Está en la página 1de 11

LUMINOL / H2O2 DETECTORES DE QUIMIOLUMINISCENCIA EN EL ANLISIS DEL XIDO NTRICO EN AIRE EXHALADO

Jill K. Robinson, Mark J. Bollinger, y John W. Birks Anal. Chem., 1999, 71 (22), 5131-5136 DOI:. 10.1021/ac990646d Descargado de http://pubs.acs.org el 22 de enero 2009 Ms sobre este artculo Los recursos adicionales y las caractersticas asociadas a este artculo estn disponibles en la versin HTML: Informacin de apoyo Los enlaces a los 7 artculos que citan este artculo, a partir del momento de la descarga del artculo El acceso a las figuras de alta resolucin Los enlaces a artculos y contenidos relacionados con este artculo Derechos de autor autorizacin para reproducir figuras y / o texto de este artculo

RESULTADOS Y DISCUSIN Deteccin NO. Los actuales requisitos clnicos para la medicin de NO en la respiracin son la deteccin en el rango de concentracin 1-200 ppbv con una precisin de 1 ppbv o superior y un tiempo de respuesta de ~ 3 s. El detector luminol/H2O2 en combinacin con un conversor CrO3 fue capaz de cumplir con estos requisitos. El instrumento luminol/H2O2 fue explorado originalmente para la directa deteccin de NO. La deteccin directa de NO en los tejidos biolgicos se ha reportado por una reaccin con una solucin luminol / H2O2 NO reacciona con H2O2 para formar el potente oxidante peroxinitrito (ONOO-). El peroxinitrito es capaz de oxidar luminol a un estado electrnico excitado de 3-aminophthalate, que se relaja mediante la emisin de luz. La seal de NO como resultado de la formacin de peroxinitrito es detectado en la parte superior de la seal de fondo que resulta de oxidacin del luminol por el perxido de hidrgeno, NO + H2O2 + 2OH- ONOO- + 2H2O (1) ONOO- + luminol 3-aminophthalate + N2 + products + h (2) No obstante, en nuestro instrumento, el NO no produjo una seal quimioluminicente cuando se ponen en contacto con la solucin de luminol / H2O2, siempre que cualquier impureza de NO2 se separaron primero desde la fuente de NO mediante el uso de una trampa. Varias condiciones de reaccin fueron variadas en un intento de aumentar la sensibilidad a NO, incluyendo el pH y las concentraciones de cada uno de los reactivos.

La reaccin de NO burbujea a travs de solucin luminol / H2O2 tambin se monitorio pero no ha producido una seal por encima del fondo.NO2 Se sabe que oxidan el luminol en ausencia de H2O2 y por lo tanto Se espera que produzca una seal en el instrumento.21,22 Sin embargo, la seal NO se prev que sea mucho mayor que el NO2en el base del trabajo de otros investigadores.16 No estamos seguros de por qu no hemos podido detectar ninguna directamente por luminol / H2O2 quimioluminicencia; podra ser que peroxinitrito no se forma sobre el escala de tiempo de unos pocos segundos. Sin embargo, hemos descubierto que la presencia de 5 mM H2O2 en la solucin de luminol ha mejorado la respuesta el NO2 por un factor de ~ 20. Esto es debido posiblemente a la formacin de un oxidante ms fuerte, posiblemente peroxinitrato (OONO2-), en una reaccin de NO2 con H2O2. Porque la reaccin directa de NO con solucin luminol / H2O2 no proporcion una seal detectable, un enfoque alternativo para la deteccin de NO basado en la oxidacin del NO a NO2 se persigue antes de la reaccin con una solucin luminol / H2O2 La oxidacin del NO a NO2con CrO3 Trixido de cromo revestido sobre un soporte inerte ha sido utilizado para oxidar NO a NO2 en los detectores de luminol utilizado para las mediciones atmosfricas. Nuestro detector difiere del mtodo de los detectores en poner el gas y el lquido en contacto y por la adicin de solucin de H 2O2 como un reactivo. La eficacia de oxidacin de CrO3 se report al variar la humedad relativa de la muestra. La Figura 3 muestra el eficiencia de la oxidacin del NO a NO2como una funcin de relativa la humedad con CrO3 Recubiertos con perlas de vidrio. La mxima eficiencia de conversin (99%) se produce a una humedad relativa de ~ 13%. La dependencia de la eficiencia de conversin en presencia de humedad relativa es un problema para el anlisis del aliento, ya que el aire exhalado se satura con vapor de agua mientras que los parmetros NO usadospara la calibracin son preparados con aire seco. Para que la calibracin sea exacta, las normas y la respiracin deben ser relativas a la misma humedad.

