TÉCNICAS DE ESTUDIO DEL ADN Y LOS CROMOSOMAS

Hernández Bendezú, María del Rosario.

BANDEADO CROMOSÓMICO: G Y Q
El primer tipo de bandeado que se implementó fue el llamado “Q” ( por la sustancia fluorescente empleada, quinacrina), que produce uno de los patrones de bandas más informativos, aunque requiere microscopia de fluorescencia.  Después se comprobó que se podía obtener el mismo patrón de bandeado mediante la extracción selectiva de componentes cromosómicos con la enzima tripsina o con soluciones salinas y una tinción con el colorante de Giemsa; este patrón de bandas llamado “G”(de “Giemsa”), es el que se utiliza con mayor frecuencia como estándar.

 Ambos patrones producen bandas que se relacionan con la composición predominante de bases en el ADN de las regiones bandeadas.  . de manera que su coloración es proporcional a la concentración de A+T.El bandeado G es idéntico al bandeado Q. 9 y 16 y en los satélites de los acrocéntricos. excepto en las zonas heterocromáticas de los cromosomas 1.  Las bandas oscuras del bandeado G y las brillantes (fluorescentes) del bandeado Q representan regiones cuyo ADN es rico en el par A-T. que dan una tinción variable.

METAFASE MITÓTICA HUMANA TEÑIDA CON LA TÉCNICA DE BANDEO G .

METAFASE MITÓTICA HUMANA TEÑIDA CON LA TÉCNICA DE BANDEO Q .

R Y N El bandeado “C” (de constitutivo) tiñe solo la heterocromatina constitutiva. es completamente diferente de los bandeados G y Q y solo tiñe las regiones centroméricas y los bloques de heterocromatina C de los cromosomas 1.  En consecuencia.  . 9 y 16 y del brazo largo del cromosoma Y.BANDEADO CROMOSÓMICO: C. compuesta por ADN de tipo satélite.  El procedimiento es diferente del clásico porque el material cromosómico se desnaturaliza y se extrae con álcali y se incuba en solución salina para teñirlo después con Giemsa u otros colorantes.

 El bandeado “N” o de los organizadores nucleolares (NOR) tiñe solo estas regiones.Las bandas C indican los sitios en los que hay ADN altamente repetitivo que no se ha extraído. las bandas claras de un tipo de bandeado son oscuras en el otro tipo. se usa la cromomicina A3 y las bandas ricas en C-G son las fluorescentes.  .  Este bandeado está indicado para la búsqueda de polimorfismos de heterocromatina. se utiliza nitrato de plata.  El bandeado “R” es el inverso del bandeado clásico ( G o Q ).

METAFASE MITÓTICA HUMANA TEÑIDA CON LA TÉCNICA DE BANDEO C .

en su forma más simple en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucleótidos (oligonucleótidos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde.REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ( PCR )  El método se basa. La muestra se calienta. . hecho que se conoce como "desnaturalización". en el primer paso. En el segundo paso. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces. hasta lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN.

sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. en el espacio comprendido entre ambos. . la ADN polimerasa usa desoxidonucleósidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reacción. una enzima ADN polimerasa extiende los primers. La temperatura a la que se realiza el tercer paso está condicionada por aquélla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Para ello. En tercer lugar.

 Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización. apareamiento. El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers. . extensión) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo.

una célula somática o un espermatozoide. por ejemplo. La técnica PCR es el método de detección de secuencias de ADN más sensible conocido hasta la fecha: mediante ella resulta posible identificar un gen a partir de un solo cabello. un instrumento extremadamente valioso para establecer. lazos de parentesco . por lo tanto. Es.

. c) extensión de las cadenas de primers gracias a la acción de una enzima ADN polimerasa. cada ciclo de la técnica PCR incluye tres etapas: a) desnaturalización.Para lograr la duplicación de un tramo de ADN. La repetición de los ciclos permite multiplicar geométricamente los tramos de ADN elegidos. durante la cual se separan las dos hebras constituyentes del ADN. b) apareamiento de los "iniciadores" o primers del tramo a replicar.

CARIOTIPO HUMANO Esta clasificación se basa en el tamaño de los cromosomas y en la posición relativa del centrómero.  .  En la especie humana no hay cromosomas con el centrómero en un extremo (telocéntricos). si el centrómero es central el cromosoma es metacéntrico. cuando el centrómero está muy cerca de un extremo el cromosoma es acrocéntrico y en los casos intermedios los crosomosomas son submetacéntricos.

 La clasificación básica de los cromosomas humanos comprende 7 grupos: .

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detectada finalmente por una señal fluorescente. La base del procedimiento es lograr que la secuencia buscada del ADN celular se hibride con una secuencia preparada in vitro y rotulada con nucleótidos marcados. sustancias que reaccionan específicamente con otras (la biotina reacciona con avidina y la digoxigenina con su anticuerpo. rodamina) . en especial con biotina o con digoxigenina.HIBRIDACIÓN IN SITU Y FLUORESCENCIA   La técnica HISYF o FISH consiste en la identificación de la región cromosómica en la que se encuentra una secuencia determinada de un ácido nucleico. antidigoxigenina) que pueden ser acopladas con una sustancia fluorescente (fluoresceína.

La HISYF permite determinar en que cromosoma y en que región está presente una secuencia de ADN.  . lo que es de gran utilidad para el mapeo del genoma humano porque inmediatamente se puede relacionar esa secuencia con todos los genes y secuencias marcadores ya conocidas en ese cromosoma.  Además la HISYF permite la identificación inmediata y precisa de cada cromosoma por medio de “sondas” preparadas con secuencias específicas de ese cromosoma.

por ejemplo. en el mismo preparado es posible obtener. identificadas por colores diferentes. la localización de dos cromosomas. como cada sonda es detectable con un colorante fluorescente de distinto color. cada una específica de un cromosoma. identificables por su color de fluorescencia o de distintas regiones del mismo cromosoma. . También se ha desarrollado el llamado “Pintado cromosómico” que se realiza con una mezcla de varias sondas.

La utilidad de la HISYF no se limita a cromosomas de células mitóticas. esta técnica también se puede utilizar en células interfásicas.  Presenta ventajas obvias de rapidez y economía al no exigir cultivos ni cierto número de células en mitosis. la presencia de una trisomía (como la del Síndrome de Down) por la señal triple que genera una sonda para ese cromosoma .  . esto permite reconocer por ejemplo.

 Otra explicación importante es su uso en preparados histológicos de rutina. en especial en los obtenidos por biopsia. . En estos preparados realizados mediante cortes de parafina es posible realizar HISYF para detectar. por ejemplo. la presencia de un gen determinado o de un oncogén en las células de una biopsia efectuada varios años atrás.

FISH DE UNA METAFASE MITÓTICA DE UNA MUJER EN LA QUE SE OBSERVA UNA MICRODELECCIÓN PARA EL BRAZO CORTO DEL CROMOSOMA X .

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