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Tema 4:

Aminocidos y Pptidos

Tema 4: Aminocidos y Pptidos

Aminocidos: clasificacin segn su distribucin biolgica: proteicos y no proteicos. Clasificacin segn propiedades de los grupos R. Propiedades cido-base. Punto isolctrico. Mtodos separativos de mezclas de aminocidos. Cuantificacin de aminocidos en muestras biolgicas. Pptidos: unin peptdica. Nomenclatura. Pptidos de importancia biolgica. Propiedades cido-base. Anlisis de la composicin y secuencia de aminocidos de pptidos: hidrlisis total, identificacin de grupo amino terminal, identificacin de grupo carboxilo terminal, ruptura especfica de la cadena con agentes qumicos y enzimas. Agentes reductores sobre puentes disulfuros y alquilantes de grupos sulfhidrilos.

La

unidad constitutiva de las

protenas son los aminocidos

son del tipo a-L aminocidos

Desde el punto de vista qumico, los a-aminocidos son cidos orgnicos con un grupo amino en posicin alfa. Segn esta definicin, los cuatro sustituyentes del carbono alfa (Ca) en un aminocido son:
el grupo carboxilo un grupo amino un tomo de hidrgeno una cadena lateral R, que es caracterstica de cada AA
O C OH NH2 Ca H R

a-L-aminocidos
O C OH NH2 C H R

R C H C

O OH

NH2

Cuntos tipos de aminocidos existen en los seres vivos?


AMINOACIDOS

PROTEICOS
a-L-AA

NO PROTEICOS
AA

NO CODIFICADOS POR EL ADN

CODIFICADOS POR EL ADN

Aminocidos codificados por el ADN

Con cadenas alifticas - no polares

Aminocidos codificados por el ADN

Con cadenas laterales con grupos hidroxilos azufre

Aminocidos codificados por el ADN

Aromticos

Aminocidos codificados por el ADN

Cclico

Aminocidos codificados por el ADN

Aminocidos bsicos

Aminocidos codificados por el ADN

Aminocidos cidos y sus amidas

CLASIFICACIN DE LOS AMINOCIDOS EN FUNCIN DE LA POLARIDAD DE SU CADENA LATERAL Segn este criterio se distinguen cuatro grupos de aminocidos:
APOLARES POLARES SIN CARGA CATINICOS

A V L

F W M P -

G Y S T C N Q K R H -

ANINICOS

D E

Aminocidos proteicos no codificados por el ADN


(AMINOCIDOS PROTEICOS MODIFICADOS) Una vez que los AA codificables han sido incorporados a las protenas, pueden sufrir ciertas transformaciones que dan lugar a los AA modificados o particulares. Entre las modificaciones ms frecuentes destacan:

1.HIDROXILACIN:
4-hidroxiprolina

5-hidroxilisina

Estos AA se incorporan a la protena como P o como K, y son posteriormente hidroxilados.

2. CARBOXILACIN: El cido glutmico por carboxilacin post-sinttica se convierte en cido g-carboxiglutmico.

3. CONDENSACIN: La cistina es el resultado de la unin de dos Cistenas por medio de un puente disulfuro (-S-S-).

Aminocidos no proteicos

Aminocidos esenciales

AA que deben ser ingeridos, dado que no son sintetizados por el organismo:

Phe, Ile, Leu, Lys, Met, Thr, Trp, Val Arg , His se sintetizan de modo insuficiente durante crecimiento, embarazo y lactancia (se convierten en esenciales)

Propiedades fisicoqumicas de aminocidos

Propiedades cido-base Absorcin en el espectro UV

Deteccin de aminocidos

Reaccin con ninhidrina

Amino acids treated with ninhydrin give an intense blue color, except for proline, which gives a yellow color because it contains a secondary amino group. The concentration of an amino acid in a solution, after heating with ninhydrin, is proportional to the optical absorbance of the solution. This technique can detect a microgram (10 nmol) of an amino acid.

