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Bioensayo mediante la utilizacin de la lnea celular de hepatoma de rata H4IIE

Toms Schffer Navarro (MV)

septiembre 2010

Introduccin

El bioensayo de la lnea celular de hepatoma de rata


H4IIE, test in vitro que detecta y semicuantifica COPs, como son PCBs, PCDDs, PCDFs, en diferentes matrices actividad EROD (Etoxiresorufina o -detilasa). a Resorufina (fluoresce)

Mide actividad cataltica del citocromo P450, mediante la La induccin del CYP1A permite oxidar la Etoxiresorufina

Lnea Celular H4IIE


Desde los aos 70, se reporta el uso de esta lnea celular
para este tipo de contaminantes (Benedict, 1973)

Deriva de la lnea Reuber Hepatoma H-35 (Reuber 1961 Sus principales caractersticas
son: Rpido crecimiento Baja actividad basal Altamente inducible Respuesta especfica a PCDD/F y DL-PCBs

Esquema de aplicacin del bioensayo H4IIE

Cultivo de Clulas H4IIE

Cultivo de Clulas H4IIE

Requerimiento
Fuente estable y consistente de clulas Alcuota Inicial de clulas ATCC (CRL-1548):
Criopreservada Libre de Mycoplasma arginini : comn en cultivos celulares efectos adverso:
Cambios en el metabolismo Cambios en el crecimiento celular Sntesis proteica Viabilidad Cambios en DNA y RNA Cambios morfolgicos

Cultivo de Clulas H4IIE

Requerimiento Las clulas H4IIE pueden ser fcilmente cultivadas de forma rutinaria si se cuenta con el equipamiento y componentes nutricionales necesarios para el cultivo de cualquier clula de mamfero:
Medio de mantencin definido Ambiente adecuado Cuidado rutinario

Cultivo de Clulas H4IIE


Medios de cultivo
Medio ATCC Medio esencial mnimo (Eagle) en solucin bsica de Earle 80% de aminocidos no esenciales 10% Suero Fetal Bovino (SFB) 10% Suero de Ternero Medio Tillit

(Tillit et al .,1991a)

Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) Aminocidos no esenciales Aminocidos esenciales Pyruvato D-glucosa NaHCO3 15% SFB

Cultivo de Clulas H4IIE

Medios de cultivo
Estos medios proveen de factores nutricionales, hormonales o de estroma necesarios para el crecimiento y desarrollo SFB conllevar a variaciones segn lote Suero Corresponde a una mezcla compleja de pequeas y grandes biomolculas con promotores del crecimiento fisiolgicamente balanceados y con actividades inhibidoras del crecimiento (Freshney, 1992). Aunque se sabe mucho sobre el rol nutricional de los componentes en el suero, sigue habiendo numerosos factores cuyas funciones fisiolgicas que no se entiende

Cultivo de Clulas H4IIE

Influencia Suero
Poco clara Alta precisin entre laboratorio bajo efecto Ejemplos: Disminucin en la actividad del CYP450 en medios libres de suero Metabolismo de drogas en CYP450 (ibuprofeno) PLHC-1 (Poeciliopsis lucida) disminucin en potencia relativa de TCCD, PCB77, PCB 126 y PCB 169 Biodisponibilidad de TCDD Utilizar una concentracin constante de suero

Cultivo de Clulas H4IIE

Influencia Suero
Utilizacin de medios libre de suero en el bioensayo y con suero durante el cultivo (poco utilizado) Desarrollo de un medio especfico para H4IIE libre de suero poco probable El uso de medios libre de suero implica:
Un mayor gasto Menor crecimiento celular Necesidad de un medio fisicoqumico ms estricto

Cultivo de Clulas H4IIE


Condiciones Ambientales y Pasaje celular

Incubadora humedificada 37C 5% de CO2

Contenedor celular (Easy flask) 75 cm2


Pasaje celular 4-5 dashasta 10disminuir el riesgo de desvo fenotpico, transformaciones, envejecimiento poblacional Cambio de medio: c/2-3 das

Sembrado Celular H4IIE

Sembrado Celular H4IIE

Las clulas H4IIE son sembradas en placas de cultivo para luego ser expuestas a extractos de contaminantes ambientales o a qumicos conocidos

Esto permite la adecuada rplica de muestras y un mayor numero de muestras a ser testeadas.

