CLONACION MOLECULAR

Tema 7.4 Presenta: Maritza Payan Parra 197446

RESULTADOS DE APRENDIZAJE

Comprende y explica los elementos y fundamentos de la clonacin molecular. Explica los procedimientos bsicos para la clonacin molecular. Conocer y discutir aplicaciones de la clonacin molecular en diferentes campos y actividades humanas.

ERRORES FRECUENTES
Confundir la accin de las enzimas que participan en la clonacin. No comprender el procedimiento de la clonacin molecular.

CLONACION DEL DNA

Comporta la separacin de un gen especifico o de un fragmento de DNA de un cromosoma mucho mayor y su unin a una pequea molcula de DNA portador, para despus replicar este DNA modificado miles o millones de veces, mediante el aumento del numero de clulas y la creacin de mltiples copias del DNA clonado en cada clula.

ELEMENTOS

Segmento de DNA Vector Plasmido Porcin del genoma de un virus bacteriano (l) Clula Enzimas

ENZIMAS UTILIZADAS EN LA TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE

ENZIMA Endonucleasas de restriccin tipo II DNA ligasa DNA polimerasa I (E. coli) Transcriptasa inversa Polinucleotido quinasa FUNCION Cortan el DNA en secuencias especificas Une dos molculas o fragmentos de DNA Rellena los huecos en el DNA duplex por adicin secuencial de nucletidos en los extremos 3` Hace una copia del DNA a partir de una molcula de RNA Aade un grupo fosfato al grupo OH del extremo 5`de un polinucletido para marcarlo o para permitir su ligacin Aade colas homopolimericas al grupo OH del extremo 3`de un duplex lineal

Transferasa terminal

Exonucleasa III
Exonucleasa del bacterifago l Fosfatasa alcalina

Elimina nucletidos de los extremos 5`de una hebra de DNA

Elimina nucletidos de los extremos 5`de un duplex para exponer los extremos 3`monohebra Elimina fosfatos terminales tanto del extremo 5`como del 3`(o de ambos)

TIPOS DE ENDONUCLEASAS
Las del tipo I cortan el DNA al azar.* - Las de tipo III cortan el DNA a unos 25 pb de la secuencia de reconocimiento.* - Las de tipo II no necesitan ATP y cortan el DNA en la misma secuencia de reconocimiento. * Se mueven a lo largo del DNA mediante un mecanismo que requiere ATP
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ESQUEMA BASICO
Vector + Fragmento de DNA
DNA Recombinante Replicacin del DNA recombinante dentro de las clulas husped Aislamiento, secuenciacin y manipulacin del fragmento de DNA purificado

CLONACION EN E. coli

E. coli fue el primer organismo utilizado y todava es la clula husped mas comn. Tiene muchas ventajas: Se conoce bien el metabolismo de su DNA. Muchos vectores de clonacin que se encuentran asociados de manera natural, estn bien caracterizados Se dispone de tcnicas efectivas para la transferencia de DNA de una bacteria a otra.

INTERACCION DE LA ENDONUCLEASA DE RESTRICCION EcoRV CON SU SECUENCIA DIANA

Se muestra la enzima unida a los productos de corte de DNA en la secuencia reconocida por la endonucleasa. La protena se ha eliminado y el DNA se ha rotado 180. La enzima crea extremos romos. tomos de Mg en naranja.

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Cortar el DNA en lugares determinados. Las endonucleasas especificas de secuencia (endonucleasas de restriccin) hacen las veces de tijeras moleculares. Seleccin de una pequea molcula de DNA capaz de autoreplicarse. Vectores de clonacin (plsmidos o DNA vrico). Unin covalente de dos fragmentos de DNA: La ligasa une el vector de clonacin y el DNA que se desea clonar. Traslado del DNA del tubo de ensayo a una clula husped que proporcionara la maquinaria enzimtica necesaria para la replicacin. Seleccin o identificacin de las clulas husped que contienen DNA recombinante.

CORTE DE MOLECULAS DE DNA MEDIANTE ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION.

Los fragmentos pueden ligarse a un plasmido

CORTE DE MOLECULAS DE DNA MEDIANTE ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

Un fragmento sinttico de DNA que contenga las secuencias de reconocimiento de varias endonucleasas de restriccin se puede insertar en un plsmido tratado previamente con una endonucleasa de restriccin

DISEO DEL PLASMIDO pBR322

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Posee un origen de replicacin, en el cual las enzimas celulares inician la replicacin (10-20 copias por clula) Contiene dos genes que confieren resistencia a antibiticos. Varias secuencias nicas de reconocimiento para diferentes endonucleasas suministran los sitios donde cortar para insertar las secuencias de DNA forneo. Su pequeo tamao facilita su entrada en la clula y la manipulacin bioqumica del DNA.

