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M. en C.

Harlem Hayde Cruz Bailn


Tania G. Garca Mendoza Lizet Nez Pea Karina Ortega Becerril Lilia Serapio Morales

Nuevos mtodos de anlisis

Definir objetivos y mtodos de separacin

Desarrollar el mtodo inicial analizar" el resultado del primer cromatograma

Recopilar informacin de la muestra y el analito

Mtodo de ajuste y optimizacin

Validacin del mtodo

Buenas prcticas en el desarrollo de un mtodo farmacutico.


Instrumentos modernos: bombas de multisolventes, detectores de diodos (PDA), software de modelado, sistemas de desarrollo automatizado, vlvulas selectoras multicolumnas Compatible con espectrmetro de masas(MS), mtodos de gradiente para el anlisis de impurezas

Mtodos combinados (ensayo impureza)durante el desarrollo inicial

Desarrollo del mtodo apropiado para validacin

Mtodos ortogonales secundarios para asegurar la separacin de todas las impurezas y sustancias desconocidas Un mtodo nico para productos de diferentes formulaciones y concentraciones

Mtodos para el anlisis de trazas LC/MS/MS

cualitativo

Cuantitativo

preparativo

Robusto y bajo costo

Linealidad 50-150%

Resolucin >1.5

Precisin <1-2%

Especificidad

Sensibilidad

Tiempo de anlisis 5-30 min

Recopilacin de informacin

Detector de UV/Vis Detector de ndice de refraccin (RI) Detector evaporativo de dispersin de luz (ELSD) Espectrometra de masas (MS)

Columna C18 o C8 Empaquetadas con 3-5micras de slice Las dimensiones de la columna se sugieren las siguientes:

50-100 mm 4,6 mm d.i . para muestras simples (por ejemplo, ensayos de un componente principal) 100-150 mm 3.0-4.6 mm d.i. para las pruebas de pureza o pruebas multi-componente de una muestra compleja 20-150 mm 2,0 mm columnas para LC / MS

Desarrollo del mtodo inicial utilizando gradientes y seleccin de la fase mvil

Objetivos de los mtodos cromatogrficos

Lograr una resolucin adecuada de todos los analitos con suficiente precisin y sensibilidad en un plazo de tiempo razonable. Obtener las condiciones de separacin iniciales. Ajustar cada parmetro para cumplir todos los objetivos requeridos.

1. 2.

La co-elucin de los analitos se corrigen mediante el ajuste de los parmetros de separacin, principalmente la selectividad

Se debe de tomar en cuenta que se tienen que mejorar otras medidas del mtodo tales como la sensibilidad, la forma del pico, robustez, y el tiempo de anlisis, este proceso es anlogo a la validacin del mtodo.

Parmetros modificados:

En la fase mvil porcentaje disolvente orgnico (B%) tipo de buffer y la concentracin pH tipo de disolvente

La fase mvil controla la retencin y la selectividad, esta se puede ajustar continuamente para mejorar el mtodo

La reduccin de la fuerza disolvente puede dar lugar a la distorsin de la forma de pico causada por la baja solubilidad de los analitos en las fases mviles.

Los buffers en la fase mvil se requieren para controlar la separacin de analitos cidos o bsicos. Las concentraciones de buffers de 1025 mM niveles suelen ser suficientes. Tampones voltiles (formiato, acetato, carbonato, bicarbonato, amonaco) son necesarios para la MS.

Parmetros de funcionamiento

flujo (F) temperatura (T) rango de gradiente () tiempo de gradiente

Velocidad de flujo (F)

En un anlisis isocrtico no afecta mucho a retencin (k *) y la selectividad (), pero en gradiente si lo hace

El aumento de la temperatura de la columna (T) generalmente reduce la retencin en RPC y puede tener algunos efectos en la selectividad Tg es tiempo de gradiente, que junto con (rango de porcentaje del disolvente fuerte ) define la pendiente de gradiente.

Column a

longitud (L) dimetro de la columna (dc) tamao de partcula (dp)

Tradicionalmente, C8, C18, ciano y fenilo dan selectividad distinta Dimensin de columna (L, dp, dc) tambin se puede optimizar para mejorar la eficiencia, la velocidad o la sensibilidad. El uso de software de simulacin es particularmente til para encontrar la dimensin de columna ptima para una separacin.

Ajuste de detector (longitud de onda) y cantidad de muestra

Maximizar la sensibilidad mientras se mantiene la linealidad mtodo y formas de los picos


La sensibilidad es importante para los mtodos de impurezas y para el anlisis de trazas. Para inyecciones de gran volumen (> 20L), la fuerza disolvente de la muestra debe ser igual o ms dbil que la fase mvil para evitar anomalas cromatogrficos.

La cantidad mxima de muestra es altamente dependiente del tamao de la columna.

Etapa / enfoques El desarrollo inicial Pasos secuenciales isocrticos o gradientes de exploracin

Factor Columna

Deteccin de longitud de onda

Sugerencias y comentarios Columnas modernas empaquetadas con C8 o fases C18 de 3 o 5 micras de slice de alta pureza El uso de PDA para evaluar max de todos los analitos. Seleccione max del componente principal o de gran longitud de onda UV (200-230nm). MPA: Agua para analitos neutros o acidificadas a pH 2-4 para analitos cidos o bsicos MPB: MeOH o ACN Uso de gradiente para la evaluacin inicial Evaluar un primer cromatograma para definir rango del gradiente . Establecer T = 30 C, F est definida por dC Evaluar mtodo con un "cctel" de impurezas y placebo. Modificar tipo de disolvente pH, T y TG para mejorar la resolucin

Fase mvil

Funcionamiento Condiciones

Mtodo de desarrollo y optimizacin Mtodos Isocrticos o de gradientes Fase mvil y las condiciones de operacin

Mtodo de ajuste y finalizacin


Mtodos isocrticos o de gradiente Columna Evaluar el mtodo con distintas fases ligadas Optimizar la dimensin de la columna (Drylab recomendado) Finalizar la deteccin de longitud onda y concentracin de la muestra o el

Detector y muestra

Cuando la solicitud De amplio gradiente. de un nuevo Compatible con SM frmaco est Respaldado por un mtodo secundario bloqueda (ortogonal)

Mtodos isocrticos rendimientos robustos

Neutro

Uso del software para la optimizacin de la columna y la fase mvil.

Alcalino

Seleccin de fases enlazadas y fases mviles mejorar la resolucin y sensibilidad.

Impurezas

Frmaco con 2 APIs Fases mviles con alto pH y optimizacin de pH, modificador orgnico y columna

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