Sembrado Celular H4IIE

Originalmente se utilizaban placas de petri de 60-100 mm de dimetro o flask de cultivos pequeos (25 cm2) poco eficiente
Las placas de microttulos de pocillos mltiples(48-96) se utilizan en la actualidad

Sembrado Celular H4IIE

Ventajas:
Permite la rplica de muestras en la misma placa

Utilizan menos espacio en la incubadora para un mismo nmero de muestras a utilizar


Se necesita menor nmero de clulas y medio de cultivo tamao del pocillo Desde el punto de vista de seguridad y eliminacin volmenes mucho menores de contaminantes son necesitados para dosificar, logrando la misma concentracin de exposicin Ahorro en tiempo en el ensayo EROD fluormetro lector de placas de microttulo de multipocillos

Sembrado Celular H4IIE

Ya sea utilizando placa petri o placa de microttulo, se deben tomar las medidas necesaria para asegurar que el nmero de clulas sembradas sea el mismo en cada placa o pocillo del ensayo

Aunque se cuantifica la cantidad de protena celular para normalizar la lectura de la actividad de CYP1A lo mejor para disminuir la variabilidad es sembrar la misma densidad celular

Sembrado Celular H4IIE

Las caractersticas de crecimiento de las clulas son consistentes cuando crecen a la misma densidad y as la exposicin a la muestra al qumico es pareja Las clulas H4IIE se recolectan de flasks de cultivo utilizando tripsina y raspadores de clulas y se resuspenden en un medio para formar una solucin individual de clulas

Sembrado Celular H4IIE

Para determinar la concentracin celular hematocimetro o cmara de Neubauer


Si necesita aumentar la densidad se pueden centrifugar a baja velocidad (100-500 g) y luego resuspenderla en medio La densidad a sembrar depende de la superficie de la placa petri o la placa de microttulo Tiempo de incubacin: 24 horas

Sembrado Celular H4IIE

Protocolo
Esterilizar c/Luz U.V. 15 min y calibrar por 10 minutos Calcular el volumen de medio a utilizar con la siguiente formula Volumen Total=N de placas x 96 pocillos x 0,3 mL DMEM + 15% SFB Volumen

1.

2.

3.

DMEM=Volumen total/1.15, Volumen SFB= Volumen totalVolumen DMEM


4.

Retirar el medio de cultivo y lavar las clulas c/ PBS Tripsinizar c/ 4 mL de 0,1% tripsina Incube por 2 minutos

5.

Sembrado Celular H4IIE


6.

Protocolo Corta la tripsinizacin con 6mL DMEM+15% SFB Retirar las clulas (10 mL) tubo de centrifuga de 50 mL Lave el frasco contenedor de clulas con 10 mL DMEM+15% SFB y ubique los 10 mL en el tubo de centrifuga de 50 mL estril Cierre el tubo de centrifuga y agtelo en el vortex mixer

7.

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Sembrado Celular H4IIE

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Protocolo
Calcule la concentracin de clulas Cmara de Neubauer clulas/mL=Promedio n clulas x 10.000 Calcule el clulasN

11.

de clulas necesarias=96 x N placas x 12.000


12.

nmero

de

Luego dividamL de solucin

clulas/medio =(N de clulas necesarias/N de celulas contadas) x 2


13.

Hacer solucin de medio de cultivo

clulas +

Sembrado Celular H4IIE

Protocolo

14.

Siembre en microplacas c/ 300 L


Ponga en la campana un dispensador estril y llnelo con solucin clulas/medio No sembrar pocillo A5, A6 y A7 Incubar durante 24 horas a 37 C con concentracin de 5% de CO2

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Dosificacin de Extractos

Dosificacin de Extractos

La dosificacin se debe llevar a cabo utilizando tcnicas aspticas cmara de flujo laminar, al igual que en el cultivo y sembrado Solvente carrier Isooctano Se dosifica 2,5-100 L/pocillo con micropipetas con puntas de plstico o vidrio

Tiempo de incubacin24-72 h

Dosificacin de Extractos

El nmero de dosis a los cuales las clulas estn expuestas van en el rango de 6-10 preparadas con factores de diluciones de 3 a 10 veces

