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ESPECTROFOTOMETRIA

Definicin

Mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones biolgicas

El espectrofotmetro

Es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia

ESPECTROFOTOMETRO
Un espectrofotmetro tpico posee cuatro componentes bsicos:

una fuente de radiacin que tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que cubre ( usualmente es lmpara de tungsteno para luz visible,y deuterio para ultravioleta), un compartimiento para la muestra, un monocromador que separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra, y un fotodetector, que mide cuantitativamente la radiacin que pasa por la muestra.

Concepto de onda

Espectro Visible

Es una regin muy estrecha pero la ms importante, ya que nuestra retina es sensible a las radiaciones de estas frecuencias. A su vez, se subdivide en seis intervalos que definen los colores bsicos (rojo, naranja, amarillo, verde, azul y violeta).

LEY DE LAMBERT - BEER


Relaciona la absorcin de luz con las propiedades del material atravesado. La ley explica que hay una relacin entre la transmisin de luz a travs de una sustancia y la concentracin de la sustancia, as como tambin entre la transmisin y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos l y A, la concentracin de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida.

A = xcxl
Donde: A = absorbencia = Coeficiente de extincin molar. l = longitud de la celda.

COEFICIENTE DE EXTINCIN MOLAR

Es una medida de la cantidad de luz absorbida por unidad de concentracin. Un compuesto con un alto valor de coeficiente de extincin molar es muy eficiente en la absorcin de luz de la longitud de onda adecuada y, por lo tanto, puede detectarse por medidas de absorcin cuando se encuentra en disolucin a concentraciones muy BAJAS.

CURVA PATRN

Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo la albmina srica bovina) que se utiliza para determinar la cantidad de protenas presente en una muestra incgnita. En determinaciones colorimtricas, se cumple una relacin proporcional entre la magnitud o intensidad de color que da una reaccin y la cantidad del reactivo que la provoca. La intensidad de color se mide con un espectrofotmetro o colormetro en funcin de las concentraciones crecientes de la sustancia se obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad de protena, mayor cantidad de producto de reaccin y por lo tanto, mayor intensidad de color.

CURVA PATRON

CUANTIFICACIN DE PROTENAS
Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para otros muchos propsitos.

Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se basan en:
la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, para la formacin de derivados qumicos, o la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes.

BRADFORD

Se basa en la unin de un colorante, Comassie Brillant Blue G-250 a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.