Biosensor de Glucosa Basado en Electrodo de Acero Inoxidable Electrodepositado con xido de Iridio y Glucosa Oxidasa

Carmen C. Mayorga Martinez, Rossana E. Madrid, Carmelo J. Felice Laboratorio de Medios e Interfaces (LAMEIN)-DBI-FACET-UNT-INSIBIO-CONICET 4000, Tucuman, Argentina cmayorga@herrera.unt.edu.ar, carmen.mayorga@gmail.com

Abstract Se presenta a continuacin el desarrollo de un biosensor de glucosa (Glu) utilizando un electrodo de acero inoxidable como sustrato sobre el cual se electrodeposit xido de iridio (IrOx) y glucosa oxidasa (GOx). Se ha reportado en numerosas publicaciones la especificidad y sensibilidad de la GOx inmovilizada por diferentes mtodos sobre sustratos de diferentes materiales para sensar Glu en fluidos biolgicos, alimentos, bebidas y licores de fermentacin. Un material promisorio para inmovilizar GOx, es el IrOx. Las caractersticas de este xido, posibilitaran la miniaturizacin, haciendo posible la implementacin de microsistemas para el sensado de Glu. Mediante tcnicas voltamperomtricas se determin que el potencial por medio del cual el IrOx electro-oxida al perxido de hidrogeno (H2O2) es de 300mV. La evaluacin de la respuesta amperomtrica del biosensor frente a las diferentes concentraciones de Glu, permiten obtener una curva de calibracin Corriente [A] 2 Concentracin de Glu [mM] con un alto ndice de correlacin de R = 0,97. Keywords: Electrodeposicin, mtodos de inmovilizacin, microsistemas, nanoparticulas, xidos metlicos. siendo la corriente que fluye en el sistema potenciosttico directamente proporcional a la concentracin de la glucosa [4]. El inters de simplificar los procesos analticos para la deteccin de glucosa surge de la necesidad de automatizarlos, disminuir el tiempo de medicin y el volumen de muestra. En este sentido, el mtodo de inmovilizacin empleado, toma gran importancia a la hora de miniaturizar el sistema y elegir la tecnologa microelectrnica que facilitar la adquisicin de corrientes que estn en el orden de los mA y A. Se han reportado numerosos mtodos de inmovilizacin de la GOx en electrodos modificados con diferentes materiales, entre ellos, polmeros, resinas, pelculas de materiales orgnicos, multicapas autoensambladas, nanoparticulas de oro, pasta de grafito, nanotubos de carbn y carbn vtreo, entre otros. Recientemente, la combinacin de molculas biolgicas (ejemplo GOx) con nanomateriales, como partculas y nanoparticulas de xidos metlicos, han

Introduccin En la actualidad, el desarrollo de biosensores enzimticos miniaturizados capaces de sensar la actividad cataltica de enzimas con sus respectivos sustratos ha despertado un gran inters. Una de las enzimas ms ampliamente usadas es la Glucosa oxidasa (GOx), empleada para sensar Glucosa (Glu) en fluidos biolgicos, alimentos, bebidas y licores de fermentacin [1], [2], [3] . Este mtodo es considerado como el ms sensible y especfico usado para la cuantificacin de Glu. Su fundamento terico se basa en la oxidacin biocataltica de sta en presencia de la GOx [4],[5]: Glu + O2
GOx

cido Gluconico + H2O2

(1)

La determinacin amperomtrica convencional del biosensor de Glu se basa en la electro-oxidacin del perxido de hidrogeno (H2O2), producto de la reaccin (1), a travs de la aplicacin de un potencial positivo [4]: H2O2
DC

O2+ 2H + 2e

(2)

