CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO

La cromatografía de exclusión por tamaño, que también se ha denominado cromatografía de penetrabilidad sobre geles o de filtración sobre geles, es una técnica muy valiosa que se aplica particularmente a especies de elevado peso molecular. Los rellenos para la cromatografía de exclusión por tamaño están constituidos por pequeñas partículas (10um) poliméricas o de sílice que contienen una red de poros uniforme en los que puede difundir las moléculas del soluto y del disolvente. Las moléculas del soluto y del disolvente. Las moléculas son atrapadas eficazmente en los poros y eliminadas del flujo de la fase móvil. El tiempo de residencia medio en los poros depende del tamaño efectivo de las moléculas de los analitos. Las moléculas que son más grandes que el tamaño medio de poro del relleno son excluidas y de esta forma, esencialmente no se retienen y, por tanto, son las primeras que son significativamente menores que los poros, pueden penetrar a través del laberinto de poros y así resultan atrapadas durante más tiempo; éstas son las ultimas en eluir. Entre estos dos extremos, están las moléculas de tamaño intermedio cuya penetración media en los poros depende de su diámetro. Dentro de este grupo, tienen lugar el fraccionamiento, que está directamente relacionado con el tamaño molecular y en cierto modo con la forma molecular. Obsérvese que las separaciones por exclusión por tamaño difieren de los otros procedimientos que se han considerado, en que no implican una interacción química o física entre los analitos y la fase estacionaria. De hecho, se procura evitar este tipo de interacciones dado que originan una mala eficacia de la columna. Obsérvese también que a diferencia de otros tipos cromatografía, hay un límite superior para el tiempo de retención, ya que ningún analito es retenido más que aquel para el cual la penetración en la fase estacionaria es total. RELLENOS DE COLUMNA. En cromatografía de exclusión por tamaño se encuentran dos tipos de relleno: partículas poliméricas y partículas de sílice en ambos casos los diámetros oscilan de 5 a 10 um. Los de sílice tienen la ventaja de gran rigidez, lo que facilita el relleno y permite el empleo de presiones más elevadas; una mayor estabilidad, lo que permite el uso de una gran variedad de disolventes incluyendo el agua; una equilibración más rápida al cambiar el disolvente; y una buena estabililidad a elevadas temperaturas. Los inconvenientes de las partículas de sílice son su tendencia a retener solutos por adsorción de las moléculas del soluto. En un principio, la cromatografía de exclusión por tamaño se llevó a cabo fundamentalmente utilizando como copolímeros estireno-divinilbenceno entrecruzados de estructura semejante (excepto en que los grupos de ácido sulfónico están ausentes). El tamaño de poro es estos polímeros se controla por el grado de entrecruzamiento entre las cadenas poliméricas y por tanto con la cantidad relativa de divenilbenceno presente en la producción. Como consecuencia, los rellenos poliméricos se han comercializado con distintos tamaños promedio de poro. Los geles de estireno-divinilbenceno son hidrofóbicos

Suponiendo que no hay mezcla ni difusión. Por ejemplo. que se comercializan actualmente. tienen tamaños promedio de poro que oscilan entre 40 °A y 2. de una columna rellena con gel de sílice o con un polímero poroso viene dado por: Donde Vg.y de este modo sólo pueden utilizarse con fase móvil no acuosas. y VO. o poliacrilamidas.500. que hacen posible el uso de disolventes acuosos para la separación de moléculas grandes solubles en agua como los azúcares. en la actualidad se dispone de geles hidrofilicos. Vo. Las partículas de vidrio y de sílice porosas. Sin embargo. las superficies de estas partículas se modifican por reacción con sustituyentes orgánicos. Estos geles hidrofílicos son por lo general polímeros sulfonados de divinilbenceno. también representa el volumen teórico de disolvente que es . A fin de reducir la adsorción. Vi es el volumen del disolvente retenido en sus poros. la superficie de relleno hidrofílico tiene la estructura siguiente: La Tabla 28-6 indica las propiedades de algunos rellenos comerciales típicos de la exclusión por tamaño. es el volumen libre exterior a las partículas del gel. TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO El volumen total Vt. es el volumen ocupado por la matriz sólida del gel.

