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OBJETIVOS: GENERAL Analizar las tcnicas moleculares

ESPECFICOS Comparar las tcnicas clsicas con las tcnicas moleculares. Determinar las tcnicas moleculares ms relevantes con funcionamiento y su rea de aplicacin. Analizar la tcnica del PCR (La reaccin en cadena de la polimerasa) de forma detallada.

MARCO TERICO: Mtodos moleculares Permiten la deteccin de porciones de cidos nucleicos (DNA o RNA) que son especficos de cada microorganismo, en diferentes materiales clnicos. Su aplicacin, surge como una necesidad para poder detectar microorganismos de difcil crecimiento en cultivos o desarrollos tardos y donde las tcnicas serolgicas de deteccin de antgenos y anticuerpos carecen de suficiente sensibilidad y especificidad diagnstica. Las tcnicas moleculares en este tiempo se refieren al ltimo escaln de desarrollo de estas tcnicas, aportando las ventajas , nos permiten adems de la deteccin, cuantificacin de AN, tambin detectar mutaciones, genotipos, translocaciones, determinaciones que aportan a diferentes especialidades dentro de la Medicina.

VENTAJAS En la actualidad las tcnicas moleculares para la identificacin de microorganismos estn teniendo un auge muy importante debido a : Especificidad, pueden detectar solo la molcula o microorganismo de inters Sensibilidad, son capaces de detectar la presencia de un solo microorganismo Rapidez, se puede identificar un microorganismo en menos de 24 horas Pueden ser automatizadas, permiten tener un diagnstico en un menor tiempo y reducir los costos.

El uso de tcnicas moleculares ha permitido identificar nuevos microorganismos, los cuales no haba sido posible su cultivo e identificacin por tcnicas tradicionales Adems permiten estudiar las poblaciones microbianas sin hacer aislamientos, por lo tanto, se evitan los sesgos que pueden surgir con el cultivo de microorganismos . As mismo estas tcnicas permiten la deteccin de microorganismos altamente patgenos, los cuales pueden ser identificados muertos evitando as los riesgos de infeccin del analista.

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Las tcnicas moleculares han demostraron ser muy tiles en situaciones clnicas donde los mtodos convencionales son muy insensitivos, lentos o muy complicados para ser usados a gran escala

DESVENTAJAS Algunas de las desventajas asociadas a las tcnicas moleculares son: No distinguen entre organismos vivos y muertos, aunque algunas veces esto no es precisamente una desventaja en el caso de Staphylococcus aureus la bacteria muere a temperaturas que no degradan la toxina as la deteccin de la bacteria muerta es un indicativo de la presencia de toxinas en la muestra. Se tiene que contar con conocimientos de secuencias de nucletidos especificas del patgeno diagnosticar. Se requiere de personal altamente capacitado para el desarrollo de las pruebas de identificacin Se requiere equipo ms especifico para el diagnostico, lo cual eleva la inversin inicial, Se desarrollan procedimientos con mltiples etapas, lo que incrementa la posibilidad de errores, adems de la posibilidad de obtener falsos positivos y falsos negativos. El alto costo de las tcnicas moleculares tendera a bajar a medida que se incremente el uso de estas tcnicas.

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ANLISIS MOLECULAR DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS Para obtener resltados confiables sobre la biota microbiana de un hbitat es necesario conocer que clase de organismos estn presentes y en qu nmero. La tincin celular ayuda a obtener esos nmeros, as tenemos Tincin fluorescente con DAPI, Tincin de viables, Anticuerpos fluorescentes, Protenas fluorescentes verdes para el etiquetado celular.

Tincin fluorescente con DAPI Las clulas teidas con DAPI presentan fluorescencia azul brillante y son muy fciles de ver y enumerar, esta tcnica se usa en muestras clnicas, del ambiente y de alimentos. Tiene la ventaja de no ser especficas (tien todos los microorganismos de una muestra), pero con el inconveniente de que no diferencian entre clulas vivas y muertas, ni permiten el rastreo de organismos especficos en el ambiente.

Tincin de viables A la muestra se aaden dos colorantes, verde y rojo; el colorante fluorescente verde penetra en todas las clulas, viables o no, mientras que el rojo, penetra slo en aquellas clulas cuya membrana ya n o se encuentra intacta y, por tanto, estn muertas. Las clulas verdes estaban vivas y las rojas muertas. Este mtodo se utiliza con cultivos bacterianos de laboratorio, pero no es adecuado para el examen microscpico de hbitats naturales Anticuerpos fluorescentes Puede explotarse para identificar o rastrear u n organismo en u n hbitat complejo; por ejemplo, suelo o una muestra clnica que contenga una mezcla de muchos organismos. Es utilizado en laboratorios de microbiologa clnica.