Figura 3. NO-a-NO2 oxidacin eficiencia como una funcin del porcentaje humedad relativa en el CrO3 convertidor. La lnea es una curva suave a travs de los datos Figura 4. Las seales de los 20, 40 y 60 ppbv No existen normas en la luminol / H2O2 perxido de instrumento a 20% de humedad relativa Nafion el intercambiador de humedad (ME), la tubera a la corriente de aire antes del convertidor CrO3. El tubo ME equilibra la humedad de la corriente de aire interior con la humedad del aire del ambiente que rodea el tubo. Por lo tanto, el soplo se sec y los patrones esta humidificado a la humedad ambiental del (laboratorio 10-22%). Este rango de humedad resulta eficiente para la deteccin adecuada de la oxidacin de NO. Sin embargo, si la humedad del ambiente es mayor a 30%, puede ser requerido control de humedad adicional. Esto puede lograrse encerrando el ME tubo en una cmara de humedad controlada. El efecto del NO sobre la eficiencia de conversin del CrO3 se midi por pasar continuamente 0,5 ppmv NO diluido en el aire equilibrado a la humedad ambiente (~ 20% de HR) a travs del convertidor. La eficiencia de conversin se encontr a caer a 60 y 5% de su valor original despus del paso de 8 x 10-5 y el 1,2 10-4 moles de NO, respectivamente. Por lo tanto, suponiendo que el 50 ppbv NO pasa a travs del convertidor durante 10 minutos a una velocidad de flujo de 200 ml /min por cada anlisis del aliento, el convertidor puede ser utilizado para ~ 20 000

anlisis antes de la eficiencia de conversin disminuya a 60% de su valor original. Despus de la exposicin posterior de la CrO3 catalizador al aire ambiente durante una semana, la eficiencia de conversin vuelve a 100% de su valor original. Sobre la base de estos resultados, CrO3 parece comportarse como un verdadero catalizador y podra ser utilizado casi indefinidamente si se exponen al aire limpio entre las muestras. Calibracin y lmite de deteccin. Las respuestas de la detector para los estndares de xido ntrico en el rango de 20-60 ppbv son se muestra en la Figura 4. Una curva de trabajo se genera haciendo tres mediciones repetidas del patrn de NO en varias concentraciones en el rango esperado en el aire expirado (1-100ppbv), como se muestra en la Figura 5. La respuesta estaba en condiciones de un orden secundario, es polinomio con un coeficiente de correlacin de r2=1,0000. La precisin del mtodo fue del 5% durante 10 NO ppbv. El lmite de deteccin fue 0,3 ppbv para una relacin seal-ruido de 3. El 1 / e tiempo de respuesta del instrumento se midi a ser 2 s.

Figura 5. Curva de calibracin para los estndares de xido ntrico en el intervalo

Del anlisis del aliento (1-100 ppbv).La curva estaba en condiciones de polinomio Representada por la ecuacin, la seal (mV)=0,1229 [NO]2+6.039-[NO]0,0097, con R2=1,0000. Las barras de error representan la desviacin estndar en tres mediciones. TABLA 1. Resumen de las concentraciones de diversos Los compuestos en el aire expirado y su Molar Relacionado con la selectividad Compuesto selectividad(NO/compuesto) proporcin de mezcla

Instrumento de respuesta a las posibles interferencias. Una amplia variedad de compuestos se han medido en el aliento exhalado, incluyendo el dixido de carbono, monxido de carbono, amonaco, y hasta 100 compuestos orgnicos. Muchos de estos compuestos Se estudiaron como posibles interferencias en la deteccin de NO. Los compuestos ensayados fueron CO2, CO, NH3 , Etanol, acetona, isopreno, acetonitrilo, pentano, tolueno, y acetaldehdo. La compuestos orgnicos voltiles ensayadas son representativas de los diversos grupos funcionales orgnicos y son las especies ms abundantes trazas en el aliento. Las concentraciones de los gases ensayadas fueron iguales o por encima el nivel ms alto en el aire expirado. La Tabla 1 , resume las concentraciones de estos compuestos que se encuentran en el aire expirado y las relaciones de selectividad del detector para estos compuestos. El nico compuesto encontrado para producir una interferencia significativa el dixido de

carbono. Aunque la respuesta a NO es mucho mayor que el CO2, La concentracin de CO2 es mucho mayor (4-6%). Dixido de carbono interferencia. Aunque el luminol / H2O2 mtodo tiene la sensibilidad para medir el xido ntrico en los niveles en aire exhalado, la presencia de niveles por ciento de dixido de carbono crea una interferencia de gran tamao. El dixido de carbono puede interferir con la seal de NO en dos maneras .La primera es que el dixido de carbono

Figura 6. Seal de aliento exhalado Instrumento. niveles de CO2(4-6%) en el luminol / H2O2 hidroliza en el agua para formar cido carbnico, lo que disminuye el pH de la solucin. La reduccin del pH de la solucin disminuye tanto el fondo y la seal de xido ntrico porque el luminol la oxidacin es ms eficaz a pH alto. Esta interferencia puede ser eliminado por la solucin tampn. La interferencia de segundo produce una seal positiva, como se muestra en la Figura 6. Esto resulta de la reaccin del dixido de carbono con perxido de hidrgeno para formar peroxicarbonatos, que se descomponen a radicales altamente reactivos aniones capaces de oxidar luminol.

