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Pregunta 3 El factor de transcripcin HF1 slo se expresa en hgado y se dispone de un cDNA con la secuencia codificante de HF1 completa.

Tenemos una lnea celular de origen renal donde queremos expresar constitutiva y establemente HF1. a) Disea un plsmido con todos los elementos que creas necesarios para este fin, incluidos aquellos para la amplificacin del plsmido en bacterias. b) Generamos, con el plsmido del apartado anterior, una coleccin de clones y disponemos de un segundo plsmido con un promotor que responde a HF1 controlando la expresin del gen reportero luciferasa. Cmo averiguaras que clones expresan HF1? c) Conocemos una secuencia de 12 nucletidos a la que se une HF1 de manera especfica. Cmo podramos averiguar, sin utilizar la estrategia del apartado b, que clones expresan HF1 si disponemos de extractos nucleares de los distintos clones? d) Los experimentos de los apartados b y c han dado resultados negativos, parece que ningn clon expresa HF1. Cmo comprobaras que tu casete de expresin se ha integrado en el genoma de estas lneas celulares (en diferentes lugares para distintos clones) y que est aparentemente intacto? (para resolver este apartado puedes introducir las dianas de restriccin que quieras en el plsmido diseado en el apartado a)

Pregunta 4 (dos apartados A y B) A. Estudiamos los virus X y Z, que se integran en el genoma de la clula. Para determinar si la integracin ocurre en un lugar especfico del genoma o no, realizamos el siguiente experimento en cinco lneas celulares (provenientes del mismo organismo) infectadas por uno u otro virus (X1 a X5 y Z1 a Z5): El DNA de cada lnea celular se digiri con BamHI de forma completa y los fragmentos obtenidos se religaron para formar fragmentos circulares (en condiciones que evitan la religacin entre diferentes fragmentos). Sobre esta mezcla de fragmentos circulares se realiz una PCR con los oligonucletidos de la Figura 1 (indicados como flechas), especficos del provirus (virus integrado). El DNA del virus no tiene dianas BamHI. Dedzcase del resultado (Figura 2) si la integracin se da al azar o en un nico lugar del genoma, y razona tu respuesta.

B: BamHI

Figura 1: sitio de integracin del provirus (X o Z) en uno de los genomas analizados.

X X1 X2 X3 X4 X5

Z Z1 Z2 Z3 Z4 Z5

Figura 2: productos de PCR obtenidos en el experimento, visualizados con Bromuro de Etidio en un gel de agarosa.

B. El retrovirus MV11 infecta macrfagos humanos integrndose en el genoma. El provirus se expresa a niveles extremadamente bajos durante mucho tiempo antes de inducirse fuertemente. A la larga, la induccin provoca una grave enfermedad que, no obstante, puede detenerse con el frmaco R2 si se administra poco despus de la induccin. La administracin del frmaco antes de la induccin provoca graves efectos secundarios. Por ello, es muy importante detectar la integracin y los niveles de expresin del provirus. Esto se podra realizar por Southern y Northern, pero es imposible debido a la dificultad de aislar clulas suficientes a partir de la sangre de los individuos. Disea un mtodo basado en la PCR para detectar los individuos portadores del virus MV11, y otro mtodo (tambin basado en la PCR) para detectar los individuos a los que sera aconsejable administrar el frmaco.