CROMATOGRAFÍA

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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓNADSORCIÓN MOLECULAR Y DE FILTRACIÓN POR GEL

Conceptos Básicos
 LA SORCIÓN O ADSORCIÓN:

es la transferencia selectiva de uno o más solutos de una fase fluida a un lote de partículas sólidas.  La selectividad común de un sorbente entre el soluto y el fluido portador o entre varios solutos, hace posible la separación entre ciertos solutos presentes en el fluido portador o entre sí.
CROMATOGRAFÍA 2

Conceptos Básicos
 ADSORCIÓN:

los adsorbentes son materiales naturales o sintéticos de estructura amorfa y microcristalina altamente poros con áreas internas muy grandes por unidad de volumen.  Adsorbentes: carbón activado, alúmina activada, gel de sílice, tierra de fuller, otras arcillas y mallas moleculares.  La adsorción es causada por lo general por las furzas intermoleculares (furezas de Van der Waals)a temperartura ordianria, ADSORCIÓN FÍSICA O FISIOSORCIÓN.
CROMATOGRAFÍA 3

Conceptos Básicos
 A temperaturas más elevadas ( arriba,

aproximadamente,de 200 a 400 °F) se dispone de la energía de activación necesaria para hacer o romper las uniones químicas QUIMIOSORCIÓN.  Elución: es un proceso en el cual los solutos son lavados a través de una fase estacionaria por el movimiento de una fase móvil.
CROMATOGRAFÍA 4

Conceptos Básicos
 Eluyente: es un disolvente que se usa para

llevar los componentes de una mezcla a través de una fase estacionaria.

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32 PIRIDINA n-PROPANOL METANOL 0.Conceptos Básicos DISOLVENTE POTENCIA ELUYENTE E -0.71 0.18 0. DEKKER.56 0.30 0.04 DISOLVENTE POTENCIA ELUYENTE E 0.25 0.40 0.01 0. 1968 CROMATOGRAFÍA 6 . PRINCIPLES OF ADSORPTION CHROMATOFRAPHY.00 0.63 FLUOROCARBONOS CLOROFORMO METILETILCETONA N-PENTANO ETER DE PETROLEO ACETONA DIETILETILAMINA CICLOHEXANO TETRACLORURO DE CARBONO CLORURO DE n-PROPILO 0. SNYDER. NEW YORK.R.95 BENCENO L.51 0.82 0.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA  Se utiliza un tubo de vidrio con un diámetro de alrededor de 10 a 50 mm que sostiene una columna de partículas sólidas las cuales constituye la fase estacionaria CROMATOGRAFÍA 7 .

PROCESO CROMATOGRAFÍA 8 .

 Recibe varios nombres: permeación en gel. en el tamaño y la forma molecular de las especies de las muestras. CROMATOGRAFÍA 9 . cromatografia de exclusión y cromatografia de tamizado.  La cromatografía en gel se efectúa en una columna por el método de elución. por la menos en parte.CROMATOGRAFÍA EN GEL  Es una técnica en la que el fraccionamiento se basa.

CROMATOGRAFÍA 10 .CROMATOGRAFÍA EN GEL  El grado de retardo depende del grado en que las moléculas o iones de soluto pueden penetrar en aquella parte de la fase de la solución que se mantiene dentro de los poros del material de empaque. que es un gel muy poroso.

mientras que las especies monores pueden penetrar en esta región más o menos libre.CROMATOGRAFÍA EN GEL  Las moléculas o iones mayores que los poros del gel son completamente excluidos del interior. CROMATOGRAFÍA 11 .

CROMATOGRAFÍA EN GEL CROMATOGRAFÍA 12 .

ASPECTOS DIFERENCIALES DE LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO CON RESPECTO A OTRAS MODALIDADES DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA. CROMATOGRAFÍA 13 .

CROMATOGRAFÍA 14 . 2) Teóricamente no existe interacción química ni fisico-química soluto-fase estacionaria.1) La fase estacionaria actúa de soporte inerte. 3) El mecanismo de retención o retraso es atípico y se establece por entropía más que por entalpía. 4) Las características de la fase móvil no constituyen un factor decisivo en la descriminación entre los solutos. aportando solo una porocidad controlada que retiene la fase móvil estancada. casi nunca se trabaja con gradiente de elución.

