CROMATOGRAFÍA

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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓNADSORCIÓN MOLECULAR Y DE FILTRACIÓN POR GEL

Conceptos Básicos
 LA SORCIÓN O ADSORCIÓN:

es la transferencia selectiva de uno o más solutos de una fase fluida a un lote de partículas sólidas.  La selectividad común de un sorbente entre el soluto y el fluido portador o entre varios solutos, hace posible la separación entre ciertos solutos presentes en el fluido portador o entre sí.
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Conceptos Básicos
 ADSORCIÓN:

los adsorbentes son materiales naturales o sintéticos de estructura amorfa y microcristalina altamente poros con áreas internas muy grandes por unidad de volumen.  Adsorbentes: carbón activado, alúmina activada, gel de sílice, tierra de fuller, otras arcillas y mallas moleculares.  La adsorción es causada por lo general por las furzas intermoleculares (furezas de Van der Waals)a temperartura ordianria, ADSORCIÓN FÍSICA O FISIOSORCIÓN.
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Conceptos Básicos
 A temperaturas más elevadas ( arriba,

aproximadamente,de 200 a 400 °F) se dispone de la energía de activación necesaria para hacer o romper las uniones químicas QUIMIOSORCIÓN.  Elución: es un proceso en el cual los solutos son lavados a través de una fase estacionaria por el movimiento de una fase móvil.
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Conceptos Básicos
 Eluyente: es un disolvente que se usa para

llevar los componentes de una mezcla a través de una fase estacionaria.

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51 0.56 0.30 0.00 0.82 0.Conceptos Básicos DISOLVENTE POTENCIA ELUYENTE E -0. NEW YORK.63 FLUOROCARBONOS CLOROFORMO METILETILCETONA N-PENTANO ETER DE PETROLEO ACETONA DIETILETILAMINA CICLOHEXANO TETRACLORURO DE CARBONO CLORURO DE n-PROPILO 0. 1968 CROMATOGRAFÍA 6 . SNYDER.32 PIRIDINA n-PROPANOL METANOL 0.95 BENCENO L.04 DISOLVENTE POTENCIA ELUYENTE E 0.18 0.R. PRINCIPLES OF ADSORPTION CHROMATOFRAPHY.25 0.71 0. DEKKER.01 0.40 0.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA  Se utiliza un tubo de vidrio con un diámetro de alrededor de 10 a 50 mm que sostiene una columna de partículas sólidas las cuales constituye la fase estacionaria CROMATOGRAFÍA 7 .

PROCESO CROMATOGRAFÍA 8 .

 Recibe varios nombres: permeación en gel.CROMATOGRAFÍA EN GEL  Es una técnica en la que el fraccionamiento se basa. cromatografia de exclusión y cromatografia de tamizado.  La cromatografía en gel se efectúa en una columna por el método de elución. CROMATOGRAFÍA 9 . en el tamaño y la forma molecular de las especies de las muestras. por la menos en parte.

CROMATOGRAFÍA EN GEL  El grado de retardo depende del grado en que las moléculas o iones de soluto pueden penetrar en aquella parte de la fase de la solución que se mantiene dentro de los poros del material de empaque. que es un gel muy poroso. CROMATOGRAFÍA 10 .

CROMATOGRAFÍA 11 . mientras que las especies monores pueden penetrar en esta región más o menos libre.CROMATOGRAFÍA EN GEL  Las moléculas o iones mayores que los poros del gel son completamente excluidos del interior.

CROMATOGRAFÍA EN GEL CROMATOGRAFÍA 12 .

CROMATOGRAFÍA 13 .ASPECTOS DIFERENCIALES DE LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO CON RESPECTO A OTRAS MODALIDADES DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA.

4) Las características de la fase móvil no constituyen un factor decisivo en la descriminación entre los solutos. casi nunca se trabaja con gradiente de elución. 2) Teóricamente no existe interacción química ni fisico-química soluto-fase estacionaria.1) La fase estacionaria actúa de soporte inerte. aportando solo una porocidad controlada que retiene la fase móvil estancada. 3) El mecanismo de retención o retraso es atípico y se establece por entropía más que por entalpía. CROMATOGRAFÍA 14 .

sustancias poliméricas de amplio rango de pesos moleculares.5) La columna no se desactiva debido a su carácter fisico-químico inerte. en general. es decir. 8) Los solutos son. 7) Debido a que las fuerzas de retención son bajas los picos cromatográficos son estrechos. CROMATOGRAFÍA 15 . 6) La muestra solutos no sufren alteraciones por interacciones químicas irreversibles o cuasireversibles al pasar por la columna. con propiedades favorables para reducir solapamientos y facilitar la detección.

