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Curso: Biologa Celular y Molecular Oscar Nolasco Crdenas MSc.

oscarnol@hotmail.com
Octubre 2013

DNA - historia
1865 Gregor Mendel Publico sus resultados sobre los factores de la herencia. Experiments in Plant Hybridization The Natural Science Society

1868 descubrimiento de la nucleina (DNA) Friedrich Miescher

1902 Walter Sutton Interrelaciona la citologa y el Mendelismo (morfologa & herencia). Cromosomas son unidades hereditarias. Esta teora tambin fue desarrollada por Theodor Boveri

1928 Fred Griffith Propuso la existencia de un principio transformante .

Neumococos R vivos inoculados junto con neumococos S inactivados por calor producan la muerte del ratn

live S strain

1944 Oswald Avery,Colin MacLeod,Maclyn McCarty. Reportaron que el principio transformante de Griffith era el DNA.

Oswald Avery Colin McLeod

Maclyn McCarty

1950 Erwin Chargaff Determino que los organismos vivos presentan una proporcin constante entre Adeninas con Timinas y Guaninas con Citosinas.

1950 Rosalind Franklin Obtuvo las fotografas de alta calidad de difraccin de rayos X del DNA

Rosalind Franklin

Maurice Wilkins

1952 Martha Chase y Alfred Hershey empleando bacteriofagos marcados con 35S y 32P demostraron que el DNA es una molcula hereditaria

1953 Francis Crick y James Watson resolvieron la estructura tridimensional del DNA.

1958 Matthew Meselson y Frank Stahl empleando la diferencia de densidades de isotopos demostraron la propiedad semiconservativa de la replicacin del DNA.

1958 Arthur Kornberg Purifico la DNA polimerasa I de E. coli, La primera enzima que sintetiza DNA en un tubo de ensayo 1966 Marshall Nirenberg, H. Gobind Khorana Led descifran el cdigo gentico determinan que los codones (tripletes de nucleotidos de mRNA) son especficos para un aminocido. 1970 Hamilton Smith Kent Wilcox Aislo la primera enzima de restriccin, HindII: que corta el DNA en un sitio de reconocimiento especifico. 1977 Fred Sanger Desarrolla el mtodo del nucletido terminador para el secuenciamiento de DNA. 1978 Somatostatin es la primera hormona humana en producirse por la tecnologa del DNA recombinante. 1983 Kary B. Mullis Propuso el mtodo de Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) para amplificar DNA

1988 - 2003 Se desarrolla el proyecto genoma Humano


2002 Inicio de proyectos de Metagenomica : Determinar los organismos que forman una comunidad 2007 DNA de J Watson secuenciado en 2 meses 454 Life sciences (ROCHE)

The oceanic viriomes (all viruses in a habitat) (August 2006) were from the Sargasso Sea, Gulf of Mexico, coastal British Columbia and the Arctic Ocean. The nine biomes (March 2008) were stromatolites, fish gut, fish ponds, mosquito viriome, human-lung viriome, chicken gut, bovine gut and marine viriome. The different technologies used are dye-terminator shotgun sequencing (black), fosmid library sequencing (pink) and pyrosequencing (green). (Graphic based on data sets represented at http://www.genomesonline.org.)

EL DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR

DNA
.

Duplicacin o Replicacin

CCTGAGCCAACTATTGATGAA

transcripcin Reversa RNA CCUGAGCCAACUAUUGAUGAA traduccin Protena

PEPTIDE

ESTRUCTURA DEL DNA

Acido Nuclico: polmero de nucletidos


Componentes de un nucletido: base N + pentosa + fosfato

Las bases nitrogenadas se unen al azcar por enlace B glucosidico

Componentes de un nuclesido: base N + pentosa

La adicin de un fosfato o mas convierte a un nuclesido en un nucletido

Azcares de los cidos nuclicos

DNA
Bases nitrogenadas de los cidos nuclicos

RNA

(DNA)

(RNA)

Cada base nitrogenada tiene una forma tautomerica preferida

DNA: Dos hebras antiparalelas forman la doble hlice de DNA


Las hebras estan formadas de nucletidos unidos por enlace fosfodiester generando el esqueleto azcar fosfato

Las dos hebras se mantienen por el apareamiento de bases en el DNA por puentes de hidrgeno

Formas de DNA

Forma A

Forma B

Forma Z

Sentido de la helice Diametro Bases por torcion Distancia entre pares de bases

Hacia la derecha aprox 26 11 2.6

Hacia la derecha aprox 20 10.5 3.4

Hacia la izquierda aprox 18 12 3.7

La forma B es referida a la de Watson Crick Z alternancia de G y C, presente como segmentos en eucariotes y procariotes, con funcion quizas regulatoria de expresin

El DNA puede disociarse o asociarse por la complementaridad de su secuencia nucleotidica: Denaturacin reversible del DNA

La renaturacin permite hacer anlisis de hibridacin, cuando se mezclan dos hebras de DNA que comparten cierto grado de similaridad en su secuencia

La denaturacin esta relacionada al % de GC.