8) Los solutos son. es decir.5) La columna no se desactiva debido a su carácter fisico-químico inerte. CROMATOGRAFÍA 15 . con propiedades favorables para reducir solapamientos y facilitar la detección. en general. sustancias poliméricas de amplio rango de pesos moleculares. 6) La muestra solutos no sufren alteraciones por interacciones químicas irreversibles o cuasireversibles al pasar por la columna. 7) Debido a que las fuerzas de retención son bajas los picos cromatográficos son estrechos.

11) Es una metodología muy útil para fraccionar en grupos de mezclas complajas de solutos. que posterirmente pueden ser cromatografiados por otras modalidades de la cromatografía de alto rendimiento (HPLC). 10) Una de las propiedades de gran interes es la determinación de pesos moléculares y distribución de los mismos en mezclas complejas poliméricas. a excepción de la de afinidad.9) El empleo de la modalidad de baja presión (configuración clásica) es mucho mas frecuente que en otras alternativas de la cromatografía líquida en columna. CROMATOGRAFÍA 16 .

CROMATOGRAFÍA 17 .CROMATOGRAFÍA EN GEL  Empaque de la columna: la fase estacionaria en la cromatografía de columna consiste en partículas esféricas de un polímero poroso que absorve facilmente el agua y se hincha a consecuencia de ello.  El sólido resultante contiene una gran cantidad de disolvente fijo en los intersticios de la red polimérica.

el sólido poroso de la estructura de gel ejerce una influencia decisiva a través del tamaño del poro y. por otra parte.EMPAQUE DE LA COLUMNA El concepto de fase estacionaria es vago en cromatografía de exclusión por tamaños. hay que considerar la fase móvil estancado en el volumen Vi que puede considerarse en el sentido laxo una fase estacionaria líquida. CROMATOGRAFÍA 18 . Por una parte.

insolubilidad en disolventes órgánicos).EMPAQUE DE LA COLUMNA Las características ideales de un material poroso. 3) Asequibilidad de materiales con un grado my diferente de porosidad. 4) Estabilidad química( cambios de pH. en forma de pequeñas esferas. 2) Uniformidad en el tamaño de poro. temperatura. CROMATOGRAFÍA 19 . que debe reunir para alcanzar los objetivos básicos de la separación en cromatografía de exclusión por tamaño: 1) Uniformidad en el tamño de partícula.

6) Preparación previa sencilla y rápida.EMPAQUE DE LA COLUMNA 5) Máxima inercia frente a los solutos-analitos para evitar alteraciones que afecten la separación basada en en los diferentes tameños. CROMATOGRAFÍA 20 . 7) Resistencia mecánica cuando se trabaja en la modalidad CLAR.

CROMATOGRAFÍA 21 .  Según la felxividad de su estructura: hinchables y rígidos.  Según su origen: naturales. xerogeles y mixtos aero-xerogeles.EMPAQUE DE LA COLUMNA Calsificacion de los materiales:  Según su naturaleza: orgánicos e inorgánicos.  Según su microestructura: aerogeles (en cuyos poros puede penetrar el aire). sintéticos y combinados.

CROMATOGRAFÍA 22 .EMPAQUE DE LA COLUMNA  Los geles inorgánicos son aerogles y tienen estructura rígida de naturaleza silícia. una estructura polimérica entrecruzada. El rango de pesos moleculares esta comprendido entre 1E 03 y 1E 07. CPG y parasil. Disponibles en el comercio como bio-glas. generalmente. dextranos.  Los geles orgánicos tienen. agarosas y poliestirenos. La porosidad es de 7-300 nm. Existen cuatro tipo fundamentales: poliacridamidas.

 Haciendo variar la cantidad de epiclorhidrina en el polímero. se obtiene una serie de resinas con diferentes tamaños de poro.EMPAQUE DE LA COLUMNA  Uno de los polímeros más usados se prepara por entrecruzamiento del polisacárido dextrano con epiclorhidrina (nombre comercial de Sephadex). CROMATOGRAFÍA 23 .

con agua irviendo este intervalo es de 1 a 5 horas. el tiempo de inchamiento oscila entre 3 horas (menos poroso) y 3 días (más poroso).EMPAQUE DE LA COLUMNA  A temperatura ambiente. CROMATOGRAFÍA 24 .

