MD. JUAN CARLOS ROBAYO, LIC.

EN BIOLOGIA
GUIA N 1: MICROSCOPIA PRINCIPIOS OPTICOS, MANEJO Y CUIDADOS DEL MICROSCOPIO

OBJETIVOS: Sealar los componentes mecnicos y pticos que constituyen el microscopio. Realizar montajes hmedos. Comprobar las propiedades que posee el microscopio.

Marco Terico

La invencin de los aparatos de ptica, el telescopio y el microscopio compuesto, a finales del siglo XVI y principios del siglo XVII, han contribuido a modificar la concepcin que el hombre tenia del mundo. Con el primero se comenz a sondear las profundidades del cosmos, y con el segundo el mundo de lo infinitamente pequeo. En 1558 el suizo CONRAD GESNER public un trabajo sobre la estructura de los foraminferos; su descripcin, ampliamente detallada, sugiere el empleo de un instrumento amplificador compuesto por lentes finas. FRANCIS Y ZACHARIAS JANSSENS, holandeses, manufacturaron el primer microscopio compuesto en 1590. Este microscopio posea un aumento de 10X y 30X y fue empleado para observar estructuras de insectos. GALILEO GALILEI (1564 1642) ESCRIBIO TRABAJOS DE GRAN IMPORTANCIA EN Biologa. Construy su propio microscopio alrededor de 1610 y los utiliz principalmente para estudiar los arreglos de la facetas de los ojos compuestos de los insectos. ANTONY VAN LEEUWENHOEK (Holands, 1632 1723) fue uno de los ms distinguidos microscopistas: se hizo experto en pulir lentes y construir microscopios, algunos con aumentos cercanos a los 300X. Fue el primero en describir organismos como bacterias (bacilos, cocos, espirilos), protozoarios, rotferos e hidras; describi por primera vez espermatozoides de humanos, perros, conejos, ranas, peces e insectos. Observ adems la circulacin de la sangre en la oreja del conejo y en las patas de las ranas. Las observaciones de VAN LEEUWENHOEK fueron confirmadas por el ingls ROBERT HOOKE (1635 1703) quien populariz el microscopio entre los bilogos contemporneos en Inglaterra. Adems construy varios microscopios compuestos. Al observar un corte fino de corcho, seal que estaba conformado por una estructura parecida a un panal de abejas y que estaba compuesto por unidades pequeas que denomino clula. As HOOKE fue el primero en introducir el vocablo CELULA en Biologa; lo que el observ, claro est, no fueron clulas sino los espacios dejados por la porcin viva de la clula (lumen). Existen diversos microscopios y tipos de iluminacin; entre los principales se encuentran: el microscopio de luz transmitida o combinado con iluminacin por transmisin y reflexin, con campo oscuro, contraste de fase; el microscopio invertido, el microscopio con luz polarizada, el microscopio con luz ultravioleta. Los anteriores trabajan con luz fotnica, mientras que el microscopio electrnico tiene como fuente de luz haces de electrones y en vez de lentes utiliza campos electromagnticos.

MD. JUAN CARLOS ROBAYO, LIC. EN BIOLOGIA

Principios pticos Toda lente o sistemas de lentes que, interpuesto entre un objeto prximo y el ojo, permite observar aqul de un tamao mayor y con detalle no visible a simple vista, se le considera un microscopio. El microscopio simple est formado por una sola lente biconvexa o planoconvexa, o por la unin de varias que actan como nica. El microscopio compuesto, por el contrario, consta de dos sistemas de lentes convergentes y la imagen del objeto observado a travs de l es VIRTUAL, INVERTIDA y MUY AMPLIFICADA.

Figura 1. Esquema de la marcha de los rayos luminosos en el microscopio compuesto ab= objeto ab= imagen intermedia ab= imagen aumentada, virtual e invertida. Se podra pensar que al emplear lentes adicionales se lograra mayores aumentos, pero en la formacin de la imagen no solo es importante la ampliacin se requiere que la imagen sea ntida, para lo cual es necesario combinar los diferentes poderes de microscopio que son: a. b. c. d. Poder de aumento. Poder de resolucin. Poder de definicin. Poder de penetracin de foco a campo.

PODER DE AUMENTO: permite magnificar la imagen. En general el aumento (A) est dado por la relacin:

En el microscopio compuesto la ampliacin es igual al producto del aumento del objetivo por el aumento ocular:

EL PODER DE RESOLUCION: se refiere a la capacidad de un sistema ptico de presentar dos puntos prximos distintos o separados. Se especifica por la distancia mnima en que se logra resolver esos dos puntos. (En el hombre el poder de resolucin es de 0.1 mm a la distancia mnima de visin clara de 25 cm.) El poder de resolucin depende a su vez de la longitud de onda () y de la apertura numrica del objetivo (N.A). Esta ltima relaciona el ngulo de apertura de los rayos de luz, que provienen de la muestra, con ndice de refraccin; (en caso del objetivo de inmersin se coloca, entre el preparado y la lente, aceite de inmersin, que tiene un ndice de refraccin igual al de la lente y evita la refraccin de los rayos luminosos). El poder de resolucin est dado por la expresin: 2 Por lo tanto, si se tiene un objetivo de 100X con una apertura numrica (NA) de 1.30 y una longitud de onda promedio de 520 nm (nanmetro= 10-9) el poder de resolucin ser:

MD. JUAN CARLOS ROBAYO, LIC. EN BIOLOGIA

EL PODER DE DEFINICIO: permite formar imgenes claras con contornos definidos. Con el PODER DE PROFUNDIDAD: de foco es posible observar varios palnos con un mismo enfoque.