CROMATOGRAFÍA 16 . 10) Una de las propiedades de gran interes es la determinación de pesos moléculares y distribución de los mismos en mezclas complejas poliméricas. a excepción de la de afinidad. que posterirmente pueden ser cromatografiados por otras modalidades de la cromatografía de alto rendimiento (HPLC). 11) Es una metodología muy útil para fraccionar en grupos de mezclas complajas de solutos.9) El empleo de la modalidad de baja presión (configuración clásica) es mucho mas frecuente que en otras alternativas de la cromatografía líquida en columna.

 El sólido resultante contiene una gran cantidad de disolvente fijo en los intersticios de la red polimérica. CROMATOGRAFÍA 17 .CROMATOGRAFÍA EN GEL  Empaque de la columna: la fase estacionaria en la cromatografía de columna consiste en partículas esféricas de un polímero poroso que absorve facilmente el agua y se hincha a consecuencia de ello.

el sólido poroso de la estructura de gel ejerce una influencia decisiva a través del tamaño del poro y.EMPAQUE DE LA COLUMNA El concepto de fase estacionaria es vago en cromatografía de exclusión por tamaños. Por una parte. CROMATOGRAFÍA 18 . hay que considerar la fase móvil estancado en el volumen Vi que puede considerarse en el sentido laxo una fase estacionaria líquida. por otra parte.

CROMATOGRAFÍA 19 . en forma de pequeñas esferas. 4) Estabilidad química( cambios de pH.EMPAQUE DE LA COLUMNA Las características ideales de un material poroso. 2) Uniformidad en el tamaño de poro. insolubilidad en disolventes órgánicos). que debe reunir para alcanzar los objetivos básicos de la separación en cromatografía de exclusión por tamaño: 1) Uniformidad en el tamño de partícula. 3) Asequibilidad de materiales con un grado my diferente de porosidad. temperatura.

7) Resistencia mecánica cuando se trabaja en la modalidad CLAR. 6) Preparación previa sencilla y rápida. CROMATOGRAFÍA 20 .EMPAQUE DE LA COLUMNA 5) Máxima inercia frente a los solutos-analitos para evitar alteraciones que afecten la separación basada en en los diferentes tameños.

sintéticos y combinados.  Según su microestructura: aerogeles (en cuyos poros puede penetrar el aire).EMPAQUE DE LA COLUMNA Calsificacion de los materiales:  Según su naturaleza: orgánicos e inorgánicos.  Según la felxividad de su estructura: hinchables y rígidos.  Según su origen: naturales. CROMATOGRAFÍA 21 . xerogeles y mixtos aero-xerogeles.

generalmente. CROMATOGRAFÍA 22 . una estructura polimérica entrecruzada. La porosidad es de 7-300 nm. agarosas y poliestirenos. El rango de pesos moleculares esta comprendido entre 1E 03 y 1E 07. dextranos. Disponibles en el comercio como bio-glas. CPG y parasil.EMPAQUE DE LA COLUMNA  Los geles inorgánicos son aerogles y tienen estructura rígida de naturaleza silícia.  Los geles orgánicos tienen. Existen cuatro tipo fundamentales: poliacridamidas.

 Haciendo variar la cantidad de epiclorhidrina en el polímero. se obtiene una serie de resinas con diferentes tamaños de poro.EMPAQUE DE LA COLUMNA  Uno de los polímeros más usados se prepara por entrecruzamiento del polisacárido dextrano con epiclorhidrina (nombre comercial de Sephadex). CROMATOGRAFÍA 23 .

el tiempo de inchamiento oscila entre 3 horas (menos poroso) y 3 días (más poroso). CROMATOGRAFÍA 24 . con agua irviendo este intervalo es de 1 a 5 horas.EMPAQUE DE LA COLUMNA  A temperatura ambiente.

