Tcnicas de Laboratrio de Imunologia

Natalya Zaidan Maluf Patologia Clnica/Medicina Laboratorial HSP-Unifesp

IMUNOENSAIOS

Podem ser utilizados na deteco de antgenos ou de anticorpos Atualmente podem detectar quantidades nfimas de antgenos presentes no sangue da ordem de 0,1pg/mL ou at menos Antgenos: qualquer substncia que apresente stio antignico (eptopos) capazes de induzir a produo de anticorpos correspondentes haptenos, hormnios, protenas, glicoprotenas, glicolipdeos, outros produtos Anticorpos: Imunoglobulinas protenas plasmticas IgM, IgG, IgA, IgD e IgE

IMUNOENSAIOS
Classificao de Imunoensaios: 1. Imunoensaios de precipitao Nefelometria 2. Imunoensaios de Partculas 3. RadioImunoensaios 4. Enzima imunoensaios 5. Imunoensaios fluorescentes 6. Imunoensaios quimioluminescentes

Imunoensaios de Precipitao

Complexos Ag-Ac grandes que formam partculas insolveis (precipitados) Especificidade boa uma tcnica simples Mas sensibilidade continuam inferiores a 0,1 a 0,5 mg/dL Fatores de interferncia: proporo relativas de reagentes, condies de temperatura, pH e fora inica do meio, afinidade e avidez dos anticorpos Leitura do imunoprecipitado pela disperso da luz na turbidimetria ou nefelometria

NEFELOMETRIA

Mtodo direto de medida do espalhamento de uma luz incidente, em um determinado ngulo, causado por partculas em suspenso Analisadores da Behring Analisadores da Beckman Imunoglobulinas, componentes do complemento, fator reumatide, fatores da coagulao, protena C reativa, imunocomplexos ou hormnios, drogas, entre outros.

Imunoensaios de Precipitao

Turbidimetria

Mtodo de medida da diminuio da intensidade da luz transmitida atravs de uma suspenso de partculas Cobas Bio e Mira Plus, Roche Dimension, Dade International BM/Hitachi 911, Boehringer Utilizado para dosar antgenos, anticorpos, lipoprotenas, protena C reativa, albumina, pr-albumina, hemoglobina A, teofilina, gentamicina, digoxina, tobramicina, entre outros.

Imunoensaio de Partculas

Deteco de anticorpos nas amostras com antgenos especficos sensibilizados com uma partcula (aglutinao passiva ou indireta) Aglutinao reversa deteco do antgeno na amostra com anticorpos correspondente sensibilizado com partculas Hemaglutinao execuo simples e no exigem equipamenos especiais; ex: lues, tireide, globulina, etc Aglutinao em ltex Teste de aglutinao de cristais de colesterol VDRL

Radioimunoensaio
1.

2.

Ensaios diretos de competio (excesso de antgeno) exigem menores quantidades de Ac ou Ag Ensaios no competitivos utilizam excesso de Ac e mais sensvel H emisses radioativas com raios gama de marcadores de I5, que so mensurados em contagem por minuto Podem ser usados I, H3, C14, P32

Radioimunoensaio competitivo 1 mtodo

Radioimunoensaio Competitivo 2 mtodo

RIA no competitivo

Radioimunoensaio
Vantagens 1. Preciso e alta sensibilidade 2. Facilidade de conjugao do istopo 3. Deteco dos sinais sem otimizao 4. Estabilidade contra interferncia do ambiente do ensaio Desvantagens 1. Vida mdia curta dos reagentes 2. Necessidade de proteo contra os efeitos da radioatividade

Imunoensaios enzimticos

Usam enzimas como marcadores Mais utilizados: ensaios imunosorventes enzima-ligados (ELISA), enzimaimunoensaios (EIA), tcnica de imunoensaio enzimtico multiplicado (EMIT)

Imunoensaios enzimticos

EIAs Heterogneos Peroxidase do rbano silvestre, fosfatase alcalina, beta galactosidase, glicose oxidase, urease, catalase Podem ser competitivos e no competitivos Utilizados para determinao de antgenos de hormnios, marcadores tumorais, protenas plasmticas e agentes infecciosos Ensaios indiretos so utilizados para mensurao de anticorpos de agentes infecciosos e para autoanticorpos Medidos por imunoensaio colorimtrico, imunoensaio enzimtico fluorescente, imunoensaio enzimticos quimioluminescentes

Imunoensaios enzimticos
Imunoensaios enzimticos homogneos Sensibilidade um pouco inferior s dos RIAs Sistemas de ensaios so rpidos e simples Interao entre Ag-Ac modula a atividade da enzima ou do marcador Podem ser ensaios de ligao competitiva (antgenos enzima marcados) e no competitiva (anticorpo marcado com a enzima)

Imunoensaios enzimticos
Vantagens 1. Os reagentes so relativamente baratos e podem ter uma meia vida longa 2. Mltiplos ensaios podem ser realizados simultaneamente 3. O equipamento pode ser de baixo custo e amplamente disponvel 4. No h riscos de radiao durante a marcao ou eliminao dos detritos 5. Adaptao automao de um EIA rpida e simples 6. EIA homogneo pode ser desenvolvido para haptenos e protenas

Desvantagens 1. A mensurao da atividade enzimtica pode ser mais complexa do que a mensurao da atividade de alguns tipos de radioistopos 2. A atividade da enzima pode ser afetada pelos constituintes plasmticos 3. EIAs homogneos foram desenvolvidos para grandes molculas de protenas mas exigem reagentes imunoqumicos complexos

Imunoensaios Fluorescentes

Emprego de compostos fluorescentes como marcadores imunoqumicos para deteco de antgenos O marcador fluorescente deve ser estvel e apresentar uma alta capacidade absortiva e um bom rendimento quntico, emisso de comprimentos de onda adequados alm de no interferir com as reaes ligante-anticorpos Marcador padro: isotiocianato de fluorescena Vrios FIAs podem ser classificados: 1) heterogneos e homogneos; 2) ligante ou anticorpo marcado; 3) competitivo ou no competitivo; 4) fase slida ou no slida

Imunoensaios Fluorescentes
Mtodo: O analito reage com o excesso de anticorpos marcados na soluo na soluo Usados para mensurao de protenas sricas e hormnios, incluindo imunoglobulinas, cortisol, progesterona e tiroxina

Imunoensaio Quimioluminescente
Utilizam molculas geradoras de quimioluminescncias como marcadores Ex:derivados do luminol, steres acridina ou derivados do nitrofenil oxalato e rutnio tri-bipridil A gerao de luz exige OH- e H2O2 como ativador qumico ou H2O2 com peroxidase como ativadores da quimioluminescncia IMMULITE PRISM AXSYM

OBRIGADA
natzaidanm@yahoo.com.br