Un amplio rango de dosis debe ser utilizado para los extractos cuando no se conoce la mxima Induccin de CYP1A1 ni la pendiente

Dosificacin de Extractos

La precisa determinacin de los TCDD-EQs requiere que la dosificacin del extracto cubra todo el rango de induccin en las clulas H4IIE:
ED50no se sabe si no se conoce el mximo de induccin de la actividad CYP1A producida por el extracto Existen tcnicas para utilizar las curvas dosis-respuesta incompletas Las placas de microttulo permite obtener un mayor rango de dosis que las placas petri.

Dosificacin de Extractos

Dosificacin de Extractos

Producto de la naturaleza hidrofbica de PHH se a cuestiona el uso de puntas de platico:


No existen estudios con PHHs respecto a la prdida de estos compuesto al utilizar puntas de plstico
Heynstrand (2001) Micocisteina-LR se pierde un 4,2%, 4 veces se utiliza se satura Se ha utilizado pipetas con desplazamento positivo con un estilete (pistn) de acero inoxidable y tubos capilares de vidrio para disminuir este efecto poco prctico .

Dosificacin de Extractos

Solvente Carrier y para dilucin Isoocatno


Se sugiere que el solvente no sea ms del 0,5% del total de la solucin eliminar interferencias o toxicidad del solvente

Dosificacin de Extractos

Tiempo de Incubacin: 24 -72 h El tiempo de incubacin puede afectar la induccin del CYP1A1 en H4IIE especifica para cada qumco:
TCDD 6-72 h no existe influencia 2,3,7,8-TCDF >72 horas 9 veces ms PCB 77 >72 horas 11 veces ms

Esto es por el tipo de metabolismo de cada compuesto y el tiempo de incubacin

Dosificacin de Extractos

El tiempo de incubacin debe ser lo suficiente para permitir el mximo de induccin de CYP1A1 y evitar el metabolismo de los compuestos que inducen a CYP1A Tiempos: 24 h disminuye la influencia del metabolismo celular 72 h es el ms utilizado

Dosificacin de Extractos

Set de dosificacin: TCDD Controles: PC, PB, MB Basales Muestras

Dosificacin de Extractos

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Protocolo (TCDD x 3)
Ubique 8 viales para dosificar Tome 100 L del stock de TCDD y ubquelos en el vial 1, ubicado en el pocillo H1 Tome 70 L y ubquelos en l viales del 2 al 8 (de G1-A1). Realice diluciones seriadas hasta el vial 7 tomando 35 L del vial H1 Rotule las placas con TCDD donde corresponda. Dosifique 5 L en cada pocillo empezando de la columna 1, 5 o 9

Dosificacin de Extractos
1. 2. 3. 4. 5. 6.

Protocolo (Muestras) Ubique 8 viales para dosificar Tome 40 L del extracto y ubquelos en el vial 1, ubicado en el pocillo H1 Tome 30 L y ubquelos en l viales del 2 al 8 (de G1-A1). Realice diluciones seriadas hasta el vial 7 tomando 10 L del vial H1 Rotule las placas con el ID del extracto donde corresponda Dosifique 5 L en cada pocillo empezando de la columna 1, 5 o 9 Basales: Corresponden a pocillos de un espacio donde se dosificara una muestra, el cual no se dosifica. Esto se hace para determinar la actividad basal de las clulas. Se utilizan de 3-6 espacios en placas diferentes

Incubar por 72 h

Medicin de la Actividad Cataltica de CYP1A1

Medicin de la Actividad Cataltica de CYP1A1

A diferencia de la determinacin de la actividad de CYP1A1 por medio de la reaccin de AHH que resulta en mltiples productos, la reaccin EROD solo produce un producto resorufina

Medicin de la Actividad Cataltica de CYP1A1

Protocolos placas de microttulo = aumenta la celeridad y disminuye el costo bioensayo H4IIE muchas muestras a analizar Se realiza TODO en la placas:
Siembra Dosificacin Medicin actividad EROD Medicin protena celular