K = 1 y Ve = (Vo + Vi). Vi. de hecho tiene lugar algo de difusión y de mezcla. entre las molé. frente al volumen de retención VR. El intervalo útil de pesos moleculares para un determinado relleno de exclusión por tamaño. donde es el producto del tiempo de retención y el caudal volumétrico. todas las moléculas del soluto son tan pequeñas que eluyen dando una sola banda. en promedio. Para las moléculas que son demasiado grandes para entrar en los poros. aparecerán al final de la columna con un volumen de elución que corresponderá a (Vl + Vo). Vo y Vg son del mismo orden de magnitud y. Al deducir la ecuación se comidera que no existe interacción alguna. Si hubiera adsorción. A medida que los pesos moleculares disminuyen con respecto al límite de exclusión. semejantes a las teóricas de la figura 28-27a. Todas las especies que tengan pesos moleculares mayores que el limite de exclusión. Por lo general. K=0 y Ve = Vo: para las moléculas que pueden entrar en los poros libremente. y como consecuencia de ello los componentes que no son retenidos aparecen originando una banda de forma gaussiana con una concentración máxima a Vo. en los poros de las partículas y de este modo se mueven progresivamente con mayor lentitud. y eluyen conjuntamente para dar el pico A en el cromatograma que muestra la Figura 28-27b. dando lugar a picos de soluto individuales tales como los picos B y C del cromatograma. el volumen de elución Ve. Los máximos de banda de los componentes que son suficientemente pequeños para entrar libremente en los potos del gel. La ecuación anterior puede reordenarse como K = (Ve – Vo)/Vi= Cs/CM donde K es el coeficiente de distribución del soluto. que está directamente relacionado con el tamaño de las moléculas de soluto. Sin embargo. . las moléculas del soluto pasan cada vez más y más tiempo.necesario para transportar a través de la columna a los componentes que son demasiado grandes para entrar en los poros del gel. la indicada como D. para esas moléculas retenidas es Ve=Vo + KVi La ecuación se aplica a todos los solutos que pasan por la columna. Obsérvese que la escala ordenadas es logarítmica. En este caso. Las moléculas de tamaño intermedio pueden transferirse a una fracción K del disolvente que ocupa los poros. Los valores de K oscilan entre cero. se una curva de calibrado como la que se muestra en la parte superior de la Figura 28. Las curvas de calibrado experimentales.27a. como la adsorción. la cantidad de soluto retenido intersticialmente aumentaría. El límite de penetración corresponde al peso molecular por debajo del cual las moléculas del soluto pueden pueden penetrar en los poros. una columna de gel permite separar con un volumen mínimo de eluyente los componentes grandes de los pequeños en una muestra. El coeficiente de distribución es un parámetro que puede ser útil para comparar distintos rellenos. Es en la región de penetración selectiva en la que tiene lugar el fraccionamiento. para las moléculas grandes totalmente excluidas y la unidad en el caso de las moléculas pequeñas. con las moléculas pequeñas. por tanto. son tan grandes que no se retienen.culas del soluto y la superficie del gel. se representa el peso molecular. El límite de exclusión define el peso molecular de una especie por encima del cual no existe retención. Por debajo de este peso molecular. K tendrá un valor de mayor que la unidad. Además esto hace posible la aplicación de todas las ecuaciones de la Tabla 26-5 a la cromatografía de exclusión por tamaño.

. n se refiere al numero de unidades monoméricas (Pm = 264) en las moléculas de resina. El segundo es el cromatograma de una resina epoxi comercial de nuevo mediante un relleno de poliestireno. En el primer tipo se utilizan disolventes acuosos y rellenos hidrofilicos En el último. y oligómeros. Una de las aplicaciones más útiles del procedimiento de exclusión por tamaño consiste en sepa- Figura 28-27 (a) curva de calibración en una columna de exclusión por tamaño.se obtienen fácilmente por medio de patrones. En muchas ocasiones. Otra aplicación útil de la cromatografía de penetrabilidad en gel es la separación de homólogos. El primero que muestra la separación de una serie de ácidos grasos con pesos moleculares entre 116 y 344 mediante un relleno de poliestireno con un límite de exclusión por tamaño de 1. en este caso. (b) cromatografía mostrando pico A que contiene todos los compuestos con pesos moleculares mayores que el limite de exclusión. estas curvas las suministran los propios fabricantes de los materiales de relleno. Por ejemplo. ración de las moléculas de alto peso molecular de productos naturales de las especies de bajo peso molecular y de las sales. y en el otro a sustancias solubles en disolventes orgánicos menos polares. Estas aplicaciones se ilustran en los ejemplos que se muestran en la figura 28-28.000. un gel con un limile de exclusión de varios miles. Los métodos son complementarios en el sentido que en un caso se aplican a muestras hidrosolubles. Aplicación de la cromatografía de exclusión por tamaño Los métodos de exclusión por tamaño se dividen en cromatografía de filtración sobre gel y la cromatografía de penetrabilidad sobre gel. puede separar bien Un proteínas de los aminoácidos y de los péptidos de bajo peso molecular. los picos B y C corresponden a los compuestos dentro de la región de permeabilidad selectiva y el pico D contiene todos los compuestos de peso inferior al limite de penetración. se emplean disolventes orgánicos no polares y los rellenos son hidrofobicos.

