TCNICAS DE INGENIERA GENETICA

HECHOS HISTRICOS DE LA BIOLOGA MOLECULAR

1953 1966 1967 1973 1974 1975 1980 1982 1983

Watson & Crick determinacin de estructura del ADN Nirenberg, Ochoa y Khorana elucidaron Cdigo Gentico Wise y Richardson aislaron ADN ligasa Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNr en bacterias Demostracin directa de deleccin gnica humana Edward Southern Southern Blotting Maxam-Gilbert & Sanger Mtodos de Secuenciacin Tabaco, la primera planta modificada genticamente Kary Mullis concibe el PCR / Fred Sanger y colegas publican la secuencia del fago lambda 2000 26 de junio se presenta 90% borrador genoma humano 2001 26 de enero borrador genma del arroz Oriza sativa

Transferencia de genes en animales

BIOTECNOLOGA
Cultivo de Clulas Vegetales Diagnsticos

Frmacos Anti-cncer

Solucin de crimenes Tecnologa del ADN Bancos de ADN, ARN Protenas Mapas de Genomas completos

Biologa Molecular
Ingeniera Gentica
Sntesis de Nuevas Protenas Nuevas Plantas y Animales Nuevos Alimentos Nuevos Antibiticos Clonacin Produccin de Protenas humanas Recursos humanos qumicos raros Terapia Gnica

Marcadores

Sntesis de Sondas de ADN

Localizacin desrdenes genticos

BASES NITROGENADAS

UNIDADES BSICAS:
Nucleotdeos pricos
fosfato Base nitrogenada adenina (A)

Guanina (G)

Acar desoxirribose

Desoxiadenosina 5-fosfato (dAMP)

Desoxiguanosina 5-fosfato (dGMP)

Nucleotdeos pirimdicos

Citosina (C)

Timina (T)

Desoxicitidina 5-fosfato (dCMP)

Desoxitimidina 5-fosfato (dTMP)

Extremidade 3

Extremidade 5

Extremidade 3

ESTRUCTURA DE LA MOLCULA DEL ADN

Extremidade 5

Est formada por dos cadenas de desoxirribonucletidos unidos a travs del oxhidrilo 3 de una desoxirribosa al oxhidrilo 5de la siguiente desoxirribosa mediante unin fosfodiester. Las cadenas de cido nucleico formada de sta manera tiene un extremo 5libre y otro estremo 3libre.

La estructura regular ms estable del ADN se conoce como doble hlice, consiste en dos hebras de cido desoxirribonucleico ubicadas en forma antiparalelas. En sta estructura cada base nitrogenada del centro se encuentra enfrentando una base determinada de la hebras opuesta; siempre A enfrenta a T y se estabiliza por 2 puentes de hidrgeno y C enfrenta a G estabilizandose por 3 puentes de hidrgeno.

SOLO EL 5% DEL DNA HUMANO CODIFICA PROTEINAS Y RNA FUNCIONALES Y SECUENCIAS REGULADORAS QUE CONTROLAN SU EXPRESIN.

Todos los seres vivos tienen su informacin hereditaria codificada en la molcula de ADN. El juego completo de ADN de un ser vivo es el genoma. El genoma humano cuenta con 3 mil millones de pares de bases (pb) y unos 30,000 genes, que son un 3% del genoma. El tamao del genoma es independiente de la complejidad del organismo.

GENOMAS

60%

IDENTIDAD GENTICA
70%

20%

95% idntico

De 289 genes humanos implicados en enfermedades, hay 177 cercanamente similares a los genes de Drosophila.

Humanos 30,000 genes

Chimpanc 30,000 genes

Ratn 30,000 genes

Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2%

Caenorhabditis elegans 19,000 genes

D. melanogaster 13,000 genes

LAS OBSERVACIONES DEL TAMAO DE DISTINTOS GENOMAS PROVENIENTES DE ORGANISMOS MUY DIFERENTES PERMITEN OBSERVAR QUE AUNQUE NO EXISTE UNA DIRECTA CORRELACIN ENTRE EL TAMAO DE UN GENOMA Y LA COMPLEJIDAD GENOTPICA DE UN ORGANISMO, ES NECESARIO UN AUMENTO DEL TAMAO GENMICO CON EL AUMENTO DE SU COMPLEJIDAD GENTICA.

