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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLLO

E.A.P.:CIENCIAS BIOLOGICAS CULTIVO DE CALLOS, CLULAS Y OBTENCIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS Dr. Eloy Lpez Medina
segundoeloy@yahoo.es

CALLOS
Definicin. Crecimiento desordenado de clulas a partir de un tejido aislado de la planta en un medio de cultivo en presencia de determinados reguladores de crecimiento (2,4-D). Masas de clulas desdiferenciadas que crecen desorganizadamente lo cual probablemente genera considerable variacin. Clases: Compacto. Caracterizado por su apariencia maciza. Friable. Las clulas que lo forman se encuentran relacionadas entre si de manera laxa, fcilmente desmoronable.

ESTABLECIMIENTO
Factores que influyen: Material inicial :Especie, estado sanitario, edad , parte de la planta. Tamao de explante. Esterilizacin. Fenolizacin. Medio de Cultivo. Tipo y concentracin de hormona. Temperatura. Luz.

EXPLANTES POSIBLES
Meristemos
Hojas primordiales Yemas laterales Flores Tejidos de inflorescencias

Anteras
Races Clulas Embrioides.

CULTIVO DE CELULAS
SUSPENSIONES CELULARES: Tcnica del cultivo de tejidos de mas intensa aplicacin en los ltimos aos, para propagar y mantener clulas vegetales, estn conformadas por clulas libres o agregados celulares, iniciadas a partir de fragmentos de callos, en cultivos lquidos permanentemente agitados durante la incubacin.

CARACTERISTICAS
Pared celular de naturaleza celulsica. Dimetro de 20-150 um y longitud de 100-

200 um. 10-100x tan grande como bacterias y hongos. Gran densidad y estructura no uniforme. Sensibilidad diferencial.

MEDIO DE CULTIVO

Iniciacin
La cantidad mnima de callo friable que

se necesita para iniciar una suspensin celular es por lo general de 2 a 3 g/100 ml. Iniciar con 1/5 del volumen, 8-150 rpm., irradiancia continua y 25o C de temperatura. Subcultivos cada semana, diluciones desde 1/11/5, volumen final l/3 del total.

SISTEMAS DE CULTIVO
Segn Szabados et al. Cultivos Cerrados. Las clulas producidas permanecen en el medio hasta la fase estacionaria. Cultivos Continuos Cerrados. Alimentado con cultivo fresco y retirado el cultivo usado, sin clulas. Cultivos continuos Abiertos. Se diferencia del anterior, por que en este sistema tambin se retiran clulas.

Segn Endress(1994). Proceso Discontinuo, Batch Process o Batch Culture. No se agrega medio nuevo ni se remueve masa celular.
Sistemas Cerrados. La composicin del

medio de cultivo cambia continuamente, mas no las suspensiones celulares.


Sistemas Abiertos. Ambos componentes

son cambiados, tenemos:

Sistemas abiertos Semi-continuo

El material celular es removido y el medio de cultivo usado reemplazado a intervalos regulares. Mantener cultivo en fase exponencial.
Sistemas Abiertos Continuos

Medio de cultivo fresco es incorporado, en tanto que cantidades equivalentes de medio de cultivo usado es retirado con parte de clulas.

MEDICIN DEL CRECIMIENTO


Peso Fresco. Peso Seco. Volumen Celular. Nmero de clulas. ndice

mittico. IM = Clulas en mitosis/total de clulas x 100. pH. Mayores niveles de pH en la fase estacionaria.

DESARROLLO
Fases: Retraso, incubacin, reposo o Lag. Entre la iniciacin y mxima tasa de divisin. Aceleracin, exponencial o logartmica. Mxima tasa de divisin celular y la mxima concentracin celular. Peso seco K.

Fase Lineal o Linear.

Entre la tasa mxima de crecimiento y la completamente reducida capacidad de sntesis de protenas.


Fase Estacionaria.

Nmero de clulas permanece constante, mostrndose altamente vacuoladas, frgiles y con estructuras orgnicas diferenciadas.

SINCRONIZACIN
Cuando la mayora de sus clulas se encuentran en una determinada fase del ciclo celular. Se alcanza a travs de: Incorporacin de Productos qumicos. Para bloquear sntesis de ADN y detener ciclo celular. 5AU (5-aminouracilo), Colchicina. Supresin de Nutrientes. Propiciar que clula se detenga en fase G1, al agregar el nutriente, se alcanza la sincronizacin. Nitratos, Fosfatos, hormonas, etc.