PROPIEDADES DE LOS GELES SEPHADEX DESIGNACIÓN DEL GEL G-10 RALACIÓN DE VOLUMEN (ml/g DE GEL ORIGINAL) Vg 0.6 0.9 2 4 5 6 6 9 1500 5 000 10 000 50 000 100 000 150 000 200 000 25 PHARMACIA FINE CHEMICALS.5 2.6 Vi 1.5 5 7 10 15 20 0. SUECIA CROMATOGRAFÍA .5 1 1 1 1 1 1.0 Vo 0.9 LÍMITE DE EXCLUSIÓN APROXIMADO PESO MOL 700 G-15 G-25 G-50 G-75 G-100 G-150 G-200 0.

CROMATOGRAFÍA 26 . Debe incharse previamente a su uso durante un tiempo que oscila entre 2 horas y un día a temperatura ambiente. cuya concentración en la mezcla sintética inicial determina la porosidad.N’-metil-bis-acrilamida como agente entrecruzante.EMPAQUE DE LA COLUMNA  Los geles de poliacridamida(biogeles) se obtiene por copolimerizción de la arcilamida (CH2=CHCO-NH2) con la N.

000 80.000.000-5.0 m 1.000 20.000 AGAROSA 0.000.000 6.000 10.000 100.000 50.000 8.000 25.5 m 2.TIPO POLICRILAMIDA (BIOGELES) P-2 P-4 P-6 P-10 P-30 P-60 P-100 P-150 P-200 P-300 RANGO DE FRACCIONAMIENTO PESO MOLECULAR 200-2.000 50.0 m 15.000-17.000-2.000 200.5 m 1.000-150.000 POLIESTIRENO (ESTIRAGLES) 60 100 400 1 E 03 5 E 03 10 E 03 30 E 03 1 E 05 3 E 05 5 E 05 10 E 05 800 2.000 2.000 40.000 20.000.000.000.0 m 5.000 500-4.000-300.000 CROMATOGRAFÍA 27 .000.0 m 150 m 10% 8% 6% 4% 2% 10.000 100.000 30.000.000 600.000-100.000-400.0 m 50.000-250.000-1.000-50.000-150.000.000.000-700.000-50.000-5.000 5.000 500.000 10.000 20.000 100.000-15.000.000 10.000 200.000-70.000 1.

que no puede obtenerse con otros tipos de geles. La diferencia de porosidad se obtiene a partir de disoluciones con difeerentes concentraciones de agarosa. CROMATOGRAFÍA 28 . su estructura reticular se debe a los enlaces de hidrógeno entre cadenas poliméricas naturales. Se caracteriza por su gran porosidad.EMPAQUE DE LA COLUMNA  Los geles de agarosa son de tipo natural.  Un inconveniente importante de los mismos es su inestabilidad: a) no puede emplearse a temperaturas superiores a 30°C. b) el pH de la fase movil debe estar comprendido entre 6 y 8.

que interactuan con los grupos hidroxilo rompiendo la estructura entrecruzada. Presentan dos caracteristicas importantes: a) permiten cromatografiar sustancias con un amplio rango de peso molecular.EMPAQUE DE LA COLUMNA  C) son sensibles a ciertos agentes químicos como el borato. CROMATOGRAFÍA 29 . b) tienen una estructura muy rígida lo que los hace especialmente adecuados para trabajar a alta presión (CLAR).  Los geles de poliestireno (styragles) son polímeros sintéticos derivados del estireno con divinilbenceno como agente entrecruzante.

EMPAQUE DE LA COLUMNA  Tienen el inconveniente de facilitar las retenciones no específicas debido a fenómenos de adsorción. en especial con proteinas. CROMATOGRAFÍA 30 .

