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Directrices para la validacin de mtodos analticos y la calibracin del equipo utilizado para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados

y especmenes biolgicos

Por una calidad y perfeccionamiento continuo

Fotografas: Fototeca de la UNODC

Seccin de laboratorio y asuntos cientficos Oficina de laS naciOneS UnidaS cOntra la drOga y el delitO Viena

directrices para la validacin de mtodos analticos y la calibracin del equipo utilizado para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos
Por una calidad y perfeccionamiento continuo

NACIONES UNIDAS Nueva York, 2010

Reconocimientos
El presente manual ha sido elaborado por la Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos de la Oficina de las Naciones Unidas contra la Droga y el Delito (UNODC), y su preparacin fue coordinada por Iphigenia Naidis y Satu Turpeinen, miembros del personal del Laboratorio (bajo la supervisin de Justice Tettey). La Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos desea expresar su gratitud y reconocimiento a los miembros del Grupo Permanente del Programa Internacional de Garanta de la Calidad de la UNODC, Dr. Robert Anderson, Dr. Robert Bramley, Dr. David Clarke y Dra. Pirjo Lillsunde, por la concepcin terica de este manual, sus valiosas contribuciones y su trabajo de revisin y finalizacin del texto original.*
*Los datos de contacto de las personas nombradas pueden solicitarse a la Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos de la UNODC (Apartado postal 500, 1400 Viena, Austria).

ST/NAR/41

Esta publicacin no ha pasado por los servicios oficiales de edicin.

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1.

Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. Antecedentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Finalidad del manual. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Planteamiento de este manual y terminologa utilizada . . . . . . . . . Uso de este manual. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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2. Validacin y verificacin de mtodos analticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6. 2.7. 2.8. 2.9. Introduccin: funcin de la validacin en la garanta de calidad y las buenas prcticas de laboratorio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Evolucin de los mtodos nuevos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Etapas preliminares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Validacin del mtodo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Verificacin del mtodo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Parmetros para la validacin/verificacin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Supervisin y control del funcionamiento del mtodo . . . . . . . . . . Ejercicios de colaboracin entre laboratorios/pruebas de rendimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Directrices prcticas para la validacin de mtodos . . . . . . . . . . . .

2.9.1. Materiales incautados - Anlisis cualitativo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . a) Pruebas de color. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . b) Anlisis de microcristales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . c) Tcnicas espectroscpicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . d) Cromatografa en capa delgada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . e) CFG/Cromatografa en fase lquida de alto rendimiento (HPLC)/ Electroforesis capilar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . f) CFG Inmunoensayo (semicuantitativo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.9.2. Materiales incautados - Anlisis cuantitativo. . . . . . . . . . . . . . . . . . a) Tcnicas espectroscpicas (UV, IR, NMR, IMS, MS) . . . . . . b) CFG/HPLC/Electroforesis capilar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.9.3. Especmenes biolgicos - Anlisis cualitativo a) Cromatografa en capa delgada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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b) CFG/HPLC/Electroforesis capilar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . c) Inmunoensayos (semicuantitativos) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.9.4. Especmenes biolgicos - Anlisis cuantitativo . . . . . . . . . . . . . . . . a) CFG/HPLC/Electroforesis capilar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3. Calibracin/Verificacin del funcionamiento de instrumentos y equipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1. 3.2. 3.3. Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Requisitos metrolgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procedimientos de calibracin/verificacin del funcionamiento de instrumentos y equipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pipetas automticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aparatos de medicin del punto de fusin . . . . . . . . . . . . . . . . Medidores del pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Hornos y calefactores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Baos de agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Balanzas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Refrigeradores y congeladores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Instrumentos para mtodos inmunolgicos . . . . . . . . . . . . . . . . Espectrofotmetros de radiacin ultravioleta-visible . . . . . . . . . Espectrmetros infrarrojos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cromatgrafos de gases. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cromatgrafos lquidos de alto rendimiento . . . . . . . . . . . . . . . Espectrmetros de masas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Integradores cromatogrficos y sistemas de datos . . . . . . . . . . .

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39 39 40 41 41 41 41 42 42 42 43 43 43 43 44 45 46 47

4.

Modelo de procedimiento normalizado de trabajo para la validacin de un nuevo mtodo analtico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

49 53 55 67

Referencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Anexo. Glosario de trminos utilizados en el manual de validacin y calibracin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Introduccin

1.1 Antecedentes
La Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos de la UNODC presta apoyo a los laboratorios para que implanten y apliquen sistemas de gestin de la calidad, mediante una serie de iniciativas, por ejemplo, el ofrecimiento de estndares de referencia de sustancias sometidas a fiscalizacin, manuales sobre mtodos recomendados de laboratorio, posibilidades de capacitacin y el plan de ejercicios internacionales de colaboracin, as como la promocin y facilitacin del intercambio de informacin, materiales y datos [1]. La validacin de los mtodos analticos y la calibracin del equipo son elementos importantes de la garanta de calidad de los laboratorios. En este manual se abordan ambas cuestiones centrndose en el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos. Puede obtenerse ms informacin sobre la garanta de calidad en otros manuales de la UNODC.

