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Tema 8.

Enzimas II

Bioqumica

TEMA 8

ENZIMAS II
1. Cintica enzimtica 2. Inhibicin enzimtica 3. Reacciones multisustrato 4. Regulacin enzimtica

1. Cintica enzimtica. Los principios generales de la cintica de las reacciones qumicas son aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas, en los seres vivos. No obstante, stas muestran (adems del fenmeno de la especificidad, antes comentado) un rasgo caracterstico que no se observa en los catalizadores no enzimticos, se trata de la saturacin por el sustrato, entendida en trminos de ocupacin de los centros activos de todas las molculas de enzima. Estudiar el efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad de una enzima no es sencillo, si pensamos que lgicamente la concentracin del sustrato disminuye segn avanza la reaccin. Una simplificacin en los experimentos cinticos consiste en medir la velocidad inicial (Vo). Si el tiempo es suficientemente corto la disminucin de sustrato ser mnima y sta podr considerarse, por tanto, casi constante. La Figura 1 muestra el efecto de distintas concentraciones de sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccin catalizada por un enzima.

Figura 1. Cintica enzimtica. Modelo de Michaelis-Menten.

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Este comportamiento es caracterstico de la mayora de las enzimas y fue estudiado por Michaelis y Menten en 1913. En la cintica enzimtica de la Figura 1 se distinguen tres fases: Para una concentracin baja de sustrato, la velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la concentracin del sustrato (relacin lineal), la cintica es de primer orden. Para una concentracin alta de sustrato, la velocidad de la reaccin se hace prcticamente constante e independiente de la concentracin de sustrato, la cintica se considera de orden cero. Para concentraciones de sustrato intermedias la velocidad del proceso deja de ser lineal, y a esta zona se la denomina de cintica mixta.

La velocidad de una reaccin catalizada (V) nos indica la cantidad de sustrato consumido, o producto formado, por unidad de tiempo. En el Sistema Internacional se designa por U (unidad de actividad enzimtica) y corresponde a los moles de sustrato consumidos en 1 min, o bien a los moles de producto formado en 1 min.

U mol S/min mol P/min

La curva que expresa la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad inicial tiene la misma forma para la mayora de las enzimas; se trata de una hiprbola rectangular, cuya expresin algebraica viene dada por la ecuacin de Michaelis-Menten, donde muestra la relacin entre la velocidad inicial (Vo) y la concentracin de sustrato, S.

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Los trminos Vmax (velocidad mxima) y Km (constante de Michaelis) son dos parmetros cinticos caractersticos de cada enzima, que pueden determinarse experimentalmente. La velocidad mxima (Vmax) se obtiene cuando la velocidad de reaccin se hace independiente de la concentracin de sustrato, cuando esto ocurre la velocidad alcanza un valor mximo. Este valor depende de la cantidad de enzima que tengamos. La constante de Michaelis (Km) nos indica la concentracin de sustrato a la cul la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. Este parmetro es independiente de la concentracin de enzima, y es caracterstico de cada enzima segn el sustrato utilizado (si tiene varios). La Km tambin indica la afinidad que posee la enzima por el sustrato, siendo sta mayor, cuanto menor es la Km. Cuanto menor sea la Km menor ser la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad mxima, por lo que mayor ser la afinidad del enzima hacia ese sustrato. A partir de la ecuacin de Michaelis-Mente podemos explicar matemticamente las tres fases de la curva de la figura 1.

As: A baja [S], es decir si Km >>> [S], el trmino Km+[S] podemos aproximarlo a la Km, quedando un expresin del tipo: V = k [S] Esta es una cintica de primer orden, que se caracteriza por una variacin lineal de la V respecto al tiempo, como tiene lugar en la primera fase. A altas [S], es decir, Km<<<<[S], despreciaramos Km frente a [S], con lo que V = Vmax (que sera constante); la cintica es de orden cero y se habra alcanzado la saturacin por sustrato, como ocurre en la fase final.

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El tramo intermedio, en el que la [S] Km correspondiente a una cintica de orden mixto y se ajusta a la ecuacin de Michaelis.