Vo volumen libre correspondientes a los intersticios de las partículas porosas.TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL  Volumen total de la columna rellena con un gel hinchado en agua (u otro disolvente) está dado por: Vt = Vg + Vi + Vo donde: Vg volumen ocupado por la matriz sólida del gel. Vi volumen interno de las partículas porosas que contienen la fase móvil estancada. CROMATOGRAFÍA 31 .

la retención se basa en la distirbución del soluto entre dos fases móviles miscibles: la externa y la interna o estancada. CROMATOGRAFÍA 32 .TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL En este tipo peculiar de cromatografía. por ello. Una separación se completa cuando un volumen de fase móvil equivalente al volumen total ha pasado a través de la columna. por lo que el concepto de retención es muy diferentes. el volumen de elución será menor o igual que el volumen vacío (Ve<Vt).

y el volumen interno de los poros. CROMATOGRAFÍA 33 .TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL Para caracterizar el comportamiento de un soluto en una columna de exclusión por tamaño se utiliza el denominado coeficiente de partición: KAV = Ve – VO Vi Este se define como la ralación de la diferencia entre los volumenes de elución e intersticial.

por lo que su valor decrecerá al aumentar el peso molecular del mismo. CROMATOGRAFÍA 34 .TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL Este coeficiente de partición corresponde a la relación entre las concentraciones medias del soluto en la fase móvil dentro (Ci) y fuera (Co) del material poroso (KAV = Ci/Co). La concentración del soluto dentro de los poros en la fase móvil estancada decrece al aumentar el tamaño del soluto.

Se define el límite de exclusión como el tamaño mínimo (peso molecular mínimo) para que el soluto sea excluido . Caundo KAV = 1. Cuando su valor es nulo.El valor del coeficiente de partición oscila entre 0 y 1. CROMATOGRAFÍA 35 . el soluto es totalmente excluido. por lo que el volumen de elución conincidirá con el volumen total de la fase móvil de la columna de exclusión (Ve = Vo + Vi + Vt). por lo que el volumen de elución coincide con el intersticial ( Ve = Vo ). el soluto tiene la máxima penetrabilidad (movilidad) entre los poros.

Así pues. Vo y Vt son los volumenes límites entre los cuales debe situarse los volumenes de elución de la mezcla de analitos-solutos. CROMATOGRAFÍA 36 .

CROMATOGRAFÍA 37 .

La cromatografía de exclusión por tamaño es más restringida que otras modalidades de cromatografía en columna. al contrario la amplia variabilidad de otras constantes que rigen otros procesos cromatográficos. CROMATOGRAFÍA 38 . en ausencia de interacciones adicionales. lo que básicamente se debe a que. la variación del coeficiente de partición está restringido entre 0 y 1.

CROMATOGRAFÍA 39 . la altura equivalente de plato teórico se debe exclusivamente a la dispersión del soluto en la fase móvil interna o estancada y la trasferencia de materia entre las dos fases móviles internas y externa.TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL En este tipo de cromatografía. la contribución a la difusión longitudinal puede prácticamente despreciarse. Debido que las substancias de alto peso molecular tienen coeficientes de difusión muy bajos.

TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA POR GEL CAPACIDAD DE PICOS EN DISTINTOS TIPOS DE CROMATOGRAFÍA NÚMERO MÁXIMO DE PICOS EN CROMATOGRAFÍA PLATOS TEÓRICOS GASES LIQUIDA EXCLUSIÓN 400 21 13 5 2500 51 31 11 10000 101 61 21 CROMATOGRAFÍA 40 .

CROMATOGRAFÍA 41 .CROMATOGRAFÍA POR GEL VOLUMEN DE ELUCIÓN:  Para moléculas de tamaño intermedio es : Ve = Vo + KAV(Vi)  Para moléculas demasiado grandes para penetrar en los poros de gel: KAV = 0 y Ve = Vo  Para moléculas de que pueden entrar en los poros sin obstáculos KAV = 1 y Ve = ( Vo + Vi ).

CROMATOGRAFÍA 42 . para solutos que actúa entre sí y que pueden penetrar libremente en los poros. aumentaría la cantidad de soluto retenido en los intersticios.CROMATOGRAFÍA POR GEL  Esto con el supuesto de que no hay interacción. KAV sería mayor que la unidad. por ejemplo como adsorción. En caso contrario. entre las moléculas del soluto y la superficie del gel.

pH CROMATOGRAFÍA 43 .  En relación con la fase móvil: Caudal. Porosidad.FACTORES QUE AFECTAN A LA RESOLUCIÓN  Relación con el material cromatográfico: Tamño de partícula. Viscocidad. Temperatura. Fuerza iónica.