Separacin de mezclas de aminocidos

Por cromatografa en capa fina (TLC) -> Por cromatografa en columna de intercambio inico ->

Pptidos

Resultan de la unin de 2 mas aminocidos a travs de un enlace peptdico

Se los clasifica en Oligopptidos (menos de 10 AA) Polipptidos (ms de 10 AA) Protenas (polipptidos de mas de 50 AA)

Pptidos

Resultan de la unin de 2 mas aminocidos a travs de un enlace peptdico


R1 NH2 C H C OH O
+

R2 NH2 C H
H20

O C OH

R1 O NH2 C C H

R2 O N C H H C OH

Enlace peptdico

El enlace peptdico (-CO-NH-) se representa normalmente como un enlace sencillo. Sin embargo, posee una serie de caractersticas que lo aproximan ms a un doble enlace.

el enlace peptdico es planar carece de carcter bsico

Enlace peptdico
Los electrones p de los tomos de C, N y O no implicados en el enlace pueden formar orbitales hbridos p. Como el N es menos electronegativo que el O, el enlace C-O tiene un 60% de carcter de doble enlace mientras que el enlace C-N tiene un 40%. Por lo tanto, se puede considerar que los enlaces C-O y N-C que participan en el enlace peptdico tienen estructuras intermedias entre el enlace sencillo y el enlace doble. Esta teora se confirma por el hecho de que las distancias interatmicas medidas en el enlace C-O y en el enlace C-N son intermedias entre el enlace sencillo y el doble enlace. Esta disposicin atmica est estabilizada por resonancia de forma que los seis tomos implicados en la formacin del enlace peptdico estn contenidos en el mismo plano.

Enlace peptdico

El carcter parcial de doble enlace impide la libre rotacin de los tomos de C y N, al ser ste un enlace rgido. Por lo tanto, las posibilidades conformacionales de los pptidos son limitadas.

Los pptidos slo podrn cambiar de conformacin por giro de los Ca tetradricos (con hibridacin sp3), pero no por rotacin de los tomos con hibridacin sp2

Escritura y nombre de un oligopptido

Extremo Amino terminal

6 Extremo Carboxilo terminal

Pptidos: propiedades

Los pptidos son estructuras intermedias entre los AA y las protenas. Sus propiedades fsicas y qumicas suelen reflejar en mayor o menor medida las de los AA que lo componen. Sin embargo, al enmascararse mutuamente los grupos hidroflicos (carboxilo y amina) que forman parte de los enlaces peptdicos, el carcter polar o apolar de los pptidos depende de la naturaleza de los grupos de las cadenas laterales de los AA que lo integran Anlogamente, los valores de pK de los grupos ionizables a menudo se ven alterados por la proximidad de otros grupos polares.

Pptidos: propiedades

Los pptidos presentan a menudo ciertas peculiaridades estructurales que no aparecen en las protenas:

AA no a AA de la serie D Formas cclicas Unin peptdica no tpica (con g-COOH , con b-NH2)

En hongos y bacterias pueden encontrarse pptidos cclicos, en los que pueden aparecer algunos AA de la serie D, como es el caso del antibitico gramicidina S cuya secuencia es: --[L-Val - L-Orn - L-Leu - D-Phe - L-Pro]2--

Pptidos de inters biolgico

En los animales superiores llama la atencin el hecho de cmo unos pocos AA que no presentan actividad alguna en forma aislada son capaces de desencadenar respuestas biolgicas tan intensas. Entre las funciones biolgicas ms importantes que realizan los pptidos podemos destacar las siguientes:

HORMONAS NEUROTRANSMISORES ANTIBITICOS COFACTORES

HORMONAS Las hormonas son seales qumicas que ejercen su accin sobre rganos y tejidos situados, en la mayora de los casos, lejos del lugar donde se han sintetizado. Muchas hormonas tienen estructura peptdica.

Hormonas

El agente hipertensor ms potente que se conoce es un octapptido, la angiotensina II

Otros pptidos son agentes hipotensores (tienen actividad vasodilatadora). Uno de los mejor conocidos es un nonapptido, la bradiquinina
Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg.

Hormonas

TRH, hormona liberadora de tirotropina. Es un factor hipotalmico de secuencia piroglutamil-histidil-prolinamida.

En este oligopptido podemos ver una caracterstica muy comn entre los mismos: el bloqueo del grupo NH2 terminal por la propia cadena lateral de cido glutmico (cido piroglutmico) y el bloqueo del grupo COOH terminal, que aparece como amida -CONH2

Oxitocina, nonapptido que provoca la contraccin uterina y la secrecin de leche por la glndula mamaria .

Vasopresina, nonapptido que induce la reabsorcin de agua en el rin.