Otra gran aplicación de la cromatografía de exclusión por tamaño es a la determinación rápida de los pesos moleculares. o de la distribución de pesos moleculares en los grandes polímeros o en los productos naturales. fructosa (F) y sacarosa (S) en zumos enlatados.600 platos a una temperatura de trabajo de 80 “C. Aplicaciones de la cromatografía de exclusión por tamaño. Caudal: 1.5 x 600mm. (b) análisis de una resina epoxi comercial (n = numero de unidades monomericas en un polímero). Caudal: 1. En este cuso. Una columna de 25 cm con este relleno tenía 7. porque los solutos no Figura 28-29 determinación de glucosa (G). 6.000. lúmenes de elución de la muestra con los volúmenes de elución de compuestos estándar que tengan las mismas características. (2) batidas estrechas. químicas. Las ventajas mas importantes de los procedimientos de exclusión por (amaño son. Columna: de poliestireno. (a) separación de ácidos grasos. sacarosa y fructosa en cuatro tipos de zumos de fruta. Detector: índice de refracción. era un polímero de poliestireno entrecruzado de características hidrofilicas por la incorporación de grupos sulfónicos. . (3) no hay pérdida de muestra.La Figura 28-29 ilustra una aplicación de la cromatografía de exclusión por tamaño a la determinación de glucosa. Fase móvil: tetrahidrofurano. se comparan los vo- Figura 28-28.2mL/min. un limite de exclusión de 1 x 103. (I) tiempos de separación cortos y bien definidos (todos los solutos sales de la columna entre Vo y (Vo + Vi) véase la Figura 28-27. El relleno con un límite de exclusión de 1.3 mL/min. Fase móvil: tetrahidrofurano. Detector: absorción UV. de 7.2 x 250mm. que conducen a una buena sensibilidad. Columna: de sílice porosa.

primero eluirán las de mayor tamaño y en último lugar las de menor tamaño.filtración permite separar a las proteínas en función de su tamaño. líquido o fluido supercrítico). Por lo general. Cromatografía significa . para que la resolución sea aceptable se necesita que la diferencia sea de al menos un 10 por 100 en los pesos moleculares. previamente ha de hacerse un calibrado de la columna con proteínas cuya masa molecular se conoce. cuyos tamaños de poro son conocidos.interaccionan con la fase estacionaria. Permite separar los distintos componentes de una mezcla. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR La cromatografía de exclusión molecular o gel. Métodos que dependen del tamaño o la masa. Por lo tanto. Las desventajas son: (1) solo se pueden acomodar un numero limitado de bandas en el cromatograma debido a que la escala de tiempos es corta y (2) no es aplicable a muestras de componentes de tamaño semejante. una mezcla de proteínas se separarán en función del tamaño. Las moléculas proteicas de menor tamaño penetran por los poros. Posee: Fase móvil: consiste en un fluido (gas. y cuyo volumen de elución se determina experimentalmente La cromatografía se basa en un conjunto de técnicas asociadas al principio de retención selectiva. las proteínas de tamaños intermedios eluirán entre ambos extremos en función de su masa. por lo que el recorrido que han de hacer realiza a través de la disolución es mayor que el de las moléculas de gran tamaño. (4) no se desactiva la columna debido a la ausencia de interacción del soluto con el relleno. permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. que no penetran en los poros por impedimento estérico. esto hace que las moléculas de gran tamaño eluyan antes que las pequeño tamaño. Esta técnica se realiza en una columna que está rellena con un gel poroso insoluble en forma de esferas. Fase estacionaria: se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. como las mezclas de isómeros. Para poder saber la masa molecular de una proteína.

. que trabajaba con tintas. QUINTA EDICIÓN FUNDAMENTOS TERCERA EDICIÓN."Escribir en Colores“. MC GRAW HILL.HOLLER.NIMEN. descubre que los cationes orgánicos se podían separar por migración cuando se colocaba una solución que los contenía sobre un material poroso. como papel.Runge. El químico F. Principios de ANÁLISIS INSTRUMENTAL. Proteínas. DE BIOQUÍMICA ESTRUCTURAL. Biografias SKOOG.F.

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