FACTORES QUE AFECTAN A LA RESOLUCIÓN  En relación con la muestra: Peso molecular.  En relación con la columna cromatográfica: Longitud. Cantidad o concentración. Empaquetamiento. CROMATOGRAFÍA 44 . Configuración espacial.

 En geles muy entrecruzados con tamaños de poro pequeño. de moléculas de productos naturales de alto peso molecular. CROMATOGRAFÍA 45 . como Sephadex G-25 y G-50 han encontrado amplia aplicación a la desalación o eliminación de moléculas de bajo peso molecular.APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL.

) CROMATOGRAFÍA 46 . glicina.  Los geles Sephadex G-25 y G-50 han resultado útilies también para el fraccionamiento péptidos que tiene un tamaño intermedio entre algunas proteinas. tripsina.(triptófano.APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL. albúmina sérica. hemogobina fibrinógeno. ribonucleasa.

y polisacáridos. CROMATOGRAFÍA 47 .APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL.  La cromatografía en gel es usada por los químicos de polímeros y los bioquímicos para la estimación de pesos moleculares de moléculas grandes.  Las geles más porosos han encontrado una gran aplicación al fraccionamiento y purificación de macromoléculas como proteinas. ácidos nucleicos.

CROMATOGRAFÍA 48 . el volumen de elución de la incognita se conpara con los volúmenes de elución de una serie de compuestos estandar que tienen las mismas caracteristicas químicas. En este caso.APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA EN GEL.

el disolvente es por lo general agua y las especies a separar son iones. A diferencia de los demás métodos en columna. la cromatografia de intercambio iónico es muy utilizada en química inorgánica. También se utiliza para la separación de aminoácidos y otros ácidos y bases inorgánicas. CROMATOGRAFÍA 49 . Por lo tanto.CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Las resinas de intercambio iónico se encuentran entre los empaques más utilizados para la cromatografía de columna.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO El intercambio iónoico es un proceso en el cual ocurre un intercambio de inones de signo igual entre una solución y un sólido esencialmente insoluble en contacto con la solución. actúan como intercambiadores de iones. tanto naturales como sintéticas. CROMATOGRAFÍA 50 . Muchas substancias. Entre las primeras se encuentran las arcillas y las ceolitas.

Para el intercambio de cationes se puede escoger entre resinas ácidas fuertes que contienen grupos de ácidos sulfónico ( RSO3-H+ ) y resinas ácidas débiles que contienen grupos de ácidos carboxilicos ( RCOOH ). CROMATOGRAFÍA 51 . Las primeras tienen una aplicación más amplia.CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Las resinas sintéticas de intercambio iónico son polímeros de alto peso molecular que contienen gran números de grupos funcionales iónicos por moléculas.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Las resinas de intercambio de aniones contienen grupos funcionales básicos adheridos a la molécula del polímero. y los básicos débiles contienen aminas secundarias y terciarias. Estas son generalmente aminas. CROMATOGRAFÍA 52 . Los intercambiadores básicos fuertes contienen aminas cuaternarias (RN(CH3)3+OH-).

CROMATOGRAFÍA 53 .CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Un proceso de intercambio catiónico se ilustra por el equilibrio: xRSO3 H   M x   RSO3 x M x   xH  Sólido solución sólido solución   Donde: Mx+ representa un catión R representa una parte de la molécula de resina.

CROMATOGRAFÍA 54 .CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO El proceso análogo en el que interviene una resina de intercambio de aniones típicas se escribe: xRN(CH ) OH  A  RNCH  3 3  x   3 3 x  A x  xOH  sólido solución sólido solución Donde Ax-es un anión.

CROMATOGRAFÍA 55 . b) Partición en sus dos modalidades: de fase invertida con una alta proporción de un disolvente orgánica en el interior de la resinade bajo entrecruzamiento.CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Debe indicarse que la interacción entre el soluto orgánico y el material cambiador ( generalmente una resina de poliestireno) es muy compleja ya que. ademas del fenómeno de intercambio de iones. se producen otros fenómenos: a) Adsorción por efecto de la matriz polimérica hidrocarbonada de la resina.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO c) Exclusión de iones. CROMATOGRAFÍA 56 . d) Intercambio de ligados entre un complejo catiónico retendo y los solutos-ligados a la fase móvil.

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