NEUROTRANSMISORES

Tambin son oligopptidos muchos neutrotransmisores Los neurotransmisores son seales qumicas producidas en un terminal nervioso presinptico, y que a travs de un receptor especfico ejercen su accin sobre la neurona post-sinptica Son neurotransmisores peptdicos las encefalinas (pentapptido), Ej. Leucn-Encefalina (YGGFL) las endorfinas la sustancia P (undecapptido) (RPKPQQFFGLM) Son los agonistas* fisiolgicos de los receptores opiceos. Producen analgesia al unirse a receptores.

Las drogas opiceas de abuso (morfina, herona, etc.) lo son por su parecido estructural con estos pptidos.
* En bioqumica, un agonista es aquella sustancia que es capaz de unirse a un receptor y provocar una respuesta en la clula

Sntesis de hormonas peptdicas/proteicas y neurotransmisores

ANTIBITICOS

La valinomicina y la gramicidina son dos pptidos cclicos con accin antibitica. Los dos contienen aminocidos de la serie D, adems de otros aminocidos no proteicos. La valinomicina es un ionforo: es capaz de transportar iones potasio a travs de las membrana biolgicas.

valinomicina

gramicidina

COFACTORES

Otro oligopptido de gran importancia funcional es el Glutatin (GSH) Se trata del g-glutamil-cisteinil-glicina. El papel biolgico se debe a la participacin en reacciones redox El poder reductor se debe al grupo -SH libre de la cistena central. Cuando se oxida, dos molculas de glutatin se unen para formar el Glutatin oxidado (GSSG) a travs de un disulfuro establecido entre las dos cistenas.

El glutatin participa en una gran cantidad de procesos redox intracelulares, relacionados generalmente con destoxificacin y mantenimiento de la hemoglobina en estado ferroso.

principal componente de la pared bacteriana

Peptidoglicano (murena)

Capa de peptidoglicano de las bacterias Gram +.

Los enlaces cruzados entre los pptidos se forman mediante cadenas de pentaglicina entre el grupo e-amino de la lisina (*) de una cadena, y el grupo carboxilo terminal de la alanina (**) de la cadena adyacente.

Anlisis de la composicin y secuencia de aminocidos de pptidos

Hidrlisis total Identificacin de grupo amino terminal Identificacin de grupo carboxilo terminal Ruptura especfica de la cadena con agentes qumicos y enzimas. Agentes reductores sobre puentes disulfuros y alquilantes de grupos sulfhidrilos.

Hidrlisis total

The first step is to determine the amino acid composition of the peptide. The peptide is hydrolyzed into its constituent amino acids by heating it in 6 N HCl at 110C for 24 hours. Amino acids in hydrolysates can be separated by ionexchange chromatography on columns of sulfonated polystyrene. The identity of the amino acid is revealed by its elution volume, which is the volume of buffer used to remove the amino acid from the column and quantified by reaction with ninhydrin.

Let us examine first how we can sequence a simple peptide, such as

Determination of Amino Acid Composition. Different amino acids in a peptide hydrolysate can be separated by ion-exchange chromatography on a sulfonated polystyrene resin (such as Dowex50). Buffers (in this case, sodium citrate) of increasing pH are used to elute the amino acids from the column. The amount of each amino acid present is determined from the absorbance. Aspartate, which has an acidic side chain, is first to emerge, whereas arginine, which has a basic side chain, is the last. The original peptide is revealed to be composed of one aspartate, one alanine, one phenylalanine, one arginine, and two glycine residues. <-

Inconvenientes de la Hidrlisis total

El Trp se degrada en medio cido

Se realiza una hidrlisis en medio alcalino donde es estable Se lleva a cabo un seguimiento de su degradacin->

La Tyr, Ser y Thr se degradan con el tiempo

La Asn y Gln se convierten en Asp y Glu respectivamente

Se las detecta con clivaje especfico mediante enzimas

Inconvenientes de la Hidrlisis total volver <-

Identificacin de grupo amino terminal

Reactivo de Sanger (p-dinitrofluor benceno: PDFB) Cloruro de dabsilo Cloruro de dansilo Reactivo de Edman (fenilisotiocianato)

Identificacin de grupo amino terminal

Cloruro de Dabsilo

Note que la hidrlisis rompe todas las uniones peptdicas, liberando no slo al AA terminal marcado sino tambin todos los AA de la cadena peptidica

Identificacin de grupo amino terminal

Reactivo de Edman

Note que la hidrlisis libera slo al AA terminal marcado permaneciendo el resto de la cadena peptdica intacta -> permite la SECUENCIACIN

SECUENCIACIACIN Mtodo de Edman


The cyclic compound is a phenylthiohydantoin (PTH)-amino acid, which can be identified by chromatographic procedures. The Edman procedure can then be repeated on the shortened peptide, yielding another PTH-amino acid, which can again be identified by chromatography.