La figura 6 muestra la seal de 4, 5, y 6% de CO2en el luminol /H2O2 instrumento. Un 5% de CO2la seal es equivalente a 100 ~ NO ppbv.La seal de NO puede ser detectada en la parte superior del CO2seal, sin embargo, ya que el CO2la seal es grande y vara en el transcurso de una respiracin, sustraccin del CO2respuesta para obtener el componente de NO la seal no sera muy exacto. Por lo tanto, la interferencia debe ser eliminada con el fin de medir con precisin el NO en el aliento respirado. Una trampa que consiste en ascarite fue colocado en la corriente de aire para eliminar el CO2 por la reaccin: CO2 + 2NaOH Na2CO3 + H2O (7)

La trampa se ensay para la eliminacin de ambos CO2y NO desde la corriente de aire. La seal de aliento concentraciones de CO2 fue eliminado por el ascarite, mientras que ninguna cantidad detectable (< 0,5 ppbv) de NO se elimin. Por lo tanto, una trampa ascarite se puede utilizar para eliminar el CO 2 de la muestra de aliento, si bien no afecta el NO concentracin. Una trampa que contiene 1 g de ascarite se encontr que tena capacidad suficiente para analizar 10-15 muestras de aliento, sin interferencias significativas de CO2 . En un instrumento comercial, la trampa ascarite podran ser incorporados en la boquilla y cambiarse para cada paciente

Figura 7. Anlisis de aliento exhalado de (a) un individuo sano y (b) un asmtico no tratado. Tenga en cuenta las diferencias en las escalas de los ejes

Figura 8. Los resultados de la intercomparacin del luminol / H2O2instrumentos con un NO+O3 quimioluminiscencia instrumento.El NO concentracin era la media de los valores de la meseta del larga exhalacin. La pendiente de la lnea es 0,9613, y R2= 0,9987

Resultados del intercomparacin

anlisis

de la

respiracin y

la

de los niveles de NO en el aire exhalado de varias personas se realiz utilizando la tcnica de muestreo respiracin desarrollado por Sensor Medics. El aliento exhalado se analiz de forma simultnea con el luminol / H2O2 instrumento y el NO+O3 instrumento (Ionics-Sievers).El nivel de NO en la respiracin se determin por promedio de los valores en la meseta de la exhalacin larga. Figura 7 muestra los niveles de xido ntrico medidos con el luminol / H2O2 instrumento para una persona sana y un asmtico no tratada. El nivel de NO exhalado fue de 15,2(0,4 ppbv en el sujeto sano y el 79,2= 2,9 ppbv en el sujeto asmtico. La figura es un grfico de la concentracin de NO medido con el NO+O3analizador frente a la concentracin de NO medido con el luminol / H2O2 instrumento. Los datos se obtuvieron a partir del promedio de concentracin de NO en 39 muestras de aire espirado .La pendiente de la lnea de regresin lineal es 0,9613 y la R2 valor es 0,9987, o que indica una excelente concordancia de los dos instrumentos

Tabla 2. Los resultados del anlisis de NO en aire espirado Aliento Con el Luminol / H2O2 Instrumento y NO +O2 Instrumento

Nivel de NO reportado es el promedio de tres mediciones y la desviacin estndar La Tabla 2 muestra los resultados del anlisis de NO en el exhalado aliento de 13 sujetos. Tres muestras de aire espirado se analizaron para cada individuo con los dos analizadores de NO. El nivel reportado es el promedio de tres mediciones exhalado aliento y el desviacin estndar. La variacin en la concentracin de NO entre tres exhala diferente del mismo individuo se encontr que era menos de 10%, lo que indica el nivel de la repetibilidad de la respiracin tcnica de anlisis. Las razones no hay mezcla de individuos sano Se encontr que en los 6,0 rango-22.0 ppbv NO, mientras que los de las personas con asma o una infeccin respiratoria estuvieron en el rango 40,080.0 ppbv. CONCLUSIN Un nuevo instrumento para la medicin de xido ntrico en el aire basado en la conversin de NO a NO2 seguido por la deteccin con quimioluminiscencia se ha desarrollado. La medicin de Las concentraciones de xido ntrico en aire exhalado con la adecuada sensibilidad, precisin y tiempo de respuesta para las mediciones clnicas se ha demostrado. El instrumento tiene ventajas de pequeo tamao, bajo consumo de energa, y la simplicidad en la actualidad utiliza detectores de xido ntrico. Puesto que el detector es porttil, de bajo costo, y bien adaptado para su uso en un entorno clnico, existe un potencial para ampliando enormemente la investigacin sobre los niveles de xido ntrico en el Sistema respiratorio. Se prev que las mediciones de xido ntrico se puede utilizar como una herramienta de diagnstico y ayuda en el desarrollo de mejores tratamientos para el asma y otras enfermedades respiratorias RECONOCIMIENTO Los autores agradecen Sensor Medics y tecnologas para el 2Bpatrocina este trabajo.JK Rowling da las gracias al Instituto de Cooperacin para Investigacin en Ciencias Ambientales (CIRES) para un graduado