FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

TEMA: MEDIOS DE CULTIVO

RAFAEL CAMPOS HENRY

EL MEDIO DE CULTIVO

 HISTORIA:
El desarrollo histrico de la formulacin medio de cultivo se inicia con la definicin de la solucin nutritiva de Knop. 1902: Medio de cultivo de Haberlandt. 1934: Medio de cultivo de Gauttheret. 1943: Medio de cultivo de White. Dcada de los 50: define la relacin de los minerales usados en los cultivos actuales. 1962: se formulan el medio de cultivo MS (Murashige & Skoog) 1968: se formulan el medio de cultivo B5 (Gamborg et al).

Componentes del medio de cultivo

1. COMPONENTES INORGNICOS: Agua Sales minerales (macronutrientes y micronutrientes) 2. COMPONENTES ORGNICOS: Vitaminas Carbohidratos Aditivos orgnicos complejos Aminocidos. Reguladores de crecimiento Agar

COMPONENTES INORGNICOS
AGUA
Mayor componente utilizado. Es necesario su destilacin, deionizacin o desmineralizacin. Las impurezas son inhibidores de los cultivos. Su adecuada purificacin se alcanza utilizando filtros de carbn activado, columnas de intercambio inico y filtros de acetato de celulosa del tipo Milli - Q

SALES MINERALES: El medio basal

MACRONUTRIENTES O MACROELEMENTOS:
El medio basal debe incluir macronutrientes C, H, O, P, K, N, S, Ca y Mg. Su incorporacin esta en una concentracin mayor a 30 ppm (mg/l) NITRGENO

Macronutriente que mas influye en el crecimiento y desarrollo de los cultivos in vitro Absorbido en sus dos mayores formas inicas: catin(NH4 +) y anin (NO3- y NO2-) Cuando el N es asociado en forma de sales inorgnicas de amonio las clulas muestran sntomas de toxicidad pero al asociarse al N en forma de nitrato se estimula el crecimiento celular. El N en forma de nitrito provoca sntomas de toxicidad a partir de 1.1 mM y resulta completamente inhibitorio a partir de 10.8 mM. En pocos casos otras fuentes de N como urea, casena hidrolizada, glutamina, alanina y acido amino butrico puede reemplazar a al nitrato o amonio.

 Fsforo
Segundo macronutriente en importancia Absorbido primariamente como anin fosfato monovalente (H2PO4-) y menos rpidamente como anin fosfato divalente (H2PO42-) En el medio basal es incorporado como fosfato de potasio monobsico (KH2PO4) 1.25 mM El P es una parte esencial de azucares fosfatados que participan en la fotosntesis, respiracin, y otros procesos metablicos; tambin es parte de ARN y ADN y fosfolpidos presentes en las membranas. Juega un rol importante en el metabolismo de la energa ya que esta presente en ATP, ADP, AMP y Ppi Su deficiencia en el medio puede ser rpida debido a su rpida absorcin e interaccin con otros componentes como Fe, K, y sacarosa . Su absorcin es influencia por la presencia de otros minerales.

 Potasio
Es incorporado como ion acompaante de nitratos, fosfatos y en algunos casos cloruros. En el medio basal el K+ es suministrado a una concentracin de 20mM Activador de muchas enzimas esenciales para la fotosntesis y la respiracin y activacin de enzimas para formar almidones y protenas. Contribuye a establecer el potencial osmtico y su presin de turgor.

 Azufre Es absorbido como ion sulfato divalente (SO42-), acompaante del macronutriente Mg y de los micronutrientes Zn y Mn. Su importancia radica en la constitucin de protenas , especficamente de aa cistena y metionina, las vitaminas tiamina y biotina, as como la coenzima A Esencial para la respiracin y la sntesis y ruptura de cidos grasos

 Magnesio Es absorbido como ion divalente (Mg 2+) y adicionado en forma de sulfato de magnesio Se ha establecido una relacin antagnica con el Ca : Ca 0.5 a 1.2 mM - Mg 1.5 mM o Ca 2.1 mM - Mg 3 mM Importante por su presencia en la clorofila y en las rutas metablicas que utiliza ATP como factor de traslacin. Cofactor y activador de muchas enzimas en la fotosntesis, respiracin y formacin de ADN y ARN.

 Calcio

Es absorbido como ion divalente (Ca 2+) En el medio basal MS es incorporado en forma de cloruro a 3.0mM Como su transporte por el xilema depende de la transpiracin de la planta las condiciones de alta humedad en el aire del cultivo in vitro puede producir su deficiencia en los pices de los brotes provocando necrosis apical. Esencial para el normal funcionamiento de las membranas en todas las clulas Formacin de la pared celular Actualmente se conoce que en el citosol el calcio establece una relacin de reversibilidad con la calmodulina que activa diversas enzimas

 Fierro nico elemento mineral esencial que no es absorbido como ion libre en el medio de cultivo. Ocupa la posicin media entre los micro y macronutrientes Usualmente es incorporado en la forma de quelato de fierro con etileno diamino tetracetico (EDTA) o el sequestrone. Es esencial porque forma parte de ciertas enzimas y muchas protenas que llevan electrones durante la fotosntesis y respiracin. La carencia de Fe resulta un incremento del contenido de ADN y a.a libres y reduccin de ARN .