Qu es un gen?
Es una secuencia completa de cidos nucleicos necesaria para la sntesis de un producto gnico funcional . Contiene la informacin, a partir de la cual se sintetiza un polipptido, una enzima, un cido ribonucleico: mensajero, de transferencia o ribosomal. En el genoma humano la mayora de los genes son nicos y se expresan en forma independiente.

Elementos tpicos: 1) regin reguladora o promotor basal (caja TATA). o sitios de unin de proteinas reguladoras (upstream promoter). o Amplificadores (enhancers) o Silenciadores 2) sitio de inicio de transcripcin.

ESTRUCTURA DE UN GEN

3) 5'UTR.
4) codn de inicio. 5) intrones y exones alternados, con sitios de procesamiento aceptores y donadores 6) Codn de paro. 7) 3'UTR.

8) seal de poli-adenilacin.

La ingeniera gentica es una parte de la biotecnologa que se basa en la manipulacin gentica de organismos con un propsito predeterminado: consiste en la introduccin de genes en el genoma de un individuo que carece de ellos. La ingeniera gentica puede definirse como un conjunto de tcnicas, nacidas de la Biologa molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo.

La ingeniera gentica incluye un conjunto de tcnicas biotecnolgicas, entre las que destacan:
la tecnologa del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro. La secuenciacin del ADN: Tcnica que permite saber el orden o secuencia de los nucletidos que forman parte de un gen. la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar el nmero de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una mnima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite para un determinado estudio. Electroforesis: tcnica que permite separar fragmentos de cido nucleicos.

CLONAR significa identificar una secuencia en un genoma y luego obtener miles de copias de una nica copia original.

El clonado del ADN implica 5 procedimientos generales y se utiliza tecnologa del ADN recombinanate: Un mtodo para cortar el ADN en una localizacin precisa por endonucleasas especficas para determinadas secuencias de ADN. ( endonucleasas de restriccin). Seleccin de molculas pequeas de ADN capaces de autorreplicarse (vectores de clonado).

Los segmentos de ADN a ser clonados pueden ser unidos a vectores de clonado; las molculas hibridas o quimricas que contienen stos segmentos unidos covalentemente se llaman ADN recombinantes. Un mtodo para unir covalentemente dos fragmentos de ADN (ADN ligasas) Un mtodo para introducir el ADN en una clula hospedadora que provea la maquinaria enzimtica necesaria para la duplicacin del ADN.

La existencia de mtodos para seleccionar e identificar las clulas hospedadoras, las que se dividen formando una colonia de clulas que proceden de la original o clon.

TECNICA DEL ADN RECOMBINANTE-CLONACIN.

VECTOR + FRAGMENTOS DE ADN

DNA RECOMBINANTE

REPLICACIN DEL DNA RECOMBINANTE DENTRO DE LAS CLULAS HUSPEDES

AISLAMIENTO, SECUENCIACIN Y MANIPULACIN DEL FRAGMENTO DE DNA PURIFICADO

ENZIMAS DE RESTRICCIN: son enzimas que cortan los enlaces fosfodister del material gentico a partir de una secuencia que reconocen y permiten obtener regiones separadas y pequeas del DNA. Un ADN tratado con enzimas de restriccin queda dividido en fragmentos cuya abundancia y tamao dependen de la frecuencia con que se encuentra presente en el ADN el sitio reconocido por la enzima.

Las tipo II clivan el ADN en la secuencia de reconocimiento; stas son secuencias mayormente cortas (4 a 6 pares de bases) y palindrmicas (la secuencia en la misma leyendola de 5a 3en una cadena como de 3a 5en la cadena complementaria).

Cortes desparejos que dejan colas cortas de simple cadena en el extremo de cada fragmento.

No dejan bases desapareadas en los extremos Los extremos romos pueden convertirse en cohesivos agregando oligonucletidos conectores (linkers)

Es importante saber que ER se us para obtener los fragmentos: un fragmento obtenido con EcoRI ne se unir con un fragmento generado por BamHI ya que los extremos no son complementarios.

Molcula A

Molcula B

Digestin de ambas molculas con la misma enzima de restriccin, BamHI Extremos cohesivos Mezclar

Tratar con ADN-ligasa

ADN recombinante

MAPAS DE RESTRICCIN
Indican los sitios de reconocimiento para distintas ER en una determinada secuencia de ADN. Mapas de restriccin. Un mapa de restriccin es la recopilacin del nmero, del orden y de la distancia entre los sitios de corte de enzimas de restriccin en un segmento clonado de DNA.

El mapa de una dada regin gnica es el resultado de la comparacin de fragmentos producidos luego del corte con distintas ER.