En muchos casos es de vital importancia conocer estos parmetros cinticos. En principio, podran obtenerse de forma poco rigurosa a partir de la curva de Michaelis Menten, para lo cual sera preciso primero obtener el valor de la Vmax y despus, teniendo en cuenta que la Km es la concentracin a la cual la velocidad es la mitad de la velocidad mxima, podramos obtener su valor. Pero existen mtodos grficos ms fiables que facilitan el clculo preciso de la Km y la Vmax. Los clculos se hacen en base a transformaciones matemticas de la ecuacin de Michaelis; una de las expresiones ms utilizadas es la representacin de Lineweaver-Burk (Figura 2). En esta forma de clculo se representa 1/V frente a 1/S, esto es la inversa de la velocidad frente a la inversa de la concentracin (de ah que tambin la representacin sea conocida como de dobles inversos), as se obtiene una recta cuya interseccin con el eje X es 1/Km y con el eje Y es 1/Vmax, siendo la pendiente Km/Vmax.

Figura 2. Cintica enzimtica. Representacin de Lineweaver-Burk.

De esta forma, y una vez hecha la representacin, podemos extrapolar el valor de X para Y=0, o el de Y, cuando X=0, y obtener haciendo el inverso de los valores (y teniendo en cuenta el signo) el valor de Km y Vmax.

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La obtencin de la Km y la Vmax de una enzima, es importante no slo porque son parmetros que la identifican, sino tambin por motivos que, en ocasiones, pueden ser de vital importancia. Por ejemplo, algunos tipos de leucemia (enfermedad en la que los glbulos blancos proliferan anormalmente) pueden evitarse por la administracin de una enzima, la Asparraginasa, que cataliza la reaccin de hidrlisis de la asparragina (Asn) a cido asprtico (Asp). Asn + H2O <======> Asp + NH+4 Este descubrimiento condujo a la conclusin de que la Asn presente en la sangre es un principio nutritivo para el crecimiento de los linfocitos malignos; el problema apareci cuando se utilizaron distintas fuentes de asparraginasa, descubrindose que no todas eran eficientes. Al final se encontr la razn. Estas enzimas, de diferentes fuentes (animal, vegetal o microbiana), tenan diferente Km respecto a la Asn. Como la [Asn] en la sangre es muy baja, slo aquellas enzimas con el valor de Km muy bajo (una mayor afinidad por el sustrato) seran capaces de provocar la hidrlisis de la Asn. As, se comprob al obtener los parmetros que la enzima que presentaba menor Km para la Asn era la de una bacteria (E. coli), y fue la que se utiliz para controlar la enfermedad.

2. Inhibicin enzimtica Existen sustancias que pueden impedir que la enzima desarrolle su actividad cataltica, ralentizando o paralizando la reaccin enzimtica. A estas sustancias se las denomina inhibidores enzimticos. Teniendo en cuenta que las reacciones qumicas en la clula estn catalizadas por enzimas, es fcil intuir el papel de muchos inhibidores enzimticos que actan como frmacos, antibiticos o conservantes; otros pueden ser txicos, potentes venenos. Por ejemplo, la aspirina (acetilsalicilato) es un analgsico que inhibe la enzima que cataliza el primer paso en la sntesis de prostaglandinas, implicadas en la produccin del dolor. Se conocen dos tipos principales de inhibicin: la reversible y a la irreversible. La primera implica una unin no covalente del inhibidor y, por lo tanto, siempre puede revertirse. En la inhibicin irreversible, el inhibidor se une al enzima de forma covalente y permanente.

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Inhibicin reversible: los distintos modelos de inhibicin reversible implican la unin no covalente del inhibidor con la enzima, pero difieren en los mecanismos por medio de los cuales reducen la actividad enzimtica y en la forma en que afectan a la cintica de la reaccin. Entre ellos estn la inhibicin competitiva, la acompetitiva y la no competitiva. El inhibidor competitivo, es una sustancia similar en estructura al sustrato, con quien compite por el sitio activo de la enzima.

E+S ES+I

K1 K-1 Ki

ES EIS

K2

E+P
Figura 3. Inhibicin competitiva. Clculo de parmetros cinticos mediante la representacin de dobles inversos.

Como consecuencia, aunque la velocidad mxima no se altera, para alcanzarla sera necesario poner ms cantidad de sustrato en el medio de reaccin, lo que se refleja, en la correspondiente curva de Michaelis, como un aparente aumento de la Km (la enzima en presencia del inhibidor perdera afinidad por el sustrato). La representacin de dobles inversos (Figura 3) permite observar claramente este tipo de inhibicin.