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generado mucho inters. Tal es el caso del xido de magnesio, xido de zirconio, xido de titanio, xido de tungsteno, xido de hierro, xido de nquel, xido de iridio y xido de cobre [1] [5]. El xido de iridio (IrOx) en particular, es un xido nanoporoso con un tamao de poros de 20-30 nm, espacio suficientemente grande como para contener una molcula de GOx, cuyo tamao es de 14-18 nm de largo y 5-8 nm de ancho [7], [8]. Adems, este xido es un excelente conductor [7], biocompatible, estable [8] y posee una muy baja impedancia de interface electrodo-electrolito [7]. Las caractersticas antes mencionadas hacen de este sustrato un material muy promisorio para ser usado en un microsistema de sensado de Glu. Por medio de la tcnica potenciodinmica es posible obtener de manera fcil y relativamente rpida, pelculas estables de IrOx electrodepositadas (EIROF), usando acero inoxidable como sustrato [7]. La bibliografa reporta dos mtodos de inmovilizacin de GOx sobre una punta de Iridio. En uno de ellos se aplica un potencial para electro-oxidar y obtener el IrOx e inmovilizar la GOx en simultaneo, y en el otro, se sumerge por 5 min el electrodo, previamente electrodepositado, en una solucin concentrada de GOx, repitiendo el procedimiento 9 veces [8]. En este trabajo se construye y evala un biosensor de Glu basado en un electrodo de acero inoxidable electrodepositado con IrOx y GOx. Para esto, se determina primero el potencial al cual el xido de Iridio electrooxida al H2O2 y luego, se evala el mtodo de inmovilizacin de la GOx sobre un electrodo de acero inoxidable previamente electrodepositado con xido de iridio xido. Por ltimo, se evala la respuesta cronoamperomtrica del biosensor para verificar la inmovilizacin de la enzima. Materiales y Mtodos Para la formacin de las pelculas EIROF, se prepara la solucin de electrodeposicin compuesta por tetracloruro de iridio hidratado IrCl4 al 99.9% (Aldrich), cido oxlico dihidratado 99.5% (Fluka), carbonato de Potasio anhidro K2CO3 99.0% (FluKa). Glucosa oxidasa tipo VII de Aspergillus Nger 100 unidades/g (sigma), cloruro de potasio y Glucosa-D anhidra (Ciccarelli), perxido de hidrogeno 10 volmenes (Parafarm). Todas las soluciones fueron preparadas con agua destilada (5S). La celda empleada para la
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electrodeposicin y para las mediciones voltamperomtricas y amperomtricas es tripolar y de vidrio construida en el laboratorio (Figura 1). Posee un contraelectrodo que es una semiesfera de acero inoxidable AISI 304 de 46 mm de dimetro y un electrodo de Ag/AgCl como referencia. Los electrodos de trabajo son cilindros de acero inoxidable AISI 316L de 5 mm de dimetro. El equipo utilizado para las mediciones es un SOLARTRON 12508W constituido por un Analizador de Respuesta en Frecuencia (Solartron 1250) y un analizador de Interfase Electroqumica (Solartron SI1287), este ltimo comandado por el software provisto por el fabricante (CorrView).
CE
ER ET

Fig.1:Celda de electrodeposicin (ET Electrodo de trabajo, ER Electrodo de referencia y CE Contraelectrodo)

Pulido de los electrodos Cada electrodo se pule utilizando lijas de diferentes rugosidades, pasta de diamante y polvo de almina para obtener una superficie pulida a 1 m siguiendo los pasos enumerados en la Tabla 1.
Tabla 1. Protocolo de pulido (*El tamao del grano corresponde a la norma europea FEPA Standard 43-GB984 (R1993) [9])

N de Pasos 1 2 3 4 5 6 7

Tipo de abrasivo

Tamao del grano (m) FEPA

*

Lija 120 BUEHLER Lija 240 BUEHLER Lija 400 BUEHLER Lija 600 BUEHLER Pasta de Diamante Prazis y pao No. 40- 7068 Pasta de Diamante Prazis y pao No. 40-7068 Polvo de Almina Prazis y pao No. 40-7218

127 58.5 35 15.3 6 3 1

Luego del pulido los electrodos son limpiados por ultrasonido en una solucin de alcohol isoproplico: agua (1:1). Preparacin de Electrodeposicin la solucin de

su uso. Determinacin Voltamperomtrica del potencial de electro-oxidacin del H2O2 En la celda (Fig. 1) se sumerge un electrodo EIROF en una solucin buffer de pH 7 conteniendo 0,1 M KCl. Las condiciones de medicin empleadas para la realizacin del voltamperograma son: Velocidad de barrido 10mV/s y ventana de potencial de 0.2V a 0.5V vs. Ag/AgCl. Utilizando soluciones buffer de pH 7 con 8mM y 12mM de H2O2. Evaluacin Cronoamperomtrica Biosensor IrOx/GOx del

Se disuelve el IrCl4 4 mM en una solucin de cido oxlico 40 mM, la cual precipitar al IrOx, adicionando lentamente K2CO3 340 mM hasta un pH final de 10.3 [10]. Se agita magnticamente toda la solucin hasta que no quede sobrenadante y se deja reposar por 8 das a temperatura ambiente protegido de la luz hasta la aparicin de la coloracin azul, almacenando luego a 4C hasta que llegue a la estabilidad al cabo de 2 a 3 semanas. Electrodeposicin del IrOx En la celda tripolar se coloca la solucin y se sumerge el electrodo de trabajo. Para la electrodeposicin, se lleva a cabo un protocolo potenciodinmico que consiste en la aplicacin de un ciclado potenciodinmico de 50 ciclos de una onda triangular entre 0.0V y 0.55V a una velocidad de 50mV/s versus el electrodo de referencia, seguido inmediatamente de un potencial pulsado de 1500 pulsos entre los mismos lmites con un tiempo de 0.5 ms entre pulsos, manteniendo la celda a 30 C. Al finalizar cada electrodeposicin se deja el electrodo sumergido en la solucin durante 45 min. Finalmente, se almacenan los electrodos al abrigo de la luz. Inmovilizacin de la GOx Se sumerge el electrodo de acero inoxidable, previamente electrodepositado con IrOx, en una solucin recin preparada de buffer fosfato pH 7 que contiene 100 Unidades/ml de GOx en la celda tripolar; y se evalan 3 protocolos de electrodeposicin de la GOx: 1. Potenciosttico A: aplicando un potencial constante de 800mV vs. Ag/AgCl por 5min. 2. Potenciosttico B: aplicando un potencial constante de 300mV vs. Ag/AgCl por 5min. 3. Potenciodinmico: aplicando un potencial pulsado de 1000 pulsos entre 0.0V y 0.55V vs. Ag/AgCl con un tiempo de 0,5ms entre pulsos. Finalmente, los biosensores GOx/IrOx obtenidos fueron enjuagados con agua destilada y almacenados en una solucin buffer de pH 7 y refrigerados a 4C antes de