Materiales para la prctica 1. 2. 3. 4. 5. Biolgicos: muestra de agua de cilantro, sangre Equipos: microscopio Reactivos: aceite de inmersin, xilol. Vidriera: laminas, laminillas, pipetas. Otros: bayetilla, block de papel blanco, papel de arroz, papel absorbente, lpices negros, tijeras, papel milimetrado

Procedimiento 1. Identificacin de las partes del microscopio y a su vez antalas en la figura 2.

El microscopio compuesto consta de un sistema combinado de lentes: OBJETIVO y OCLULAR. El primero localizado hacia la parte media del aparato, produce una imagen ampliada del objeto y esta imagen intermedia es captada y sufre una nueva ampliacin por el ocular, que se encuentra en el extremo superior del TUBO OPTICO. Los objetivos corrientemente utilizados son: menor aumento (10X), mayor aumento (40X) y de inmersin (100X). Para cambiarlos se gira el REVOLVER PORTAOBJETIVOS. El ocular generalmente utilizado de 10X. El TUBO OPTICO puede ser recto o inclinado, tiene un soporte o BRAZO, que se une a la PLATINA y a la BASE del microscopio. La platina es una superficie plana que lleva un orificio central sobre la cual se coloca la lmina que se sujeta con las pinzas o con el carro mvil. Debajo de la platina se encuentra: el CONDENSADOR y el DIAFRAGMA, que ayudan a regular la intensidad y cantidad de luz respectivamente. Ocasionalmente bajo el diafragma aparece el anillo portafiltro. El sistema de iluminacin puede estar incorporado al microscopio o ser externo en cuyo caso la luz difusa se dirige a la preparacin con un ESPEJO CIRCULAR. Los rayos luminosos atraviesan as el condensador y la preparacin para finalmente pasar por el objetivo y el ocular, que estn dispuestos en el mismo eje ptico. Al lado del tubo o en la base del microscopio se encuentran dos tornillos concntricos, el MACROMETRICO de ajuste grueso y el MICROMETRICO, ms pequeo de movimiento rpido y ajuste fino, que accionan una cremallera y ajustan la distancia de trabajo, segn el objetivo que se emplee, mediante el desplazamiento del tubo ptico, o de la platina en algunos modelos. La distancia de trabajo o DISTANCIA FRONTAL de un objetivo, es el espacio que existe entre la superficie de la lente del objetivo y la laminilla, una vez se encuentra enfocada la preparacin. A mayor aumento del objetivo la distancia de trabajo disminuye. Los objetivos en ningn momento deben tocar la preparacin ya que se puede romper la lmina, daar el objetivo o estropear el microscopio.

MD. JUAN CARLOS ROBAYO, LIC. EN BIOLOGIA

Figura 2.Esquema del microscopio compuesto. 2. Realice un montaje hmedo de una letra pequea y asimtrica de un peridico en la siguiente forma: 2.1 Sobre una lmina porta-objeto limpia, coloque una gota de agua. 2.2 Dentro de una gota de agua ponga una letra impresa. 2.3 Acerque una laminilla, en posicin oblicua, y apoyando una arista sobre la lmina al lado de la gota, djela caer suavemente sobre la gota.

La preparacin debe quedar completamente cubierta y embebida en el lquido. Evite exceso de agua (o colorante en preparaciones coloreadas), en los bordes de la laminilla sobre esta, retire el exceso con papel absorbente. Antes de colocar la lmina sobre la platina fjese que est completamente seca en la parte inferior. Si usted ve que la preparacin se est deshidratando puede agregar agua en forma de gota con una pipeta al lado de la laminilla. 3. A continuacin obsrvela al microscopio.

Para el uso correcto del mismo es importante y necesario seguir los pasos que se describe a continuacin: 3.1 Iluminacin: prenda el microscopio o la lmpara (segn el caso): con el objetivo de menor aumento (4X) 3.2 Enfoque: los microscopios con lentes parafocales poseen un sistema sincronizado de enfoque a diferentes aumentos. As, una vez enfocada la preparacin a menor aumento, queda enfocada al utilizar el objetivo de mayor aumento (para ajuste mayor, se debe mover ligeramente el tornillo micromtrico).