CLONACION E IDENTIFICACION DE DNA FORANEO EN E. coli

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pBR322 se corta en el elemento de resistencia a ampicilina. El DNA forneo se liga al pBR322 cortado. Si tiene xito, el elemento de resistencia a la penicilina es inactivado. Se transforman las clulas de E. coli. Despus se cultivan en placas de agar que contienen tetraciclina para seleccionar aquellas que han incorporado el plsmido. Las colonias individuales se transfieren a posiciones equivalentes de placas adicionales. Una placa contiene tetraciclina y la otra ampicilina.

Los plasmidos recombinantes se agregan a un cultivo bacteriano que se trato antes con iones de calcio. Se someten a un breve golpe de calor y las bacterias se estimulan para que capten el DNA del medio. El plasmido se replica en forma autnoma en la clula receptora y se pasa a la progenie durante la divisin celular.

CLONACION DE DNA EUCARIOTA EN GENOMAS DE FAGOS

El DNA digerido se fracciona por electroforesis en gel o centrifugacin con gradiente de densidad y los fragmentos de 20 kb de largo (aprox) se incorporan

EL FRAGMENTO LAMBDA
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El DNA se empaca bien en una forma que es facil de almacenar y extraer. Todo paquete que contenga un DNA recombinante es capaz de infectar una celula bacteriana. Una caja Petri puede contener mas de 100,000 placas diferentes.

EL CROMOSOMA ARTIFICIAL BACTERIANO

Puede aceptar grandes fragmentos de DNA (hasta 500 kb) Son plasmidos bacterianos especializados

EL CROMOSOMA ARTIFICIAL DE LEVADURA

Puede aceptar segmentos de DNA de hasta 1000 kb Son versiones artificiales de un cromosoma artificial de levadura

APLICACIONES

El 24 de febrero de 1997 el Instituto Roslin, de Escocia, se anuncia la reproduccin con xito de la oveja "Dolly". En julio de 1997 los mismos cientficos que haban clonado a "Dolly" produjeron el cordero "Polly" que porta genes humanos. En noviembre de 2001 la empresa Advanced Cell Technology (ACT) consigui clonar el primer embrin humano de la historia, aunque su desarrollo se detuvo de forma natural cuando slo contaba con seis clulas, mucho antes de alcanzar la fase de blastocito, necesaria para obtener las llamadas clulas madre. El objetivo era el de obtener clulas madre para la investigacin de terapias gnicas. En enero 2002, la empresa escocesa PPL Therapeutics anuncia el nacimiento de unos cerditos, a los que se les pudo eliminar el gen que causa que el sistema inmunolgico del ser humano rechace transplantes de los rganos del cerdo.

En enero de 2002, los creadores de la oveja Dolly, anuncian que el animal sufre artritis, por el envejecimiento prematuro que padece, a sus cinco aos de edad. En febrero de 2002 un equipo investigador que haba clonado una docena de ratones inform de que ninguno de ellos logr sobrevivir. Adems un equipo investigador japons llam la atencin sobre la mayor frecuencia de abortos, deformidades, sobrepeso y muertes prematuras entre otros animales que haban sido clonados. Tambin en febrero de 2002, la Universidad A&M de Texas present el primer gato clonado del mundo, un cachorro de dos meses de edad al que llamaron "CC", siglas de "copia al carbn". Segn los cientficos "los gatos tienen una forma felina del sndrome de inmunodeficiencia humana que es un buen modelo para el estudio del sida humano". En noviembre de 2002 el experto italiano en fertilidad Severino Antinori dice que espera que una paciente d a luz un beb clonado en enero de 2003.

RATONES TRANSGENICOS

Se muestra un par de hermanos de la misma camada de 10 semanas de edad. El mas grande se desarrollo con un huevo inyectado con DNA + GH. El mas grande pesa 44 gr, y el pequeo 29 gr. El gen GH se transmiti a los descendientes.

BIBLIOGRAFIA

Nelson, D; Cox, M. LEHNINGER PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA. 4 edicion. Edit. Omega. Pags. 306317. Alberts y cols. BIOLOGIA MOLECULAR DE LA CELULA. 4 edicion. Ediciones Omega. Pags. 500504. Lodish y cols. BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. 5 edicion. Ed. Medica Panamericana. Pags. Karp, G. BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. 4 edicion. Edit. Mc Graw Hill. Pags. 822-835 http://laguna.fmedic.unam.mx/lenpres/CH29.ppt#286 http://cultura.terra.es/cac/articulo/html/cac1321.htm