LOS FRAGMENTOS DE DNA TANTO CON EXTREMOS ADHESIVOS COMO CON EXTREMOS ROMOS PUEDEN INSERTARSE EN VECTORES DE DNA CON AYUDA DE DNA LIGASAS.

EL VECTOR DE DNA Y LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIN SE LIGAN COVALENTEMENTE A TRAVS DE LOS ENLACES FOSFODISTER 3-5.

VECTORES: son unidades de ADN

que pueden replicarse en forma autnoma y dentro de los cuales puede insertarse otros fragmentos de ADN. De esta manera los genes clonados se multiplican cuando el vector se replica llevando finalmente a la produccin de un gran nmero de molculas idnticas disponibles.

CARACTERISTICAS DE LOS VECTORES

1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA que transporta. 2. Debe contener sitios de corte para enzimas de restriccin presentes slo una vez en el vector. Estos sitios se utilizan para insertar segmentos de DNA cortados con la misma enzima. 3. Debe tener algn marcador de seleccin (normalmente genes de resistencia a antibiticos o genes de enzimas que la clula husped no tiene) para poder distinguir las clulas husped que transportan el vector de las que no lo contienen. 4. El vector de la clula husped debe ser fcil de recuperar.

Todos los vectores deben contener secuencias que le permitan replicarse dentro de una clula hospedadora compatible.
1. Plsmidos: fragmento extra de ADN bicatenario circular que existe en algunas especies de bacterias. Su tamao pequeo facilita su entrada a las bacterias y habitualmente portan genes que le confieren resistencia a antibiticos. Capacidad de replicacin autnoma. 2. Bacterifagos: es un virus que infecta bacterias; en este caso el ADN extrao que se quiere transferir se incorpora al ADN vrico y funciona como ADN recombinante. El mas utilizado es el fago . 3. Csmidos: combina caractersticas de plsmidos y bacterifago solo que de mayor tamao. Actualmente se estan ensayando los Fasgemidos que resultan de la manipulacin gentica sobre plasmidos y fagos.

Plsmidos

Plsmido

gen de resistencia a la ampicilina

2
Extremos cohesivos

Molcula de ADN recombinante

FAGOS
1

Las molculas recombinantes resultantes pueden introducirse en clulas husped bacterianas por transfeccin. Los vectores que contienen el inserto entran en las clulas husped, donde dirigen la sntesis de fagos infectivos, llevando cada uno de ellos el inserto de DNA. 3

Los csmidos son vectores hbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y de DNA plasmdico. Contienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del DNA del fago dentro de su cubierta proteica, y secuencias plasmdicas de replicacin y genes de resistencia a antibiticos, que permiten identificar las clulas husped que los contienen.

CLONADO MOLECULAR: A-Preparacin del ADN inserto y del vector cortando con enzimas de restriccin. B- Ligacin de ambos para generar ADN recombinante.

C- transformacin en clulas bacterianas con el plsmido hbrido. D- Amplificacin del vector. E- Seleccin de bacterias y expresin del ADN clonado.

Si la introduccin de ADN extrao se realiza en clulas eucariotas no reproductoras se denomina al proceso transfeccin. Si la introduccin se realiza en clulas reproductoras de plantas y animales, la alteracin gnica va a estar presente en todas clulas del cuerpo, en este caso se habla de transgnesis

La multiplicacin de las clulas que contienen el ADN recombinante (ADNr), ya sea en un plsmido o en un csmido, o en su propio ADN (si se us un virus vector), produce una clonacin de ste, es decir, la produccin de mltiples copias idnticas de ADNr que lleva el gen extrao.

SELECCIN DE TRANSFORMANTES: una vez incorporado el ADNr en el hospedador, es necesario buscar un mtodo que nos permita identificar las bacterias transformadas con el vector recombinante de aquellas que no lo han incorporado.
Se suele utilizar un vector que contenga un gen que no posea la clula hospedadora y que requiere para su crecimiento bajo condiciones especificas.

Una vez identificada se aslan y se cultivan para obtener as un clon bacteriano con ADNr.

Otro paso es localizar la posicin del gen (regin codificante de protena) que interesa en el fragmento que est clonado en la colonia de clulas seleccionada.

