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Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos

permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una va metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no. Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de mltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio. Adems estudiaremos los resultados que estos test arrojan, comparando resultados experimentales entre los distintos grupos de trabajo de nuestro laboratorio.

Batera de Pruebas Bioqumicas Aqu estn algunas de las Pruebas Bioqumicas ms frecuentes: Fermentacin de la lactosa (Mc Conkey) Agar Hierro de Kliger (KIA) Prueba del Indol Citrato de Simmons Agar Hierro Lisina (LIA) Agar Urea de Christiansens Prueba de la Fenilalanina (PPA) Reduccin de los Nitratos Movilidad RM - VP Oxidasa y Catalasa

TINCION DE GRAM

GRAM NEGATIVAS

GRAM POSITIVAS

TINCIONES ESPECIALES

TINCION DE TINTA CHINA PARA LA DEMOSTRACION DE CAPSULA

AISLAMIENTO
Medios de cultivo: A.S, MaC,V.B,CHOC. Atmsfera de Incubacin:O2, CO2, AN O2 Temperatura de incubacin:37C,42C Tiempo de incubacin: 24 a 48 hrs, 48 a 72 hrs, 3 a 8 sem.

IDENTIFICACION PRIMARIA
Tincion de Gram Morfologa (bacilo, coco, cocobacilo o espiral) Crecimiento o no en el medio MacConkey

Catalasa y oxidasa

IDENTIFICACION SECUNDARIA

OTRAS PRUEBAS
* * * * * * * INMUNODIFUSION AGLUTINACION EN PLACA COAGLUTINACION FIJACION DE COMPLEMENTO ELISA INMUNOFLUORESCENCIA BIOLOGA MOLECULAR

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS


Se utilizan para tomar decisiones teraputicas Estudios epidemiolgicos sobre resistencia Debe ser el complemento del aislamiento de un agente bacteriano sobre todo cuando es difcil predecir su sensibilidad.

tincin gram (cultivo fresco) forma agrupacin crecimiento aerobio crecimiento anaerobio esporas movilidad catalase oxidase fermentacin de glucosa a acido oa acido+gas O/F

+ coco racimos + +

+ coco racimos +

+ coco cadenas +

+ coco tetradas +

+ bastn

+ bastn

+ bastn

+ bastn

bastn

bastn

bastn

bastn

coco pares

+ + +o +

+ +o + +

+ +o + +

+ + +

+ +

+ + +o

+ + +o +

+ +o+

+ + + +

+ (o )

Micrococcus
Staphylococc us Streptococcu s Lactococcus Enterococcu s Leuconostoc Pediococcus

X
X X X X X X X

Aerococcus
Lactobacillus Clostridium Bacillus Alcaligenes Pseudomona s Enterobacte rias Aeromonas Chromobact erium Neisseria

X
X X X X X X X X X X

Fermentacin de la lactosa (Mc Conkey)


El agar Mc Conkey es un medio slido, diferencial y selectivo. Se usa para la discriminacin de bacterias con capacidad de fermentar la lactosa (Lac + y ).Composicin g/l : - Peptona 20.0 : fuente de nitrgeno y carbono para las Lac -. - Lactosa 10.0 : fuente de carbono para las Lac +. - Sales biliares 2.5 : le confiere carcter selectivo, inhibiendo el crecimiento de Gram +. - Cloruro sdico 5.0 : para mantener la tonicidad del medio (evitar osmosis). - Rojo neutro 0.05 : indicador que va hacer que el medio vire de coloracin. Si las bacterias son Lac +, producirn cidos derivados de la fermentacin que darn al medio un aspecto rosceo; si por el contrario son Lac -, el medio se basificar por el uso de la peptona y se tornar amarillo. - Cristal violeta 0.001 : interfiere junto con las sales biliares en la selectividad del medio. - Agar-agar 15.0: da consistencia al medio.