Protenas fluorescentes verdes para el etiquetado celular. Se basa en la ingeniera gentica y vuelve fluorescentes a los microorganismos. Se utiliza para estudiar in situ la competencia microbiana, con la ayuda de luz UV se puede encontrar a las cepas con esta protena fluorescente (GFP.)
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Tincin filogentica con FISH Los colorantes filogenticos son oligonucletidos fluorescentes complementarios en la secuencia de base a las secuencias signatura en el rRNA 16S (en procariotas) o 18S (en eucariotas) . Permite identificar o rastrear un organismo particular, caracterizar filogenticamente un hbitat completo Tincin de cromosomas y transcripcin inversa in situ La tincin de cromosomas es til para identificar bacterias que contienen genes especficos, como los que codifican la nitrogenasa, responsable de la fijacin de nitrgeno, los componentes del centro de reaccin fotosinttico u otros. La transcripcin inversa in situ busca si un organismo est expresando un gen o genes determinados en la naturaleza en un momento determinado. La principal ventaja es que permite al investigador explorar los factores que controlan la expresin gnica en poblaciones naturales y observar cmo las alteraciones experimentales en una muestra afectan a la transcripcin de genes especficos.

PCR
Esta tcnica es una amplificacin enzimtica resulta en una acumulacin de la secuencia blanco (target). La PCR consiste de un nmero de ciclos cambios de temperatura que producen:

separacin de las hebras de ADN; unin del oligonucletido (partidor o primer) al segmento ADN; extensin que permite a la ADN polimerasa sintetizar el resto de la hebra complementaria.

Estos ciclos se repiten habitualmente 30 40 veces para obtener un producto que puede ser fcilmente detectado por medio de un gel de agarosa o por hibridacin en microplacas. Con esta tcnica, prcticamente cualquier segmento de ADN de una determinada bacteria, hongo o virus puede ser amplificado y detectado. Sin embargo, los laboratorios deben analizar varios factores, entre los cuales destaca la aplicacin clnica que podra tener la deteccin de un determinado organismo, as como los costos, sensibilidad y especificidad del examen en comparacin con las tcnicas tradicionales. En general, las tcnicas de diagnstico molecular estn indicadas cuando un organismo no puede ser cultivado in vitro, o cuando requiere de un medio complejo y largos perodos de incubacin. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) o la amplificacin enzimtica in vitro de un segmento de ADN especfico del microorganismo blanco. Esta es la tcnica ms utilizada para la deteccin de microorganismos, se basa principalmente en realizar millones de copias de un segmento de ADN especfico de un microorganismo. En esta tcnica la cadena doble de ADN es separada en dos cadenas sencillas sometindola a temperaturas mayores a 92 grados centgrados despus se hibridiza o alineen dos pequeos segmento de ADN complementarios uno a una cadena y el otro a la otra.
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Inmunomagnetica PCR En esta tcnica un anticuerpo primario se encuentra unido a perlas metlicas las cuales se colocan dentro de la muestra a analizar, se deja incubar para la unin antgeno-anticuerpo, posteriormente se extraen estas perlas metlicas con un magneto, se lavan y se colocan en un tubo en el cual se realiza la PCR. Esta tcnica se ha utilizado para la deteccin de Listeria monocytogenes en alimentos. PCR-mltiple. Uno de los problemas de las tcnicas de PCR es que solo permiten la identificacin de un solo patgeno a la vez. Con la finalidad de solucionar este problema se ha diseado la tcnica conocida como PCR-mltiple la cual permite la deteccin de diferentes molculas o microorganismo de inters en una sola reaccin. En esta tcnica se incorporan a la reaccin un par de iniciadores por cada uno de las molculas o microorganismos a detectar, lo cual permite un ahorro en tiempo y costo para la deteccin de diferentes microorganismos simultneamente. Esta tcnica presenta retos como el de disear todos los iniciadores que se deseen agregar a la reaccin con similar temperatura de alineamiento, no deben de presentar homologa entre ellos, adems de amplificar fragmentos de diferentes longitudes. PCR-RFLP Esta tcnica consiste en amplificar por PCR un segmento especfico de un microorganismo y posteriormente digerir el ADN amplificado con enzimas de restriccin, esto permite poder determinar diferencias entre los patrones de bandas amplificadas entre los patrones de los fragmentos resultantes de la digestin del ADN. Existen diferentes variantes de esta tcnica dependiendo del fragmento especfico amplificado y digerido. Entre los segmentos ms comnmente amplificados y posteriormente digeridos se encuentran los genes ribosomales , los espacios entre el conjunto de genes ribosomales

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7.-CONCLUSIONES Se determin que las tcnicas clsicas por si solas no son suficientes para apreciar de forma correcta la ecologa microbiana, se necesita emplear tcnicas o mtodos moleculares como un complemento indispensable. Se determin que las tcnicas moleculares ms importantes incluye la tincin fluorescente con DAPI, Anticuerpos fluorescentes, Tincin filogentica con FISH, PCR Se pudo conocer que el mtodo PCR es la tcnica ms utilizada para determinar microorganismos, basado en el material gentico especfico de cada Microorganismo.

8.-BIBLIOGRAFA Molecular Biotechnology.Principles and Applications of Recombinant DNA. (3 Edicin).B.R. Glick y J.J. Pasternak. ASMPress. 2003.Disponible en: [http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/MMMA.PDF] 2012-06-29 BROCK Education BIOLOGA DE LOS MICROORGANISMOS Madrid PEARSON PRENTICE HALL traducido por Pearson 2003 p.pp. 634-640

http://site.ebrary.com/lib/espochsp/docDetail.action?docID=10090898&p00=METODOS +MOLECULARES
[Consulta: 2 julio 2012]

Diagnstico molecular de agentes infecciosos http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=s0716-10182003000100004&script=sci_arttext


[Consulta: 2 julio 2012]

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