MD. JUAN CARLOS ROBAYO, LIC. EN BIOLOGIA

Dibuje sus observaciones anotando el aumento. Inicie sus observaciones con el objetivo de menor aumento, el cual le brindara una imagen panormica amplia y con mayor profundidad de foco. Luego pase a mayor aumento y precise las estructuras. Sintese en posicin correcta y cmoda para observar y dibujar. Los dibujos deben de ser claro y guardar proporciones. Acostmbrese a observar CON AMBOS OJOS ABIERTOS, esto le evitar la fatiga ocular. Realice un montaje hmedo de hilo o tela delgada de color (lino o dacrn) ver 2. Observacin al microscopio. Ver 3. Consignes sus observaciones.

4. 5.

Ocular:

____X

Objetivo: ____ X Total: ____ X

_________________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________ _

Ocular:

____X

Objetivo: ____X Total: ____X

_________________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________ _

6.

Tome, con una pipeta, una gota de agua de florero o agua con cilantro, colquela sobre una lmina, cbrala con la laminilla y obsrvela al microscopio. Ver 3. Consigne sus observaciones.

Ocular:

____X

Objetivo: ____ X Total: ____ X

MD. JUAN CARLOS ROBAYO, LIC. EN BIOLOGIA

Ocular: ____X Objetivo: ____ X Total: ____ X

_________________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________ _

Enfoque con el objetivo de inmersin Con un gotero coloque una gota muy pequea de aceite de inmersin sobre la laminilla con un extendido de sangre perifrica teido con coloracin de Wright (si la preparacin es un extendido fijado al calor, coloque la gota de aceite de inmersin directamente sobre la lmina) y proceda a acercar el objetivo a la preparacin en menos de 1 mm, en este objetivo se requiere mayor intensidad de luz. Con el preparado anterior realice su observacin con aceite de inmersin. Consignes sus observaciones. Ocular: ____X

Objetivo: ____X Total: ____ X

Medidas microscopias: rea de campo visual: determina la relacin entre el campo visual y el poder de resolucin. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Coloque el objetivo en la posicin adecuada (primero 4x, luego 10x y por ltimo 40x). Tome papel milimetrado y corte una tira la cual coloca sobre el portaobjeto seguidamente coloque una gota de agua sobre el papel milimetrado y por ltimo coloque la lamina cubre objeto). Ubique la preparacin sobre la platina. Observe la preparacin con el microscopio. Cuente el nmero de cuadros que se ubica en el dimetro del circulo observado en el microscopio, para determinar el radio (mitad del dimetro) de la circunferencia. Ahora con la informacin hallada en el punto anterior determine el rea del campo visual en milmetros cuadrados y luego convierta esta medida en micrmetros y nanmetros cuadrados teniendo como base la siguiente informacin:

MD. JUAN CARLOS ROBAYO, LIC. EN BIOLOGIA

1 mm 103 micrmetros 106 nanmetros 107 angstrom 103 nanmetros 104 angstrom

1 micrmetro

= 3.1416 R= radio

4x= (3.14169) x (______)=_______ 10x= (3.14169) x (______)=_______ 40x= (3.14169) x (______)=_______ Cuando usted utiliza los objetivos de 10x y 40x, ve que la determinacin del dimetro se hace difcil porque sus ojos no pueden discriminar distancias tan pequeas, lo que hace necesario medir el campo visual de 10x y 40x, utilizando la relacin que existe entre los objetivos de un microscopio. Es decir, usted observa que cuando utilizamos los objetivos de mayor aumento, disminuye el campo de observacin.

La imagen obtenida del microscopio de luz En tu casa imprime la siguiente informacin 1eimtT, en arial y a 8 puntos, posteriormente en el laboratorio monta este letrero en una lmina portaobjetos, luego coloca una gota de agua sobre el papel, y finalmente coloca la laminilla, para observa el preparado al microscopio. Observe el letrero en general y posteriormente observe cada letra, utilice los objetivos de 4x y 10x; dibuje lo observado y describa lo observado.

Ocular:

____X

Objetivo: ____X Total: ____ X

MD. JUAN CARLOS ROBAYO, LIC. EN BIOLOGIA

Ocular:

____X

Objetivo: ____X Total: ____ X

Segn lo observado en la prctica que puede concluir?

PROFUNDIZACION 1. 2. Realiza un diagrama de flujo de la actividad a realizar en el laboratorio Realice una breve descripcin de los siguientes sistemas de observacin microscpica: microscopio ptico, microscopio de campo oscuro, microscopio de contraste de fase, microscopio de interferencia, microscopio de luz polarizada, microscopio de fluorescencia. Describa cada uno de los pasos de las tcnicas histolgicas para desarrollar un micro preparado. Defina los siguientes trmino: foco, magnificacin, nitidez, Explique la funcin del aceite de inmersin cuando se utiliza el objetivo de 100 x Cmo se modifica la imagen al utilizar el microscopio de luz? Realice un grfico en el que se evidencie el cambio que sufre la imagen.

3. 4. 5. 6.