Medicin de la Actividad Cataltica de CYP1A1

La actividad EROD = la tasa de la detilacin de un sustrato ter fenoxano, 7-etxoxiresorufina (7-ER)Resorufina grupo hidroxilo libre (Whyte at al., 2000a) El bioensayo EROD H4IIE es una modificacin del mtodo de Pohl y Fouts (1980) se realizaba similar al bioensayo AHH en la actualidad la reaccin es llevada a cabo en la placa de microttulo, basados en el trabajo de Kennedy et al. (1993)

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Determinacin resorufina

UFA

de

Despus de la incubacin:
Lavado 2-3 veces c/ H2O destilada o PBS (pH 7.4) clulas vivas Lisis celular por shock osmtico agua destilada residual (20 uL) o por congelamiento rpido (-80C) y ciclo de descongelamiento.

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Determinacin UFA de resorufina Luego se agrega:


7-etoxiresorufina sustrato
Dicumarol como inhibidor de enzimas oxidoreductasa reducir resorufina o NADPH NADPH iniciar la reaccin

Todos estos reactivos deben estar a 37C

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Determinacin UFA de resorufina Medicin actividad enzimtica: Ensayo batch: en el cual la cantidad de resorufina producida es medida luego de un periodo de tiempo determinado (Clemons et al., 1996) Ensayo cintico: en donde la cantidad de resorufina producida es medida repetidamente con intervalos de 60 a 90 segundos (Tysklind et al., 1994)

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Determinacin UFA de resorufina Ensayos cinticos:


Mayor datos por muestra Asegura linealidad de la tasa de reaccin Aumenta la confianza en la validez de la estimacin EROD Fcil de llevar a cabo utilizando un scanner para placas de microttulo automatizada

La fluorescencia producto de la resorufina se lee con una longitud de onda de exitacin de 530 nm y una longitud de onda de 580 nm

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Estndar de resorufina:
Una curva de estndar de resorufina debe generarse cada vez que el bioensayo se lleva a cabo Se hace para comparar la intensidad de la fluorescencia de resorufina producida por clulas expuestas aextractos ambuentales Curva de multipuntos 0,06-40 pmol (7 punto) Las UFA de cada pocillo son convertidas a pmol de resorufina regresin lineal La resorufina stock utilizada se debe chequear con espectrofotometro absobancia = 571nm

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Estndar de protena:
Para estandarizar la tasa de produccin de resorufina (pmol/min) a la protena celular. Basado en la reaccin de fluorescamina con un grupo amino primario (Udenfriend et al., 1972) Adaptado por Lorenzen & Kennedy placa de microttulo mismo pocillo donde se determin la resorufina Curva de multipuntos 1,56-25 g/ pocillo 7 puntos A partir de albumina de suero bovino (BSA) La fluorescencia producto de la protena se lee con una longitud de onda de exitacin de 400 nm y una longitud de onda de 460 nm

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Determinacin protena celular


La protena celular es utilizada para normalizar la dosis de qumico al cual las clulas fueron expuestos pg TCDD/mg protena, adems de su uso en la normalizacin de la actividad cataltica de las mediciones EROD La determinacin de la protena no toma en cuanta el crecimiento celular durante el periodo de exposicin

Si el crecimiento se detiene por contacto inhibitorio, la estimacin de la protena va a ser similar en todos los pocillos, aun cuando si hubo diferencias en la concentracin de clulas al momento de sembrar aun as hay que sembrar una concentracin similar en todas los pocillos

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Protocolo Lectura EROD Saque una placa de la incubadora y lave las clulas (3 lavados por pocillo) Incube las clulas por 5 min Saque las clulas de la incubadora y:
agregar 20 L de dicumarol a cada pocillo de la microplaca, repetir en pocillos A1, A2 y A3 agregar 20 L de etoxyresorufina a cada pocillo de la microplaca agregar 20 L de NADPH a cada pocillo de la microplaca, menos en pocillos A1, A2 y A3

4.