Se suele marcar radiactivamente o enzimticamente una secuencia sinttica de ADN o sonda complementaria a la secuencia de nuestro inserto y utilizarla para detectar aquella recombinante que posea el fragmento de ADN complementario (DESNATURALIZACION E HIBRIDACION)

La tcnica de la clonacin de ADN ha permitido obtener gran cantidad de un cido nucleico para que pueda realizarse su secuenciacin y conocer la composicin qumica de cada gen. Esto posibilita la obtencin de secuencias de genomas completos. EL CONJUNTO DE CLONES QUE INTENTAN REPRESENTAR EL GENOMA COMPLETO DE UN ORGANISMO SE DENOMINA BIBLIOTECA DE ADN GENOMICO

Genotecas
Genoteca: coleccin de clones que contiene todo el genoma de un organismo. Tipos de genotecas: Genmicas Parciales ADNc. Coleccin de ARNm Tipos de vectores: Plsmidos (Genotecas parciales) Fagos (Genotecas genmicas pequeas y de ADNc) Csmidos, BAC (genotecas genmicas complejas)

BIBLIOTECA DE ADN
BIBLIOTECAS DE ADN GENOMICO
Constituida por todo en genoma de una especie (genes y secuencias no codificantes)

BIBLIOTECA DE ADN COPIA

Representan todos los genes que se expresan en un tejido determinado y en un momento dado. No contienen intrones ni secuencias flanqueantes, se obtienen a partir de ARNm maduros. De utilidad ya que algunas protenas son producidas en grandes cantidades por clulas especializadas.

En una biblioteca genmica estn representados todos los genes de un organismo. La biblioteca es un medio para recuperar cualquier gen del genoma del organismo, pudindose estudiar con detalle junto con sus secuencias reguladoras adyacentes.

SECUENCIACION: es una manera rpida y sensible para determinar la secuencia de aminocidos de una protena a partir de la secuencia de nucletidos en su gen.

Empleando 4 fluorocromos distintos se puede combinar el resultado de las 4 reacciones y aplicar la mezcla a un mismo pocillo de gel de electroforesis.

El color de cada banda corresponde al desoxinucletido 3terminal de ese fragmento

Se genera un registro informatizado de los 4 perfiles de color que combinados se interpretan como una secuencia.

Eletroforesis en gel: agarosa o poliacrilamida

Mtodo comn y eficaz. Matriz semisolida

Buffer a pH bsico.
Parmetro discriminatorio: poro de la matriz.

TCNICAS ELECTROFORTICAS
Se basan en la migracin diferencial de las molculas a separar en un campo elctrico. Generalmente se lleva a cabo en un soporte inerte. (AGAROSA) En la electroforesis en gel la fuerza que provoca la migracin de las molculas es el campo electrico, pero el gel acta como filtro molecular, relentizando la migracin su migracin en funcin de su tamao

Separacin eletrofortica de cidos Nuclicos

Carga e tamao

7. Electroforesis en geles de agarosa

La movilidad electrofortica del ADN en los geles de agarosa

es inversa a su tamao

1Kb

3.0 2.0 1.6 1.0 0.5

BKTBKT-O de H. pluvialis

Para dejar en evidencia un fragmento determinado de cido nucleico deben usarse tcnicas ms especficas.

Aprovechando la posibilidad de hibridizacin de cidos nucleicos se utilizan sondas para ubicar un fragmento en especial.

Los fragmentos de ADN separados en gel pueden ser transferidos a un filtro de nitrocelulosa para ser detectados mediante una sonda o METODO SOUTHERN BLOT: la posicin de la sonda permite identificar los fragmentos de ADN que contienen la secuencia blanco

PCR: REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA Tcnica que permite amplificar miles de veces in vitro un segmento especfico de ADN. El segmento a amplificar puede tener 50-2000 pares de bases. El ADN no necesita estar en estado puro sino que puede ser parte de mezclas complejas. 3 etapas sucesivas efectuadas a distintas temperaturas: 1. Se desnaturaliza la cadena de ADN por calor, en presencia de excesos de primers. 2. Se enfra para permitir que los primers se apareeen con su segmento complementario sealando el comienzo de la replicacin. 3. Sntesis de una nueva cadena en direccin 5a 3utilizando desoxirribonucletidos trifosfatos.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR es bsicamente una tcnica de amplificacin del DNA.

DNA

PCR

(molcula sencilla)

amplificacin

Muchas moleculas del mismo ADN

Que necesitamos para la PCR?