Prueba de la Oxidasa y la Catalasa Ambas pruebas se caracterizan por poder realizarse de forma inmediata a partir de nuestro cultivo problema. La oxidasa, es una prueba que se usa para poner de manifiesto el sistema citocromoxidasa, que se encuentra en organismos aerobios, anaerobios facultativos y ocasionalmente en microaerfilos, careciendo los anaerobios estrictos de esta. El mtodo ms frecuento es el indirecto, se realiza en un trocito de papel de filtro, de forma que colocamos una gota del reactivo de Kovacs en el papel y posteriormente tomamos parte de nuestra colonia con el asa de siembra, que frotaremos sobre el papel. El resultado ser positivo se se produce una reaccin de color a los pocos segundos. La catalasa, va a degradar el peroxido de oxigeno que se produce como consecuencia de la acumulacin de oxigeno. Para esto en un tubo de ensayo colocamos 2 o 3 ml de peroxido de oxigeno, tomamos muestra con el asa de siembra y la introducimos en el tubo, el resultado ser positivo si se observa la produccin de pequeas burbujas

Microbiologa Pruebas Bioqumicas

Prueba de la Oxidasa
El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa. Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a prpura.

Con un pequeo papel de filtro aadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30 segundos, observamos si ha ocurrido algn cambio. Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo. Se considera positiva esta prueba cuando toma un color prpura la muestra.

(+) Pseudomonas aeruginosa ( - ) Escherichia coli

El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa El perxido de hidrgeno se produce al utilizar la bacteria el azcar por va oxidativa. Al ser ste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la produccin de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + O2). Prodecimiento: Agregamos aproximadamente 5 ml. de perxido de hidrgeno al 3% a un tubo de ensayo previamente esterilizado a continuacion tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercrse a la muestra de la solucion liquida de perxido de hidrogeno y debemos observar la reaccin de esta.

La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxgeno. Resultados: (+) Staphylococcus aureus ( - ) Streptococcus spp.

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de aglutinacin de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del genero Staphylococcus. Procedimiento: Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayo con algodn hidroflico y lo llevamos a bao Mara a 37 C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.

Resultados: Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles: 1: pequeos cogulos no organizados 2: pequeos cogulos organizados 3: gran cogulo organizado 4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo. Se consideran positivos los niveles 3 y 4. (+) Staphylococcus aureus ( - ) Staphylococcus epidermis. Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine Motilidad-Indol-Ornitina) Esta prueba bioqumica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reaccin de Indol a la descarboxilacin de la ornitina. Procedimiento: Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37 .

Prueba TSI (Triple Sugar Iron Triple Azcar Hierro)


El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambien permite la identificacin de la produccin de SH2. Esta es una prueba especfica para la identificacin a nivel de gnero en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:
bacterias fermentadoras de la glucosa bacterias fermentadoras de la lactosa bacterias fermentadoras de sacarosa bacterias aerognicas bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgnicas que contengan azufre.

Prodedimiento: Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos. Resultados: Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentacin de azucares. Caracterstica de bactrias no fermentadoras como Pseudomonas sp. Pico alcalino/fondo cido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp. Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de cido sulfhdrico. Salmonela spp. Pico cido/fondo cido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli. A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas.

Prueba LIA (Lysine Iron Agar Agar Lisina Hierro)


Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilacin o desaminacin de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es ms sensible que el TSI para la deteccin de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros. Procedimiento: Inocular en forma de estra las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37 .

Pruebas Bioqumicas IMViC: Agar Citrato La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias. La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

Procedimiento: Se inocula el agar inclinado en una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C durante 4 das. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje del indicador al azul. Resultados: (+)Klebsiella spp. ( - ) Escherichia Coli

Indol
El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del pdimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano. Procedimiento: Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.