The development of automated sequencers has markedly decreased the time required to determine protein sequences. One cycle of the Edman degradation the cleavage of an amino acid from a peptide and its identification is carried out in less than 1 hour. By repeated degradations, the amino acid sequence of some 50 residues in a protein can be determined. High-pressure liquid chromatography provides a sensitive means of distinguishing the various amino acids -------->

SECUENCIACIACIN Mtodo de Edman

Separation of PTH-Amino Acids. PTH-amino acids can be rapidly separated by high-pressure liquid chromatography (HPLC). In this HPLC profile, a mixture of PTH-amino acids is clearly resolved into its components. An unknown amino acid can be identified by its elution position relative to the known ones.
Nota : PTH (feniltioidantoin) PTC (feniltiocarbamil) son sinnimos

Identificacin de grupo carboxilo terminal

Se realiza mediante la enzima carboxipeptidasa A

Debe controlarse el tiempo ya que contina liberando los otros aminocidos

Ruptura especfica de la cadena con agentes qumicos y enzimas

Cleavage by Cyanogen Bromide. Cyanogen bromide cleaves polypeptides on the carboxyl side of methionine residues.

Cleavage by Trypsin. Trypsin hydrolyzes polypeptides on the carboxyl side of arginine and lysine residues.

H H R1 O

H H R 2 O

N C C N C C

Trypsin hydrolyzes polypeptides on the carboxyl side of arginine and lysine residues (R1).

2-Nitro-5-thiocyanobenzoate hydrolyzes polypeptides on the amino side of cysteine residue (R2).

Ruptura especfica de la cadena con agentes qumicos


Reagent Cyanogen bromide Cleavage site Carboxyl side of methionine residues Carboxyl side of tryptophan residues

O-Iodosobenzoate
Hydroxylamine
2-Nitro-5thiocyanobenzoate

Asparagine-glycine bonds
Amino side of cysteine residue

Ruptura especfica de la cadena con enzimas


Reagent Trypsin Clostripain Staphylococcal protease Thrombin Cleavage site Carboxyl side of lysine and arginine residues Carboxyl side of arginine residues Carboxyl side of aspartate and glutamate residues (glutamate only under certain conditions) Carboxyl side of arginine

Chymotrypsin
Carboxypeptidase A

Carboxyl side of tyrosine, tryptophan, phenylalanine


Amino side of C-terminal amino acid (not arginine, lysine, or proline)

Etapas del anlisis de la secuencia de un pptido

Ruptura de fragmentos con agentes selectivos Anlisis de la secuencia de cada fragmento Solapamiento de los fragmentos para reconstruir la cadena original. Ej.:

Gly - Lys

Thr - Phe

Overlap Peptides. The peptide obtained by chymotryptic digestion overlaps two tryptic peptides, establishing their order.

Agentes reductores sobre puentes disulfuros y alquilantes de grupos sulfhidrilos

La presencia de puentes disulfuro impide la secuenciacin de la cadena Para sortear este inconveniente se deben reducir, previo al anlisis, tales -S-S- y luego protegerlas para evitar su reoxidacin Para la reduccin se emplea b-mercaptoetanol

b-mercaptoetanol

Para la reduccin se emplea b-mercaptoetanol Para proteger los grupos sulfhidrilos libres se emplea iodoacetato para su alquilacin

Tema 4: Aminocidos y Pptidos

Aminocidos: clasificacin segn su distribucin biolgica: proteicos y no proteicos. Clasificacin segn propiedades de los grupos R. Propiedades cido-base. Punto isolctrico. Mtodos separativos de mezclas de aminocidos. Cuantificacin de aminocidos en muestras biolgicas. Pptidos: unin peptdica. Nomenclatura. Pptidos de importancia biolgica. Propiedades cido-base. Anlisis de la composicin y secuencia de aminocidos de pptidos: hidrlisis total, identificacin de grupo amino terminal, identificacin de grupo carboxilo terminal, ruptura especfica de la cadena con agentes qumicos y enzimas. Agentes reductores sobre puentes disulfuros y alquilantes de grupos sulfhidrilos.

Tema 5