DNA: molde para la reaccin. Primers: inicio de la polimerizacin. Determina los limites del fragmento a ser amplificado dNTPs desoxirribonucletidos trifosfatos MgCl2 Tampon Taq polimerasa: aislada de la bacteria Thermus aquaticus. (termoresistente) Co-fator Enzimtico

PCR REACCION DE LA CADENA DE POLIMERASA

APLICACIONES DE LA TECNICA DE PCR

1. DETECCION DE AGENTES INFECCIOSOS COMO VIRUS LATENTES (HEPATITIS B Y C, HIV) 2. DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS 3. DETECCION PRECOZ DE ENFERMEDADES ONCOLOGICAS 4. COLABORA EN LA MEDICINA FORENSE EN LA IDENTIFICACION DE CADAVERES, ESTABLECER RELACIONES DE PARENTESCO O CONFIRMAR IDENTIDAD DE SOSPECHOSOS DE CRIMENES.

5. PERMITE ESTUDIAR LA EVOLUCION USANDO ADN DE MUESTRAS ARQUEOLOGICAS.

ESTUDIO DE MUTACIONES POR PCR:

si se conoce la regin del ADN que contiene la mutacin se puede sintetizar un primer complementario a ese fragmento y si el ADN contiene la mutacin este ser amplificado por PCR; si no lo contiene el primer no se unir y no ser amplificado.

POLIMORFISMOS EN LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION (RFLP): Es el polimorfismo o variacin en la secuencia de nucletidos que ocurre en el sitio de reconocimiento de la enzima de restriccin. El fragmento de restriccin producido por la enzima es mas largo para la persona portadora de la mutacin que para una persona normal.

POLIMORFISMOS EN LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION (RFLP): N M

GAGGAG CTCCTC AAGGAG TTCCTC

PCR

Mutacion elimina un sitio de restricion para BseRI

AMPLIFICADO

Eletroforese sin digestion

Digestion BseRI

N M
NN NM MM

527 + 166 pb 693 pb

3
693 pb

693 pb 527 pb 166 pb

Southern blot

DETECCION DE MUTACIONES EN REGIONES ALTAMENTE VARIABLES: Son regiones que contienen ADN altamente repetitivo (cortas secuencias de menos de 10 pares de bases que se repiten en tandem miles de veces en una sola clula) Usando enzimas de restriccin para estos loci pueden identificarse individuos tan exactamente como si fueran huellas digitales. Individuos cercanos genticamente tendrn patrones de fragmentos de restriccin similares entre si ; los gemelos monocigotas tendrn patrones idnticos.

Obtencin de protenas de inters mdico y econmico Antibiticos, enzimas, hormonas: insulina, hormona del crecimiento, eritropoyetina, vacunas, protenas sanguneas: seroalbmina11, factores de coagulacin. Mejora gentica de vegetales y animales para obtener una mayor produccin y mejor calidad nutricional: Mayor adaptacin a diversos ambientes. Mejores caractersticas agronmicas (resistencia, desgrane, buena cobertura, etc.). Resistencia a plagas y enfermedades. Resistencia a la sequa, temperaturas bajas o altas, etc., Alto valor nutritivo (protenas y vitaminas). Mayor coloracin, sabor y/o tamao de los frutos, Resistencia al transporte y almacenamiento.

Obtencin de "bioinsecticidas", animales y plantas capaces de destruir a otros seres vivos que se alimentan de los cultivos. Obtencin de animales y vegetales transgnicos Animales: obtencin de rganos animales (cerdos) con genes humanos para no ser rechazados en trasplantes, animales con carnes y huevos con menos colesterol y grasas, pollos sin plumas Vegetales resistentes a insectos: maz y algodn con un gen que produce una toxina para orugas y escarabajos - resistentes a herbicidas: soja, algodn, maz, resisten a altas concentraciones de herbicidas que se echan en los campos para erradicar malas hierbas - resistentes a condiciones ambientales: fro, sequa, alta salinidad, etc.

Biodegradacin de residuos: Clonacin de genes bacterianos productores de enzimas que degradan sustancias txicas o contaminantes (tratamiento de aguas residuales, transformacin de desechos domsticos, degradacin de residuos peligrosos y fabricacin de compuestos biodegradables) Secuenciacin de ADN: Secuenciar ADNs es analizar la composicin de un fragmento de ADN para saber qu genes tiene y qu producen esos genes; esto es lo que se est haciendo en el Proyecto Genoma Humano. Terapias gnicas Consisten en manipular genticamente clulas enfermas para que ellas mismas puedan producir las protenas cuya falta o mal funcionamiento provoca la enfermedad: con la ayuda de un vector adecuado se introduce el gen correcto y se integra en el ADN de la clula enferma