As cuando se realizan distintos estudios a varias concentraciones de inhibidor, obtenemos, mediante la representacin de dobles inversos, distintas rectas que se cortan en el mismo punto (para X=0), indicando que la Vmax no se altera, pero la Km (y por lo tanto la afinidad) aparentemente s, pues existen variso puntos de corte para y=0, por lo tanto aparentemente varias Km, que adems van aumentando con la concentracin del Inhibidor.

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La eficacia de un inhibidor competitivo depende de su concentracin respecto a la del sustrato. Si hay un exceso de inhibidor ste bloquear los centros activos de las molculas de enzima, resultando una inhibicin total. No obstante, el proceso es reversible si se procura exceso de sustrato, que desplazara totalmente al inhibidor. El inhibidor no competitivo puede combinarse tanto con la enzima libre como con el complejo enzima-sustrato, sin afectar al sitio activo de la enzima.
K1 K-1 K2

E+S E+I ES+I

ES EI EIS

E+P

Ki Ki2

Al no unirse el inhibidor al sitio activo, no se afecta la afinidad de la enzima por el sustrato y en este caso la Km no se altera y la Vmax disminuye, como puede observarse en la representacin de dobles inversos (Figura 4), el punto de corte de las rectas ahora esta sobre el eje X, (cuando y=0), mientras que hay distintos punto de corte con el eje Y, como se aprecia la Vmax disminuye con el inhibidor.

Inhibicin no competitiva

1/V
Figura 4. Inhibicin no competitiva. Clculo de parmetros cinticos mediante la representacin de dobles inversos.
1/V max

Con I Sin I

1/Vmax - 1/Km 0

1/[S]

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El inhibidor acompetitivo reacciona con la enzima en un punto distinto al centro activo, pero slo en el caso de que sta est unida al sustrato formando el complejo ES; de esta forma impide que la enzima desarrolle su actividad cataltica.

E+S ES+I

K1 K-1 Ki

ES EIS

K2

E+P

Figura 5. Inhibicin acompetitiva. Clculo de parmetros cinticos mediante la representacin de dobles inversos.

Tanto la Vmax como la Km se alteran en la misma proporcin, esto se manifiesta en la representacin de dobles inversos como rectas paralelas y por lo tanto con la misma pendiente (Figura 5). Se observa cmo se produce, una disminucin de la Vmax y curiosamente, tambin, una disminucin aparente de la Km.

En la inhibicin irreversible, el inhibidor se une covalentemente a la enzima y la inactiva de manera irreversible. Casi todos los inhibidores irreversibles son sustancias txicas naturales o sintticas.

E+S E+I

K1 K-1

ES EI

K2

E+P

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Se trata de sustancias que reaccionan con algn grupo funcional importante para la catlisis, bloquendolo e impidiendo que la enzima desarrolle su actividad. En muchos casos la interaccin se produce a travs del sitio activo, impidiendo de manera irreversible que el sustrato ocupe su lugar; tal es el caso del gas Sarn, que inhibe irreversiblemente la acetilcolinesterasa, enzimas implicadas en la transmisin del impulso nervioso, al competir con su sustarato, la acetilcolina (un neurotransmisor) y la inhalacin del gas causa parlisis rpida de las funciones vitales. En la inhibicin irreversible, cuando el inhibidor afecta al sitio activo se observara una situacin similar a la inhibicin competitiva, una disminucin de la Vmax y un aumento aparente de la Km, si bien el proceso sera completamente irreversible por sustrato, incapaz ste de desplazar al inhibidor del sitio activo. La inhibicin enzimtica por modificacin covalente constituye adems una importante forma de regulacin metablica, como veremos en prximos apartados.

3. Reacciones multisustrato En este captulo hemos estudiado reacciones catalizadas enzimticamente en las que interviene un solo sustrato que se transforma en porducto, se trata un mecanismo relativamente simple que podra ajustarse a reacciones catalizadas por algunas enzimas (isomerasas, hidrolasas, algunas liasas) pero es importante tener en cuenta que la gran mayora de las reacciones son multisustrato y suelen dar varios productos. Cuando una enzima une dos o ms sustratos y libera mltiples productos, el orden de los pasos para a ser una caracterstica importante del mecanismo de reaccin. Hay distintos mecanismos que explican este tipo de reacciones, veamos varios casos en los que se utilicen dos sustratos S1 y S2 y se obtengan dos productos P1 y P2. a) Unin ordenada de los sustratos: en este caso un sustrato debe unirse antes de que el segundo sustrato pueda unirse a la enzima.