6 Vi 1.6 0.5 1 1 1 1 1 1.5 2.0 Vo 0.5 5 7 10 15 20 0.9 2 4 5 6 6 9 1500 5 000 10 000 50 000 100 000 150 000 200 000 25 PHARMACIA FINE CHEMICALS.9 LÍMITE DE EXCLUSIÓN APROXIMADO PESO MOL 700 G-15 G-25 G-50 G-75 G-100 G-150 G-200 0.PROPIEDADES DE LOS GELES SEPHADEX DESIGNACIÓN DEL GEL G-10 RALACIÓN DE VOLUMEN (ml/g DE GEL ORIGINAL) Vg 0. SUECIA CROMATOGRAFÍA .

N’-metil-bis-acrilamida como agente entrecruzante. CROMATOGRAFÍA 26 . cuya concentración en la mezcla sintética inicial determina la porosidad.EMPAQUE DE LA COLUMNA  Los geles de poliacridamida(biogeles) se obtiene por copolimerizción de la arcilamida (CH2=CHCO-NH2) con la N. Debe incharse previamente a su uso durante un tiempo que oscila entre 2 horas y un día a temperatura ambiente.

000 50.000-300.000 20.5 m 1.000-400.000-50.0 m 1.000 100.000 20.0 m 5.000-250.000 40.000 100.5 m 2.000 200.000 POLIESTIRENO (ESTIRAGLES) 60 100 400 1 E 03 5 E 03 10 E 03 30 E 03 1 E 05 3 E 05 5 E 05 10 E 05 800 2.000 8.000-150.000.000 6.000-2.000.000-5.000.000 50.000 10.000-150.0 m 50.000 1.000-1.000.000 500.TIPO POLICRILAMIDA (BIOGELES) P-2 P-4 P-6 P-10 P-30 P-60 P-100 P-150 P-200 P-300 RANGO DE FRACCIONAMIENTO PESO MOLECULAR 200-2.000.000 2.000-17.000-70.000 500-4.000 200.000 30.000 20.000 100.000.000-15.0 m 15.000-50.000 AGAROSA 0.000-5.000-700.000 10.000.000.000.0 m 150 m 10% 8% 6% 4% 2% 10.000-100.000 10.000 CROMATOGRAFÍA 27 .000 80.000 5.000 25.000.000 600.

su estructura reticular se debe a los enlaces de hidrógeno entre cadenas poliméricas naturales. La diferencia de porosidad se obtiene a partir de disoluciones con difeerentes concentraciones de agarosa.  Un inconveniente importante de los mismos es su inestabilidad: a) no puede emplearse a temperaturas superiores a 30°C. CROMATOGRAFÍA 28 . que no puede obtenerse con otros tipos de geles. b) el pH de la fase movil debe estar comprendido entre 6 y 8. Se caracteriza por su gran porosidad.EMPAQUE DE LA COLUMNA  Los geles de agarosa son de tipo natural.

b) tienen una estructura muy rígida lo que los hace especialmente adecuados para trabajar a alta presión (CLAR).  Los geles de poliestireno (styragles) son polímeros sintéticos derivados del estireno con divinilbenceno como agente entrecruzante. Presentan dos caracteristicas importantes: a) permiten cromatografiar sustancias con un amplio rango de peso molecular.EMPAQUE DE LA COLUMNA  C) son sensibles a ciertos agentes químicos como el borato. CROMATOGRAFÍA 29 . que interactuan con los grupos hidroxilo rompiendo la estructura entrecruzada.

EMPAQUE DE LA COLUMNA  Tienen el inconveniente de facilitar las retenciones no específicas debido a fenómenos de adsorción. CROMATOGRAFÍA 30 . en especial con proteinas.

Vi volumen interno de las partículas porosas que contienen la fase móvil estancada.TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL  Volumen total de la columna rellena con un gel hinchado en agua (u otro disolvente) está dado por: Vt = Vg + Vi + Vo donde: Vg volumen ocupado por la matriz sólida del gel. Vo volumen libre correspondientes a los intersticios de las partículas porosas. CROMATOGRAFÍA 31 .

por ello.TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL En este tipo peculiar de cromatografía. Una separación se completa cuando un volumen de fase móvil equivalente al volumen total ha pasado a través de la columna. por lo que el concepto de retención es muy diferentes. el volumen de elución será menor o igual que el volumen vacío (Ve<Vt). CROMATOGRAFÍA 32 . la retención se basa en la distirbución del soluto entre dos fases móviles miscibles: la externa y la interna o estancada.