Micronutrientes o microelementos: Los micronutrientes que deben incorporarse al medio basal son B, Zn, Mn, Cu, Mo, Co, Cl, I y recientemente se ha destacado el rol del Ni. Su incorporacin esta en una concentracin menor a 30 ppm (mg/l)

Manganeso Absorbido ampliamente como Mn 2+ Juega un rol estructural en el sistema de membranas del cloroplasto su ausencia causa desorganizacin de los tilacoides y aun cuando es escaso su efecto en la estructura del ncleo y mitocondria El ion Mn 2+ activa numerosa enzimas pero tambin inhibe el metabolismo nitrogenado Es cofactor de AIA oxidasa.

 Molibdeno
Es incorporado como sales de molibdato (MoO4 2 +) su mejor funcin es ser parte de la enzima nitrato reductasa, reduce iones nitrato a iones nitrito. Juega un rol importante en la ruptura de las purinas como adenina y guanina por su esencialidad en la enzima xantina dehidrogenasa. Parte esencial de una oxidasa que convierte el acido abscisico aldehdo en abscisico (ABA)

 Cobalto Incorporado como sal de cloruro en el medio basal MS No parece ser necesario cuando el medio tiene N en forma de nitrato y amonio No es inhibitorio usado a altas concentraciones (0.4mM) Es cofactor de la vitamina B12 y de la DAHP sintasa del citoplasma

 Iodo Incorporado en el medio basal MS como KI Funcin poco conocida Accin estimulatoria en el crecimiento de explantes in vitro

Boro Es casi totalmente absorbido en forma de H3BO3 Su deficiencia provoca fracaso en la elongacin normal del pice radicular y la inhibicin de la sntesis de ADN y ARN Esencial en la funcionalidad, integridad y permeabilidad de las membranas; influye en la absorcin del fosforo y la glucosa. Estimula la actividad de la AIA - oxidasa

 Cloro Es absorbido como ion cloruro Cl En el medio basal MS es incorporado como sales de Cloruro de calcio y cloruro de cobalto. Funciones importantes como estimular la oxidacin del agua durante la fotosntesis as como la divisin celular en las hojas y races y un importante soluto osmticamente activo Tanto el Cl como el Na se incorporan en el medio basal durante el ajuste del pH en forma de HCl o NaOH

 Zinc Es absorbido como ion divalente Zn 2+ En el medio basal MS ingresa como sal de sulfato. Es importante porque participa en la formacin de la clorofila o previene su destruccin Requerido en la produccin de acido indolacetico y esta estrechamente ligado a muchas enzimas celulares actuando como cofactor de la pptidasa

Cobre Es absorbido como ion cprico divalente Cu 2+ o como ion cuproso monovalente Cu+ Es incorporado como sal de sulfato Esta presente en diversas enzimas o protenas que participan en el proceso de oxidacin y reduccin ejemplo la citocromo oxidasa y la plastocianina

 Nquel No es considerado en la composicin del medio basal Esencial para las plantas especficamente formando parte de la enzima ureasa que por hidrolisis cataltica de la urea la desdobla en CO2 y NH4 + .

COMPONENTES ORGNICOS Carbohidratos

generalmente los medios no tienen condiciones optimas de iluminacin, concentracin de CO2, y tenores de clorofila, es por esto que se les debe adicionar azucares como fuente exgena de energa metablica y esqueletos carbnicos, que brindaran el crecimiento de las clulas. sacarosa.- el ms usado en concentraciones de 3%, a veces es posible usarlo en concentraciones altas de 12-18% Glucosa.- no es tan eficaz como la anterior pero a mostrado xito en propagacin y embriognesis somtica del algodn. Azucares reductores (hexosas).- como celobiosa, maltosa y rafinosa en determinados cultivos son mejores que la sacarosa.

Otros compuestos orgnicos, como cidos orgnicos y alcoholes no son exitosos cuando se usan como fuentes de carbono, aqu estn por ejemplo el manitol y el sorbitol. Cultivos fotomixotrficos pueden satisfacer sus necesidades de carbn tanto por suplementos de carbohidratos como de CO2, hay suspensiones celulares que podemos mencionar como: Datura inoxia, Glycine max, Nicotiana tabacum.

Vitaminas

Es necesario la incorporacin de vitaminas a medios para que los explantes crezcan y se vuelvan verdes. Las usadas con mas frecuencia y conocidas son: tiamina, cido nicotnico, y piridoxina. Tiamina.- en forma de tiamina-pirofosfato es un factor esencial en la reaccin de respiracin aerbica, fotosntesis y biosntesis de algunos aminocidos terpenoides. Piridoxina.- acta en la biosntesis de aminocidos durante la foto respiracin. cido nicotnico.- biosntesis de alcaloides

Mio-inositol
Generalmente esta agrupado en el grupo de las vitaminas, es un compuesto de hexitol o compuesto cclico. Ha sido utilizado como componente obligado en todo medio y a una concentracin alta. Estimulador en el crecimiento de callos y la formacin de brotes . Es tambin incorporadas a molculas de fosfolpidos que constituyen la membrana plasmtica y otras membranas celulares. Acta en la conjugacin de las auxinas.

AMINOACIDOS

Aminocidos individuales Casena hidrolizada Extracto de levadura

Sustancias complejas y otros aditivos orgnicos

Hay muchas sustancias en el uso de los cultivos de tejidos que forman parte de los medios entre ellas tenemos: Agua de coco.- su primera utilizacin fue en embriones de zanahorias desde ah se usa en numerosas especies y estimulando a diferentes sistemas, estimula el crecimiento de los callos de tabaco, divisin de granos de polen en Brassica. Es una sustancia compleja constituida por una amplia variedad de componentes orgnicos e inorgnicos.