphoribosyl transferase; NF1, neurofibromatosis type 1.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Genes e Doenas
Mapa dos cromossomas humanos http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=gnd.chapter.272&ref=sidebar
Para cada cromossoma individual -nmero de pares de bases -nmero de genes -doenas associadas
Genomas de Organitos
Mitocndrias e Cloroplastos
-Genes extracromossomais-herana materna -Maioria circulares (Paramecium, etc-linear) -Em muitos eucariotas coexistem com verses lineares -cloroplastos podem ter crculo menor=subconjunto -cpias ~10/mitocndria humana ~1000/cloroplasto Clamydomonas Parte das protenas usadas nos organitos so codificadas em genes nucleares
Genomas de Organitos
Mitocndrias e Cloroplastos
Dimenses genoma Cloroplasto (kb)
Pisum sativum (ervilheira) 120 Oryza sativa (arroz) 136 Nicotiana tabacum (tabaco) 156 Chlamydomonas reinhardtii (alga verde)195
Genomas de Organitos
Mitocndria
-nmero de genes: 12 (C.reinhardtii)-92 (protozorio Reclinomonas americana) Genes: -todos tm genes rRNAs mitocondriais -pelo menos genes de algumas protenas cadeia respiratria -genomas mais ricos tm genes tRNAs, protenas ribossomais e protenas transporte
transcrio, traduo e
Genoma de Mitocndrias
n total genes tipos de genes protenas complexo respiratrio ribossomais transporte RNA polimerase factor traduo RNA ribossomal RNA tranferncia Outros genes RNA nmero de intres tamanho (kb)
H. sapiens 37 13 13 0 0 0 0 2 22 0 0 17 S. cerevisiae 35 8 7 1 0 0 0 2 24 1 8 75 A.thaliana 52 27 17 7 3 0 0 3 22 0 23 367
Genoma de organitos
Cloroplastos
-maioria tem ~200 genes Genes: rRNAs, tRNAs, protenas ribossomais, protenas fotossntese
Nucleide-empacotamento do DNA superenrolado com protenas de ligao a DNA (girase, topoisomerase I, quatro protenas de empacotamento como HU)
Circulares (maioria) ou lineares (Borrelia burgdorferi, Streptomyces, etc)
Genoma de E. coli
>crculo 1.6 mm clula 1x2 m >DNA (~60 bp) enrolado em tetramero de HU >~60.000 HU por clula >Origem de replicao (oriC) >Terminao da replicao (TER) >Vrios genes de protenas >DNA no codificante ~11% >Genes em Operes ~600
Genomas de Procariotas
Plasmdeos
-circular (maioria) ou linear -alguns tipos podem integrar-se no cromossoma -muitos podem ser transferidos entre clulas -independentes? Parte do genoma? Tipos de plasmdeos
Resistncia Fertilidade Killer Degradativos Virulncia
funes genes
resistncia a antibiticos Conjugao sntese toxinas matar outras enzimas metabolismo especfico Patogenicidade
exemplos
Rbk de E. coli F de E. coli Col de E. coli (colicina) TOL P. putida (tolueno) Ti A. tumefaciens
Clulas podem ter: 0 a alguns plasmdeos E. coli >17 plasmdeos (533 kb, >430 genes) Borrelia burgdorferi alguns genes essenciais -genes de protenas de membrana -genes envolvidos na biossntese de purinas
Genomas de Vrus
Classificao de Baltimore: 1.vrus dsDNA 2.vrus ssDNA 3.vrus dsRNA 4.vrus (+)-sense ssRNA 5.vrus (-)-sense ssRNA 6.vrus RNA reverse transcribing 7.vrus DNA reverse transcribing ds-double strand
ss-single strand
Genomas de Vrus