Poner la placa en el fluormetro con el protocolo que corresponda:


filtro de excitacin: 530 nm filtro de emisin: 580 nm 20 ciclos de 60

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Retirar la placa y guardar a 5 C Repetir con todas las placas

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Protocolo Preparacin RSTD Ubique 8 tubos ependorf mbar de 1-8 Agregue 500 L de PBS de 1-7 Agregue Resorufina16 M en 8 Hacer diluciones seriadas hasta el tubo 2 tomando 500 L del tubo 8

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Protocolo Lectura RSTD Tome una microplaca limpia y dividalas en dos partes iguales, utilizando la izquierda. Dosifique las diluciones de RSTD preparadas: del tubo ependorf 1 agregue a la fila A1-A6, luego se repite el proceso pero con el tubo ependorf 2 y se agrega a la fila B1-B6 y as hasta terminar con el tubo 8 en la fila H1-H6. agregar 20 L de etoxiresorufina a todos los pocillo de la divisin para RSTD agregar 20 L de NADPH a todos los pocillo de la divisin para RSTD. Poner la placa en el fluormetro con el protocolo que corresponda: filtro de excitacin: 530 nm filtro de emisin: 580 nm 10 ciclos de 60

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Protocolo Preparacin PSTD Ubique 8 tubos ependorf de 1-8 Agregue 500 L de PBS de 1-7 Pese 0,24 g de BSA y disulvalos en 4 mL de PBS Agregue la solucin de BSA en 8 Hacer diluciones seriadas hasta el tubo 2 tomando 500 L del tubo 8

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Protocolo Lectura PSTD


Tome la placa de RSTD y utilice la seccin derecha Dosifique las diluciones de PSTD preparadas: del tubo ependorf 1 agregue a la fila A7-A12, luego se repite el proceso pero con el tubo ependorf 2 y se agrega a la fila B7-B12 y as hasta terminar con el tubo 8 en la fila H7-H12. agregar 20 L de etoxiresorufina a todos los pocillo de la divisin para PSTD agregar 20 L de NADPH a todos los pocillo de la divisin para PSTD agregar 150 L de buffer Na2PO4 Agitar la placa por 1 min Agregar 20 L de fluorescamina 1.08 M Agitar 1 min y dejar reposar 10 Poner la placa en el fluormetro con el protocolo que corresponda: filtro de excitacin: 400 nm filtro de emisin: 460 nm 1 ciclos de 60

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Medicin de la Actividad Cataltica de CYP1A1


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Protocolo Lectura Protena Celular Utilizar las microplacas guardadas a 5 C Agregue 150 L de buffer Na2PO4, agite por 1 min Agregue 20 L de fluorescamina 1.08 M, agite por 1 min y dejar reposar 10 min Poner la placa en el fluormetro con el protocolo que corresponda: filtro de excitacin: 400 nm filtro de emisin: 460 nm 1 ciclos de 60

Anlisis de Datos

Anlisis de Datos

Introduccin:
Los datos obtenidos por el ensayo EROD son grficados en curvas dosis-respuesta

Estas curvas proveninte de extractos medioambientales o qumicos puros son comparadas con la curva estndar de TCDD para desarrollar los TCDD-Eqs
TCDD-EQs pueden ser determinados de diferentes formas:
Relacin de ED50 de TCDD y de la muestra La relacin de las pendiente de la porcin lineal de las curvas dosis-respuesta

La relacin de otro estimado de multipunto Todos se basan en que el extracto induce CYP1A1 mediante el mismo mecanismo que el TCDD dilucin de TCDD

Anlisis de Datos

Comparacin de ED50 o de un punto Es frecuentemente utilizado por su simplicidad Solo es vlido cuando las curvas dosis respuestas son idnticas y solo difieren en la posicin del eje x paralelas y con actividad CYP1A1 igual (eficacia) Difcil que se den ambas situaciones

Anlisis de Datos

Comparacin de pendientes/multipuntos Permite utilizar un rango mayor de datos de la curva dosis-respuesta confianza Solo se utiliza la porcin lineal de la curva lo que permite poder estima TCDD-Eqs de extractos que no han alcanzado su mxima induccin Comparacin de rangos RPF /multipuntos La amplitud del rango indicar el grado certeza de la estimacin de TCDD-EQs Necesita la misma eficacia que el TCDD. Rango 20 a 80% de la respuesta mxima del estndar TCDD = RPF20-80 range Si la respuesta mxima no se determina se asume que el mxima RPF es la mxima actividad del CYP1A para el extracto en cuestin