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Realizado por Martha J. Gonzlez, Alina Seralena, Ariana Garca, y cols.

En el Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa en la Ciudad de La Habana Cuba.

Evaluar alguna evidencia positiva de la accin teraputica de un plsmido que expresa VEGF121 para el tratamiento de cardiopata isqumica crtica y valorar su seguridad.

La cardiopata isqumica es la principal causa de muerte en el mundo desarrollado. Estos son pacientes que presentan una calidad de vida precaria, con limitaciones en actividades fsicas diarias e incapacidad para desarrollar cualquier actividad sin sentir molestia. El deterioro de su sistema cardiovascular trae consigo consecuencias fatales.

Existen muchas formas de terapias para esta afeccin como: Farmacolgicas Angioplastia coronaria transluminal percutnea Cirugas bypass coronario

Es un proceso fisiolgico y ocurre como respuesta a una isquemia o hipoxia: en el mismo se activan clulas endoteliales y surgen nuevos vasos endoteliales a partir de los existentes. Involucra varios factores como: Angiopoyetina FGF PDGF-BB xido ntrico Citoquinas inflamatorias (IL-6) VEGF

Se usan FC angiogenticos para estimular el desarrollo de VS colaterales en tejidos isqumicos. La neovascularizacin inducida busca amplificar la respuesta biolgica por liberacin exgena de protenas o genes, que pueden ser ADN desnudo o con vectores virales; lo que constituye un enfoque alternativo para el tratamiento de las IV como lo es la CIC.

El gen del VEGF humano est organizado en 8 exones, separados por 7 intrones, y se localiza en el cromosoma 6p21.3. Como resultado de la eliminacin de intrones alternativa, se generan 4 isoformas diferentes, compuestas por 121, 165, 189, y 206 aminocidos, respectivamente.

Seis pacientes adultos, de diferente sexo y raza con cardiopata isqumica crtica, refractarios al tratamiento mdico convencional, no candidatos a procederes de revascularizacin miocrdica.

Materiales
ADN molde: hVEGF121 Oligonucletidos: 4920 y 4921
Enzima Taq polimerasa

Desnaturalizacin 94C por 1 min Desnaturalizacin inicial: 94C por 5 min Hibridacin: 55C por 1 min

Extensin final: 72C por 5 min


Realizar el paso de hibridacin 29 veces

Extensin: 72C por 1 min

Para realizar la esta Rx es necesario:


Cadena de ADN molde Primer para iniciar la sntesis: oligonucletido 3295, que hibrida con la regin 3 del promotor/potenciador de CMV. ADN polimerasa

Deoxirribonucletidos de las cuatro bases: A, T, G, C.


Dideoxirribonucletidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciacin

Se hibridiza el oligo con el molde de ADN Esta mezcla de Rx se divide en 4 alcuotas A cada una se le agrega un dNTPs, para que cada tubo contenga un dNTPs diferente Se aade la ADN polimerasa que sintetiza la cadena complementaria

Se agrega el dideoxirribonucletido correspondiente a cada tubo el cual interrumpe la elongacin de la cadena


Se realiza la electroforesis en la cual se van a observar distintas bandas de tamaos diferentes.

El ADN plasmdico con vistas a los estudios preclnicos y clnicos se purific a partir de fermentaciones de 5 L de medio LBK de la cepa DH10B de E. coli K12 transformada con el clon recombinante seleccionado.
El fermentado se inocul y dej crecer a 37C, pH 7,0 y 500 rpm de agitacin durante 5 horas. Transcurrido este tiempo se cambi la temperatura a 42C y se dej crecer durante una hora adicional. La biomasa resultante de la fermentacin se someti a ruptura celular mediante lisis alcalina y se neutraliz.

Luego se filtr y concentr el material.


Se realiz una cromatografa de intercambio aninico seguida por una cromatografa de tamiz molecular. El ADN plasmdico purificado y formulado en solucin salina (NaCl 0,9%), se envas en viales de crioconservacin a razn de 1 mL/vial, a una concentracin de 0,5 mg/mL; y se almacen a -20C.

Se administr una dosis nica de 0.5 mg de pVEGF121 en 1 mL de solucin salina, con jeringuillas de 1 mL por va intramiocrdica, en los 4 sitios especificados (250uL/sitio) en la zona isqumica, previamente definida por SPECT

Evaluacin clnica que especifica el nmero e intensidad de los episodios de angina y el requerimiento de nitroglicerina Perfusin miocrdica: se basa en el uso de radiofrmacos (metoxi-isobutil isonitrilo), los cuales se administran mediante IE y se concentran en el tejido miocrdico fijndose en las mitocondrias, permiten evaluar indirectamente la irrigacin global y su viabilidad.

Los niveles de VEGF en sangre se midieron en el momento basal y luego de administrar el producto a los 2, 4, 7 y 15 das.

Episodios de angina de pecho: 1 mes disminuyeron drsticamente, con ligeras oscilaciones a los 3 y 6 meses. Consumo de tabletas de nitroglicerina: hasta los 6 meses, se redujo casi a cero el consumo de nitroglicerina. Clasificacin funcional: al mes del tratamiento se observ una tendencia a la mejora a la clase funcional I.

Despus de la terapia intramiocrdica con pVEGF121, se redujo la intensidad de la angina de pecho, puesto que el dolor ceda con el reposo sin necesidad de utilizar la nitroglicerina. Los principales eventos adversos estuvieron relacionados con el procedimiento de administracin y con la severidad de la enfermedad de base de estos pacientes.