APLICACIONES
Estudios

sobre el Ciclo Celular. Determinar diferentes ndices en una poblacin de clulas. Timidina radiactiva, cafena, hormonas vegetales. etc.

Estudios Fisiolgicos y Bioqumicos.

Determinacin de los niveles de absorcin de nutrientes, al utilizar medios de cultivo sintticos completamente definidos.

SELECCIN in vitro
Procedimiento en el cual clulas y tejidos

cultivados in vitro, son sometidos a una determinada presin de seleccin con la finalidad de seleccionar lneas celulares que exhiban tolerancia o resistencia al factor de presin ejercido. Puede aplicarse a poblaciones inicialmente homogneas, hbridos somticos, o clulas transformadas.

SISTEMAS DE CULTIVOS
Seleccin por Resistencia: Clulas cultivadas

bajo presin del factor: Enfermedades, herbicidas, stress, etc. Seleccin Visual. Si puede ser visualmente identificadas; antocianinas clorofilas. Seleccin Contraria. Ciertas drogas matan solamente a clulas en divisin. Mutantes autotrficos o mutantes letal condicionales.

SELECCIN in vitro DE GENOTIPOS SUPERIORES


Tolerancia a Metales Pesados: Al, Mn, Cu,

Zn. Tolerancia a Herbicidas: Picloram, Paraquat, Triazinas, etc. Tolerancia a Salinidad. Tolerancia a Sequa. Tolerancia a Temperaturas Extremas.

METABOLITOS SECUNDARIOS
Productos

del metabolismo especial, biosintetizados a partir de metabolitos primarios, tienen una distribucin restringida a ciertas plantas y microorganismos e incluso a una familia, gnero, especie o variedad.

Tenemos: alcaloides, lignanos, terpenoides,

flavonoides, etc.

Funciones: Proteccin: carotenos a la clorofila; Alcaloides hojas de caf; Atraccin: polinizadores y simbiontes, etc. Acumulacin. Est en funcin de la capacidad que exhiba la clula de sintetizarlos, almacenarlos y metabolizarlos.

CONDICIONES DE PRODUCCION
Internas: Clase de inculo y pre-cultivo. Seleccin de lneas celulares. Medio Basal: Reduccin de fosfatos, incremento de ciertos metabolitos, nitrgeno acelera produccin de metabolitos, cobre esencial como cofactor. Fuentes de Carbono. Hormonas Vegetales. Intermediarios y Precursores.

Externas: Temperatura Frecuencia de Agitacin Contenedores Luz: Directamente, Controlando la concentracin del producto, Acumulacin de nicotina. Permeabilidad de la membrana. Reacciones enzimticas.

PRODUCCION A GRAN ESCALA


Inmovilizacin de clulas. Mediante: Cama Fluidiza. De movimiento lento respecto al medio de cultivo. Cama fijada. Permanece estacionario. Ventajas: Crecimiento lento, por tanto, acumulacin de metabolitos. Cambio fcil del medio de cultivo. No afecta condiciones ni viabilidad de clulas.

Permeabilizacin. Induccin a la clula a eliminar los metabolitos secundarios al medio de cultivo. Mediante sulfxido de dimetilo DMSO entre otros. Biorreactores o Fermentadores. Contenedores especiales utilizados para cultivar clulas a gran escala. Se deber tener en cuenta: Tamao de clulas: 10 o 100 veces mas grandes que microorganismo. Evitar turbulencia en el medio para no destruir vacuola celular. Lento crecimiento celular. Das o semanas, facilitando infecciones del cultivo.

Elicitacin. Formacin de fitoalexinas. Fitoalexinas. Son metabolitos secundarios de bajo peso molecular, con amplia actividad fungitxica, y antimicrobiana formada a partir de precursores en una clula hospedera inducida por factores biticos o abiticos. Y que en bajas concentraciones inhiben el crecimiento de bacterias y hongos en las plantas infectadas.

Biotransformacin de Precursores. Permite la sntesis de compuestos as como la elucidacin de las vas biosintticas. Transformacin de: Codeinona en codena (Papaver somniferum). Cannabidiol en cannabielsona (Cannabis sativa ). Digitoxina en digoxina (Digitalis lanata).