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Tema 10.

PCR (polimerase chain reaction) Reacción en cadena de la polimerasa Componentes del sistema oligonucleótidos (cebadores) Tampón Polimerasa termoestable dNTP DNA molde Protocolo general Aplicaciones PCR inverso PCR en tiempo real (PCR cuantitativo)

PCR
amplificación de la secuencia comprendida entre los dos cebadores ciclos de amplificación desnaturalización reasociación polimerización

Karry Mullis 1985 Premio Nobel 1993

Componentes del sistema
1. Oligonucleótidos secuencia que flanquean el fragmento a amplificar actúan como cebadores tamaño de 20-24 nucleótidos diseño: 3’-OH bien apareado posibilidad de mutagénesis dirigida

5 mM B 0.5 mM D 2 mM E 2. actividad polimerasa y Tm cebador-molde Efecto de la concentración de MgCl2 en la PCR A 0.8 mM C 1. Afecta a: incorporación de dNTP. importancia de la concentración de MgCl2.5 mM F 3 mM . Tampón Tris pH 8.Componentes del sistema 2.4.

.

Necesita 3’-OH.Componentes del sistema 3. Copian molde. Polimerasas Dirección de polimerización 5’-3’. Usan dNTP DNA polimerasa Taq Vent Pfu Tth a) b) 40 400 120 20 c) + + d) + + - e) + Thermus aquaticus Thermococcus litoralis Pyrococcus furiosus Thermus thermophilus a) origen b) vida media (min) a 95ºC c) exo 5’ d) exo 3’ e) transcriptasa inversa .

Hot Start se activa a alta temperatura polimerasa termoestable modificada por la adición de un residuo termolabil. TaqBead Hot Start se activa a alta temperatura “bolitas” de cera que contienen la polimerasa termoestable .

Cultek .

dGTP. quimiolumisiscentes o fluorescentes para que el producto del PCR se use como sonda. 5. dNTPs dATP. dTTP a 100-200mM Pueden utilizarse marcados con 32P. Molde DNA cualquier secuencia RNA usando polimerasas con actividad de trascriptasa inversa (RT-PCR) .Componentes del sistema 4. dGTP.

Procesamiento .

Protocolo general Ciclo 1º ciclo 2º-34º ciclo último ciclo desnaturalización 5’/94ºC 1’/94ºC 1’/94ºC reasociación 2’/50ºC 2’/50ºC 2’/50ºC polimerización 3’/72ºC 3’/72ºC 10’/72ºC .

Aplicaciones de la PCR Diagnosis de enfermedades Establecimiento de la huella genética Aislamiento de genes Secuenciación Mutagénesis Amplificación de RNA: RT-PCR (trascriptasa inversa) Amplificación de secuencias adyacentes: PCR inversa PCR en tiempo real .

Inactivación de genes cromosómicos en un solo paso usando PCR FRT secuencia de 34 pb reconocida por la recombinasa FLP recombinasa FLP enzima producida en un plásmido .

PCR inversa secuencia conocida secuencias desconocidas para conocer las secuencias adyacentes a otra secuenencia conocida digerir DNA ligar extremos ER +ER PCR 30 ciclos de PCR .

Protocolo para q-PCR 4. Medida de la fluorescencia Fluoróforos intercalativos Marcajes específicos: Sondas Taq-Man Sondas Beacon Sondas Dual-FRET 3. q-PCR : monitorización de la reacción en tiempo real vs análisis del producto final 2. Aplicaciones de la q-PCR Determinación del nº copias de un gen (SYBR o sondas) Detección de mutaciones de una sola base (sondas) Análisis de expresión génica: RT-qPCR Detección de organismos transgénicos y patógenos 6.PCR en tiempo real (PCR cuantitativo. Aplicaciones de la melt curve después de una q-PCR Detección de Primers-dimers Detección de mutaciones de una sola base (SYBR) . Análisis de las curvas de disociación (melt curves) 5. qPCR) 1.

q-PCR vs PCR un método que mide en tiempo real la amplificación de DNA por la visualización del producto de PCR monitorización de la reacción en tiempo real vs análisis del producto final La PCR cuantitativa se diseña de modo que el incremento de la cantidad de producto produce un incremento de fluorescencia .1.