Para las mediciones cronoamperomtricas se aplic un potencial de 300mV vs. Ag/AgCl, determinado previamente por voltamperometra. Se midi la respuesta del biosensor frente a distintos agregados de glucosa. Resultados Determinacin Voltamperomtrica. La Fig. 2 muestra el voltamperograma realizado para determinar el potencial de electro-oxidacin del H2O2. Se observa que el potencial adecuado es de aproximadamente 300 mV.

Figura 2. Respuesta voltamperomtrica de un electrodo EIROF en una solucin buffer de pH 7 en ausencia y presencia de 8 y 12 mM de H2O2. Velocidad de barrido de 10mV/s.

Evaluacin cronoamperomtrica Biosensor IrOx/GOx

del

La inmovilizacin de la GOx, utilizando los 3 protocolos descriptos anteriormente, ofreci resultados diferentes. Slo el biosensor en el que se utiliz el protocolo potenciodinmico mostr una inmovilizacin efectiva de la enzima, registrada como un cambio en la corriente luego de agregados de Glu 1mM. En el biosensor, en
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el cual se aplic el protocolo potenciosttico 1, se produjo una delaminacin visible de la capa de IrOx, y en el obtenido con el protocolo 2, no se observ respuesta cronoamperomtrica del biosensor. La figura 3 muestra la respuesta dinmica del biosensor IrOx/GOx donde se utiliz la tcnica potenciodinmica para electrodepositar la GOx.

Figura 3. Respuesta Cronoamperomtrica del biosensor IrOx/GOx cuando se realizan adiciones sucesivas de una solucin de Glucosa 1mM, aplicando una DC de 0,3 V, en una solucin buffer de pH 7 conteniendo 0,1M de KCl.

Curva de Calibracin En base a los valores promedios de los segmentos indicados en la figura 3, se grafic la corriente en funcin de la concentracin de glucosa. Los ajustes lineales se muestran en 2 la figura 4 con un valor de R de 0.9668.

El uso de los protocolos potencioestticos A y B produjeron diferentes resultados. El primero, la delaminacin visible de la EIROF, lo cual se explica, porque se sobrepasa el potencial aplicado para obtener la EIROF, que es de 550 mV. El segundo protocolo, a pesar de no producir delaminacin, no produce cambios de corriente durante la medicin cronoamperomtrica. Esto lleva a pensar en dos posibilidades: que la enzima no se electrodeposit, o si lo hizo, no lo hizo de la manera adecuada, posiblemente porque no dejo al descubierto su sitio activo. Por ltimo, la aplicacin del protocolo potenciodinmico es el nico que permiti obtener cambios de corriente en las mediciones amperomtricas en funcin de los agregados sucesivos de Glu 1mM. Este protocolo es similar a la segunda etapa del protocolo empleado para obtener la capa de EIROF, con lo cual se asegura que la pelcula de xido no se desprender al no alterarse las condiciones ptimas de formacin de sta. La respuesta amperomtrica es ruidosa, aunque se observa claramente el aumento de corriente para cada agregado de Glucosa. Se estn programando nuevos ensayos para mejorar el sistema de medida y obtener curvas mas limpias. CONCLUSIONES Se construy un biosensor de IrOx/GOx capaz de sensar Glucosa. Se evaluaron diferentes protocolos para la inmovilizacin de la enzima GOx sobre electrodos EIROF, siendo el protocolo potenciodinmico el ms adecuado. Se determin que la aplicacin de 300mV vs. Ag/AgCl es el potencial al cual el IrOx electrooxida al H2O2, permitiendo de esta manera, sensar la concentracin de glucosa. Se presume adems, que este potencial menor respecto de otras aplicaciones reportadas en la bibliografa, evitar la prdida gradual de la actividad de la enzima. Estos biosensores presentan las ventajas de ser de bajo costo por el sustrato utilizado, y de ser posibles de implementar en microsistemas, por la baja impedancia de interfase electrodo electrolito del xido de iridio. Agradecimientos Este trabajo fue financiado por la Agencia Nacional de Promocin Cientfica y Tecnolgica, el Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET), fondos institucionales del Instituto Superior de Investigaciones Biolgicas

Figura 4. Recta de calibracin Corriente I(A) vs. Concentracin (mM).

Discusin Se determin que el potencial de electrooxidacin del H2O2, es de aproximadamente 300mV. Este valor se encuentra por debajo de lo reportado en bibliografa, lo que resulta de gran utilidad en esta aplicacin, puesto que el uso de potenciales mayores, produce un desprendimiento de la EIROF, y el posible deterioro gradual de la actividad enzimtica.
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(INSIBIO) y el Consejo de Investigaciones de la Universidad Nacional de Tucumn (CIUNT). Referencias

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