S1 E

[ES1]

S2

[ES1S2]

E + P1 + P2

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b) Unin aleatoria de los sustratos: en este caso cualquiera de los dos sustratos puede ser el primero en unirse a la enzima.

S1 E S2

[ES1] [ES2]

S2 [ES1S2] S1 E + P1 + P 2

c) Mecanismo ping-pong: en este caso primero se une un sustrato, se libera el primer producto, y a continuacin se une el segundo sustrato para as liberar el segundo producto.

S1 E

[ES1]

P1 S2 E*

[E*S2]

P2 E

4. Regulacin enzimtica Una caracterstica que diferencia las enzimas de los catalizadores qumicos convencionales es su capacidad para regular su propia actividad. Una enzima puede ser ms o menos activa gracias a la existencia de distintos niveles de regulacin: Nivel de sntesis: implica una regulacin gentica, en este caso se trata de protenas inducibles que se sintetizan cuando las requiere el organismo, este tipo de regulacin se estudiar en el Tema 11. Nivel de actividad: que las molculas de enzima existentes estn ms o menos activas. Puede llevarse a cabo por factores extrnsecos a la enzima. Dicha regulacin puede venir dada por una variacin en la concentracin celular del sustrato o de inhibidor, como se ha indicado en apartados anteriores, o bien, por cambios de temperatura o de pH, en este caso se debe a que las enzimas poseen un pH ptimo y una temperatura ptima de trabajo.

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T ptima
Actividad (U) Actividad (U)

pH ptimo

Temperatura

pH

Ejemplo del efecto del pH o la T sobre la actividad enzimtica

La variacin del pH o la T afectan a la actividad enzimtica, en algunos casos, como los de la figura los efectos pueden ser bastante drsticos, mientras que en otros casos el rango de T o pH optimo puede ser mayor, sin que afecten a la actividad. No obstante, suele ocurrir que una vez superado el ptimo se produzca una desnaturalizacin irreversible de la enzima Tambin ocurre que la regulacin puede ser provocada por factores intrnsecos a la propia enzima; en este caso se habla de enzimas reguladoras, enzimas que por su propia naturaleza tienen mecanismos especiales de regulacin. Estn especializadas en regularse respondiendo de forma muy sensible a seales externas. En la clula las enzimas operan en grupo, en rutas constituidas por varios pasos enzimticos. En cada ruta hay al menos una enzima reguladora que determina la velocidad de toda la ruta. La modulacin de las enzimas reguladoras ocurre mediante diferentes mecanismos: Enzimas alostricas. Funcionan mediante la unin reversible no covalente de compuestos regulatorios llamados moduladores. El modulador puede ser una activador (modulacin positiva) que acelere el proceso, o un inhibidor (modulador negativo). Este modulador puede se el propio sustrato de la reaccin (alosterismo homotrpico) o una otra sustancia (alsoterismos heterotrpico). Normalmente se trata de enzimas multimricas, de tal forma que la entrada del primer sustrato facilita (acelera) la entra del siguiente, y normalmente ocurre que el sito activo y el regulatorio se encuentran en distintas subunidades. En esos casos la cintica que presenta la enzima es distinta a la clsica de Michaelis-Menten, apareciendo una sigmoide como muestra la siguiente figura:

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Enzima alostrica

Enzimas interconvertibles. Se trata de enzimas reguladoras en las que el proceso de control de la actividad se realiza gracias a una modificacin covalente reversible, en el que estn implicadas tambin otras enzimas que se encargan de hacer la modificacin, en base a la concentracin celular de determinados metabolitos. Un ejemplo, claro es el caso de la enzima piruvato deshidrogenasa, que se estudiar en profundidad en el Tema 14, y que su regulacin implica, entre otros factores, la fosforilacin /defosforilacin de la enzima. De tal forma que cuando la enzima es fofosforilada pierde su actividad y cuando se defosforila recupera su actividad.
Enzima - Pi
Inactiva

Piruvato deshidrogenasa quinasa

ATP

Piruvato deshidrogenasa fosfatasa

Pi

Enzima

Activa

Tambin son posibles, la regulacin enzimtica mediante protenas reguladoras que se unen a la enzima, o la regulacin por eliminacin proteoltica de pequeos segmentos peptdicos, aunque en este caso el proceso es irreversible.