CROMATOGRAFÍA 33 . y el volumen interno de los poros.TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL Para caracterizar el comportamiento de un soluto en una columna de exclusión por tamaño se utiliza el denominado coeficiente de partición: KAV = Ve – VO Vi Este se define como la ralación de la diferencia entre los volumenes de elución e intersticial.

por lo que su valor decrecerá al aumentar el peso molecular del mismo. La concentración del soluto dentro de los poros en la fase móvil estancada decrece al aumentar el tamaño del soluto. CROMATOGRAFÍA 34 .TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL Este coeficiente de partición corresponde a la relación entre las concentraciones medias del soluto en la fase móvil dentro (Ci) y fuera (Co) del material poroso (KAV = Ci/Co).

Cuando su valor es nulo. el soluto tiene la máxima penetrabilidad (movilidad) entre los poros. Caundo KAV = 1. por lo que el volumen de elución coincide con el intersticial ( Ve = Vo ). Se define el límite de exclusión como el tamaño mínimo (peso molecular mínimo) para que el soluto sea excluido . CROMATOGRAFÍA 35 . el soluto es totalmente excluido. por lo que el volumen de elución conincidirá con el volumen total de la fase móvil de la columna de exclusión (Ve = Vo + Vi + Vt).El valor del coeficiente de partición oscila entre 0 y 1.

Vo y Vt son los volumenes límites entre los cuales debe situarse los volumenes de elución de la mezcla de analitos-solutos. CROMATOGRAFÍA 36 .Así pues.

CROMATOGRAFÍA 37 .

en ausencia de interacciones adicionales. CROMATOGRAFÍA 38 .La cromatografía de exclusión por tamaño es más restringida que otras modalidades de cromatografía en columna. la variación del coeficiente de partición está restringido entre 0 y 1. al contrario la amplia variabilidad de otras constantes que rigen otros procesos cromatográficos. lo que básicamente se debe a que.

la contribución a la difusión longitudinal puede prácticamente despreciarse. Debido que las substancias de alto peso molecular tienen coeficientes de difusión muy bajos. CROMATOGRAFÍA 39 . la altura equivalente de plato teórico se debe exclusivamente a la dispersión del soluto en la fase móvil interna o estancada y la trasferencia de materia entre las dos fases móviles internas y externa.TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL En este tipo de cromatografía.

TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL CAPACIDAD DE PICOS EN DISTINTOS TIPOS DE CROMATOGRAFÍA NÚMERO MÁXIMO DE PICOS EN CROMATOGRAFÍA PLATOS TEÓRICOS GASES LIQUIDA EXCLUSIÓN 400 21 13 5 2500 51 31 11 10000 101 61 21 CROMATOGRAFÍA 40 .

CROMATOGRAFÍA 41 .CROMATOGRAFÍA POR GEL VOLUMEN DE ELUCIÓN:  Para moléculas de tamaño intermedio es : Ve = Vo + KAV(Vi)  Para moléculas demasiado grandes para penetrar en los poros de gel: KAV = 0 y Ve = Vo  Para moléculas de que pueden entrar en los poros sin obstáculos KAV = 1 y Ve = ( Vo + Vi ).

entre las moléculas del soluto y la superficie del gel.CROMATOGRAFÍA POR GEL  Esto con el supuesto de que no hay interacción. por ejemplo como adsorción. En caso contrario. aumentaría la cantidad de soluto retenido en los intersticios. KAV sería mayor que la unidad. CROMATOGRAFÍA 42 . para solutos que actúa entre sí y que pueden penetrar libremente en los poros.

Viscocidad. Porosidad. Fuerza iónica. Temperatura.FACTORES QUE AFECTAN A LA RESOLUCIÓN  Relación con el material cromatográfico: Tamño de partícula.  En relación con la fase móvil: Caudal. pH CROMATOGRAFÍA 43 .