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Medida de la fluorescencia Fluoróforos intercalativos: moléculas fluorescentes que se unen a DNA2c EtBr SYBR (Syber green) Ct (ciclo umbral) ciclo en el que la cantidad de fluorescencia es cuantificable y está en la parte lineal de la curva fluorescencia .2.

fluorescencia muestras con diferente concentración de DNA inicia (nº de copias de un gen) Curva patrón establece la relación entre Ct el log de la concentración inicial de DNA en la reacción y el Ct .

Marcajes de secuencias específicas Sondas Taq-Man Sondas Beacon Sondas Dual-FRET .pero pronto estuvo claro que el uso de agentes intercaladores para monitorizar la reacción tenía un nivel de fluorescencia de fondo no específica de los productos de PCR amplificados. Por ello se han desarrollado sistemas de sondas específicas que hacen mucho mas sensible esta técnica.

Sondas Taq-Man no fluorescencia fluorescencia .

Sondas Beacon .

Sondas dual FRET .

Protocolo para q-PCR tamaño de los fragmentos de los fragmentos amplificados 100-200 pb Componentes del sistema oligonucleótidos (cebadores) tampón Taq polimerasa dNTP DNA molde SYBR/sondas TaqMan Beacon Dual FRET Ciclo 1º ciclo 2º-34º ciclo desnaturalización 10’/95ºC 30’’/95ºC reasociación-polimerización 1’/60ºC 1’/60ºC .

nº copias Ct log (Co) .

Melting curve (curvas de Tm) de las secuencias amplificadas fluorescencia Tª 91º .

Primers dimers tenemos un problema reasociación entre los cebadores diseñados .

Formación de primers-dimers . sólo con los cebadores curva de Tm de una qPCR con con los cebadores correctamente diseñados curva de Tm de una qPCR con con los cebadores incorrectamente diseñados.Controle s curva de Tm de una qPCR sin molde.

Aplicaciones Determinar el nº de copias de un gen .

Aplicaciones Discriminación alélica/Detección de SNP 1 2 .

Discriminación alélica/Detección de SNP FAM TET A/A G/G A/G .

Promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) .Terminador de la nopalina sintasa (NOS) . trasgénico .0001-1% de la fracción masa de OMG. Es frecuente por tanto la aplicación de la PCR cuantitativa (q-PCR) en la detección y cuantificación de organismos transgénicos. lo que supone un porcentaje de 0. Las técnicas cuantitativas basadas en ADN se utilizan cuando interesa cuantificar la cantidad total de una o varias secuencias de ADN presentes en una muestra de alimentos.Aplicaciones Detección de organismos trasgénicos La mayoría de los OMGs presentes en la UE contienen algunos de los siguientes elementos genéticos entre otros: .Marcador genético de resistencia a Kanamicina (nptII) Los límites de detección de estos elementos genéticos se encuentran en el rango de 20 ng a 10 ng de ADN diana.

Discriminación alélica/Detección de SNP por curva Tm (melting curve) fluorescencia Tª .

Aplicaciones Análisis de la expresión génica: RT-qPCR aislamos RNA expresado análisis cuantitativo realizamos qPCR amplificando el gen en estudio análisis cualitativo .

d. . Determinar el ciclo umbral (Ct) que correspondería a una muestra que contuviera una trisomía del gen HELEN1. e que contenían 10. b. 4 y 2 copias del gen respectivamente. 8. 6. c.Para determinar el número de copias del gen HELEN1 se llevó a cabo una PCR en tiempo real utilizando como patrón 5 muestras: a.