Resultados: (+) Escherichia coli ( - ) Klebsiella pneumoniae

PRUEBA DEL INDOL Pone de manifiesto la presencia de la encima Triptofanasa en nuestras bacterias, si esta presente degradar el triptofano y liberar al medio Indol, para revelar su presencia usaremos el reactivo de Kovac; si hay indol se formar un anillo rojo en la superficie, sino este ser amarillo. Para esto sembramos en caldo con triptofano.

Rojo Metilo
Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta.

Procedimiento: Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la produccin de cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo ferment la glucosa por la va de cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. Resultados: (+) Escherichia coli ( - ) Enterobacter aerogenes

Rojo de Metilo - Voges Proskauer Las enterobacterias son anaerobios facultativos que usan la glucosa en dos fases: 1 Degradan la glucosa por la va oxidativa hasta que consumen el oxigeno del medio. 2 Metabolizan la glucosa por la va fermentativa, que puede ser de dos tipos: - Fermentacin cido mixta: los productos finales son cidos orgnicos, que disminuyen el pH del medio, lo que se manifiesta con el Rojo de metilo. - Fermentacin butiln-gliclica: los productos finales, como butanodiol y etanol, son neutros y producen como intermediarios acetoina, que puede detectarse con el reactivo de Voges Proskauer, el react. A que es KOH, y el B alfanaftol, estos reaccionan con la acetoina originando coloraciones violceas. Para realizar el ensayo, dividimos el medio inoculado y que ha incubado tres das en dos tubos (la mitad en cada uno) y revelamos con los reactivos.

Agar Hierro de Kliger (KIA)


El agar Hierro de Kliger (KIA), es un medio slido y diferencial. El fundamento se basa en la capacidad de fermentacin de dos azucares (glucosa y lactosa), en la produccin de c. sulfhdrico y en la produccin de gas. Composicion g/l: Extracto de carne 3.0 Extracto de levadura 3.0 Peptona 20.0 Lactosa 10.0 Glucosa 1.0 Cloruro sdico 5.0 Citrato frrico amnico 0.5 Tiosulfato sdico 0.5 : fuente de azufre, las bacterias lo reducen produciendo c. sulfhdrico (precipitado negro) Rojo de fenol 0.03 : indicador, si vira a rosceo , indica basicidad del medio, si es amarillo indica acidificacin (derivada de c. de la fermentacin) Interpretacin del Kliger: NC o SC: no cambio o sin cambio LC, Alk o K : alcalinidad H2S o subndice s: si produce c. sulfhdrico G: productora de gas Ejemplo: A/As indica que es fermentador de glucosa, lactosa y productor de sulfhdrico

Citrato de Simmons
Se usa para determinar si el organismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono y compuesto amoniacales como nica fuente de nitrgeno. El medio contiene citrato sdico, fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador; este se tornar azul cuando el medio se basifica. Las bacterias que metabolizan el citrato liberan iones amonio al medio (degradacin del fosfato amnico) lo que provoca que este se alcalinice y el indicador vire azul.

Cit + cit -

Agar Hierro Lisina (LIA) Este medio pone de manifiesto: - Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa (LDC). el medio contiene como indicador Purpura de Bromocresol, cuando la lisina se descarboxila, el medio se acidifica y el indicador vira amarillo en el fondo. - Si es productora de c. sulfhdrico, en cuyo caso el precipitado negro nos impedir ver si es LDC + o -. - Si es productora de gas.

Reduccin de Nitratos Va a poner de manifiesto la capacidad de transformar los Nitratos en Nitritos. Para esto inoculamos tres tubos en el medio para dicha prueba y los incubamos 24, 49 y 72 horas respectivamente. Tras 24 h. aadimos 2 o 3 gotas del reactivo "A-B", si aparece coloracin rojo cereza indica que es positivo, si no aparece coloracin es un presunto negativo, para confirmarlo basta con aadir una punta de esptula de Zinc y si realmente es negativo se tornara rojo. Si el ultimo da (72 h.) la bacteria da negativo, entonces podemos decir con seguridad que no tiene capacidad para reducir los nitratos.