CROMATOGRAFÍA 44 . Configuración espacial.  En relación con la columna cromatográfica: Longitud. Empaquetamiento. Cantidad o concentración.FACTORES QUE AFECTAN A LA RESOLUCIÓN  En relación con la muestra: Peso molecular.

CROMATOGRAFÍA 45 .APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL. como Sephadex G-25 y G-50 han encontrado amplia aplicación a la desalación o eliminación de moléculas de bajo peso molecular.  En geles muy entrecruzados con tamaños de poro pequeño. de moléculas de productos naturales de alto peso molecular.

albúmina sérica. tripsina. ribonucleasa. hemogobina fibrinógeno.APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL.  Los geles Sephadex G-25 y G-50 han resultado útilies también para el fraccionamiento péptidos que tiene un tamaño intermedio entre algunas proteinas.) CROMATOGRAFÍA 46 .(triptófano. glicina.

CROMATOGRAFÍA 47 . y polisacáridos. ácidos nucleicos.APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL.  La cromatografía en gel es usada por los químicos de polímeros y los bioquímicos para la estimación de pesos moleculares de moléculas grandes.  Las geles más porosos han encontrado una gran aplicación al fraccionamiento y purificación de macromoléculas como proteinas.

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL. el volumen de elución de la incognita se conpara con los volúmenes de elución de una serie de compuestos estandar que tienen las mismas caracteristicas químicas. En este caso. CROMATOGRAFÍA 48 .

También se utiliza para la separación de aminoácidos y otros ácidos y bases inorgánicas. Por lo tanto.CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Las resinas de intercambio iónico se encuentran entre los empaques más utilizados para la cromatografía de columna. la cromatografia de intercambio iónico es muy utilizada en química inorgánica. A diferencia de los demás métodos en columna. el disolvente es por lo general agua y las especies a separar son iones. CROMATOGRAFÍA 49 .

Muchas substancias. actúan como intercambiadores de iones. Entre las primeras se encuentran las arcillas y las ceolitas. tanto naturales como sintéticas.CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO El intercambio iónoico es un proceso en el cual ocurre un intercambio de inones de signo igual entre una solución y un sólido esencialmente insoluble en contacto con la solución. CROMATOGRAFÍA 50 .

Para el intercambio de cationes se puede escoger entre resinas ácidas fuertes que contienen grupos de ácidos sulfónico ( RSO3-H+ ) y resinas ácidas débiles que contienen grupos de ácidos carboxilicos ( RCOOH ). CROMATOGRAFÍA 51 . Las primeras tienen una aplicación más amplia.CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Las resinas sintéticas de intercambio iónico son polímeros de alto peso molecular que contienen gran números de grupos funcionales iónicos por moléculas.

CROMATOGRAFÍA 52 . y los básicos débiles contienen aminas secundarias y terciarias.CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Las resinas de intercambio de aniones contienen grupos funcionales básicos adheridos a la molécula del polímero. Estas son generalmente aminas. Los intercambiadores básicos fuertes contienen aminas cuaternarias (RN(CH3)3+OH-).

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Un proceso de intercambio catiónico se ilustra por el equilibrio: xRSO3 H   M x   RSO3 x M x   xH  Sólido solución sólido solución   Donde: Mx+ representa un catión R representa una parte de la molécula de resina. CROMATOGRAFÍA 53 .

CROMATOGRAFÍA 54 .CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO El proceso análogo en el que interviene una resina de intercambio de aniones típicas se escribe: xRN(CH ) OH  A  RNCH  3 3  x   3 3 x  A x  xOH  sólido solución sólido solución Donde Ax-es un anión.

ademas del fenómeno de intercambio de iones. b) Partición en sus dos modalidades: de fase invertida con una alta proporción de un disolvente orgánica en el interior de la resinade bajo entrecruzamiento.CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Debe indicarse que la interacción entre el soluto orgánico y el material cambiador ( generalmente una resina de poliestireno) es muy compleja ya que. se producen otros fenómenos: a) Adsorción por efecto de la matriz polimérica hidrocarbonada de la resina. CROMATOGRAFÍA 55 .

CROMATOGRAFÍA 56 .CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO c) Exclusión de iones. d) Intercambio de ligados entre un complejo catiónico retendo y los solutos-ligados a la fase móvil.

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