Organismos que presentan mayor % de GC en su secuencia genmica soportan temperaturas altas

Una secuencia con mayor % de GC presentara un tm mayor que una secuencia con alto contenido de AT
(El tm es la Temperatura media., Melting o temperatura de disociacin en el que la denaturacion de las hebras de ADN es del 50%)
Simple hebra

Doble hebra

Debido a las bases nitrogenadas el DNA absorbe luz ultravioleta. El efecto denominado hipercromicidad se da al denaturar el DNA, as las bases estn expuestas y puede absorber mayor cantidad de luz ultravioleta

Duplicacin del DNA


Ocurre en un origen de replicacin nico en DNA circulares (plasmidos)

En eucariotes es complejo y se da en varios orgenes de replicacin una vez que se realiza la replicacin el origen es inactivado

La sntesis de la nueva hebra es en sentido 5

a 3

Organizacin comn de las DNA polimerasa: La palma contiene el sitio cataltico, los dedos posicionan el molde con el nuevo nucletido y el pulgar mantiene la asociacin de la polimerasa y su sustrato, es importante en la procesividad,

c c

Los nucletidos adicionados son nucletidos trifosfatos. El mecanismo involucra iones Mg que coordinan con el grupo fosfato y residuos Asp de la enzima DNA polimerasa

La DNA polimerasa controla la fidelidad de la replicacin. Por efecto estrico discrimina desoxiribonucleotido de un ribonucleotido un

Las enzimas polimeras tienen un mecanismo de relectura o de proofreading (actividad exonucleasa 3 a 5) Evita la mala incorporacin de un nucleotido

El desenrrollamiento del DNA ocasiona un superenrrollamiento positivo en la direccin de la maquinaria de replicacin. DNA girasa es una topoisomerasa II, que rompe el DNA e introduce supercoil negativo a la cabeza de la horquilla de replicacin Fluoroquinolona inhibe DNA girasas en muchas bacterias gram-negativas: ciprofloxacina y levofloxacina (Levaquin)

Enzimas que forman la horquilla de replicacin

DNA polimerasas

La sntesis de DNA en E. coli,

Empieza con la unin de protenas

dnaA a la secuencia de origen de replicacin (ori)

Cerca de 20 molculas de DnaA se unen a los cuatro repeticiones de 9 bases y hexameros de DnaB (helicasa) se unen a cada hebra de DNA en colaboracin con DnaC. La actividad helicasa requiere de ATP y provoca la liberacin de dnaA. El complejo primasoma (dnaB, dnaC y dnaG) sintetizan el primer de RNA ( 10 a 60 nucletidos)

Composicin de la DNA pol III holoenzima 3 DNA polimerasa 1 copia de una molcula portadora de la pinza deslizante, este incluye tres copias de protena T que enlazan a las 3 DNA polimerasas. La sntesis conjunta de la hebra lder y la hebra rezagada propone el modelo Trombon

La incorporacin de la helicasa en eucariote es dependiente de Cdc6 y Cdt1 y la activacin de la helicasa y ensamblaje de replisoma depende de dos quinasas que son activas en la fase S

El problema de la duplicacin en los extremos en DNA lineal (telomeros)

El problema de la duplicacin en los extremos (telomeros) puede resolverse por distintos mecanismos. La telomerasa usa su propia molcula de RNA y por transcripcin reversa extiende la hebra en el extremo 3

Telomeros y edad
Metaphase chromosome

Telomeros son capuchones protectivoscaps sobre el extremo de los cromosomas y consisten de repeticiones cortas en tandem de 5-8 bp de una secuencia rica en GC, Previenen desde fusiones Cromosomas y rearreglos del kariotipo.

telomero

centromero

telomero <1 to >12 kb (TTAGGG)muchos Edad joven

telomero estructura

(TTAGGG)poco

Edad senil

telomerasa (una enzima) requerida para mantener la longitud de las clulas germinales La mayora de las clulas somaticas disminuye el nivel de la actividad de la telomerasa y asi sus cromosomas se acortan en cada divisin

Recombinacin: el intercambio cromosmico llamado crossing over es el resultado de la recombinacin homologa

El modelo de recombinacin homologa incluye 5 etapas: 1. Alineamiento de las dos molculas de DNA homologo 2. Ruptura del DNA 3. Invasin de una hebra, ocurren malos apareamiento por eso se denomina heteroduplex 4. Formacin de la estructura de Holliday

5. Resolucin de la estructura de Holliday

REPARACION DE ERRORRES EN EL DNA : Sistemas de reparacin corrigen el dao en el DNA

El sistema de escisin de nucletido NER repara los daos provocados por radiacin ultravioleta: Puede ocurrir la reparacin en forma global o acoplada a la transcripcin

El sistema de reparacin excision de base BER, repara daos de deaminacion o rupturas en una sola cadena

El sistema de reparacin por recombinacin homologa HR y de unin de extremos EJ, reparan la ruptura de las cadenas de DNA

Sistema de reparacin de una mala incorporacin o mal apareamiento MMR

Cambios tautomricos durante la replicacin

En la segunda duplicacin se presenta la mutacin

Cromosomas

El DNA es altamente comprimido en todos los tipos de genomas

En el bacteriofago

En bacterias

En mamiferos

En eucariotas, el DNA se encuentra empaquetado con proteinas histonas dentro de la cromatina. Las unidades bsicas de la cromatina son los nucleosomas.

Organizacin del DNA en el cromosoma

Estructura de los nucleosomas


Nucleosoma
147 pb de DNA alrededor de 8 molculas de histonas Cinco tipos de histonas 2 x (H2A, H2B, H3, H4) forman el ncleo octamrico H1 interacciona con el DNA conector y delimita al nucleosoma 2 vueltas adicionales de DNA 200pb

Las histonas se asocian a la carga negativa del DNA por su alto contenido de aminocidos de carga positiva

Dos copias

Tetramero H3-H4

Dimero H2A-H2B

Modificaciones covalentes de las histonas regulan la funcionalidad del DNA


Los eventos epigenticos son aquellas variaciones en la expresin de un gen que no se acompaan de cambios en la secuencia de DNA. Las cadenas laterales de las histonas sufren modificaciones. Modificaciones postraduccionales: Acetilacin Fosforilacin Metilacin(ms estable) Otras

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