1.2 Finalidad del manual


La finalidad del manual es servir de introduccin a la validacin de mtodos estadsticos y a la verificacin del funcionamiento del equipo del laboratorio. Su diseo responde al deseo de que sirva de orientacin prctica a las autoridades nacionales y analistas para validar mtodos en el marco de sus programas internos de garanta de calidad actuales. Los procedimientos descritos en el manual constituyen una sntesis de la experiencia de cientficos de varios laboratorios respetados de todo el mundo. Adems, como elemento de la garanta de calidad y de las buenas prcticas de laboratorio, muchas organizaciones profesionales han elaborado directrices para la validacin de mtodos, que se han tenido en cuenta al preparar este manual. Aunque los detalles de los protocolos de validacin de mtodos varen segn su contexto, tambin hay un conjunto comn de principios que subyace en todos los sistemas. En general, en este manual se intenta promover medidas nacionales, y armonizarlas, estableciendo unas directrices aceptables internacionalmente. Tambin es importante sealar que se centra especficamente en la cuestin de la garanta de calidad y las buenas prcticas en los laboratorios de anlisis de drogas. Tambin puede servir como material educativo y como instrumento para incitar a los laboratorios a considerar los problemas que plantea la garanta de la calidad.
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Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

1.3 Planteamiento de este manual y terminologa utilizada


Los captulos posteriores estn dedicados a la validacin de mtodos analticos y la calibracin y verificacin del funcionamiento de instrumentos y equipo. La validacin y verificacin de mtodos tiene por objeto asegurarse de que los resultados obtenidos responden a los fines previstos mientras que la calibracin y verificacin del funcionamiento de los instrumentos y equipo pretende garantizar que funcionen correctamente. La validacin de un sistema analtico, denominada tambin frecuentemente prueba de la conveniencia del sistema, se centra en controlar el funcionamiento combinado del mtodo y el equipo en los procedimientos de anlisis ordinarios. El manual se divide en cuatro partes principales y un glosario. En la PARTE I se ofrece un panorama general de la teora y la prctica de la validacin de mtodos y la calibracin de instrumentos y la verificacin de su funcionamiento. En la PARTE II se pretende ofrecer a los analistas una gua prctica. Contiene unas recomendaciones imperativas sobre la forma de validar mtodos cualitativos y cuantitativos para analizar tanto materiales incautados como especmenes biolgicos. Estas recomendaciones inmediatas tienen por objeto ayudar a identificar de forma rpida y sistemtica los requisitos que han de cumplirse para la validacin. En la PARTE III se pretende ofrecer una gua prctica para la calibracin y la verificacin del funcionamiento de instrumentos y equipo, y est subdividida en funcin de los procedimientos utilizables para verificar distintos instrumentos y equipo. En la PARTE IV se ofrecen ejemplos de procedimientos normalizados de trabajo para la validacin de mtodos con el fin de ayudar a los directores de laboratorios a preparar este tipo de documentacin para incluirla en el manual de calidad del laboratorio. En el ANEXO se ofrece un glosario de trminos que tienen estrecha relacin con los temas tratados en este manual.

1.4 Uso de este manual


Los enfoques de la validacin de mtodos propuestos en el presente manual se han seleccionado en funcin de la utilidad y el valor demostrados. Sin embargo, aunque se ofrezcan varios esqueletos de modelos para la validacin de mtodos que pueden ser utilizados parcialmente de forma directa, se recomienda que los directores de los laboratorios supervisen la preparacin de unos procedimientos internos de validacin respetando las orientaciones que se ofrecen. La eleccin final del sistema de validacin de mtodos sigue en manos del director del laboratorio, quien deber asumir adems la responsabilidad de asegurarse de que el personal respeta los procedimientos establecidos.

Parte I. Introduccin

Hay que destacar la importancia que adquiere en todos los asuntos relacionados con la garanta de calidad que el personal est convenientemente capacitado. El cumplimiento de un programa escrito y formalizado de garanta de la calidad, algo que exige cualquier sistema de acreditacin externa, slo puede asegurarse si colabora en ello un personal informado y consciente. Un complemento importante de la elaboracin de un programa interno de garanta de la calidad es participar en un plan de anlisis externo de los resultados, y por eso se recomienda a los laboratorios participar en programas de anlisis de resultados y pruebas circulares como las que se realizan en los ejercicios internacionales de colaboracin (EIC) organizados por la UNODC en el marco del programa internacional de garanta de calidad. Ms adelante, cuando se aborde la validacin de los mtodos analticos (vase el apartado 2.8. de la Parte II), se subraya la importancia de las comparaciones de ensayos entre laboratorios. La Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos agradece las observaciones que pueda recibir sobre el contenido y utilidad del presente manual. Estas observaciones pueden dirigirse a: Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos Oficina de las Naciones Unidas contra la Droga y el Delito Centro Internacional de Viena Apartado de correos 500 A-1400 Viena Austria Fax: +43-1-26060-5967 Correo electrnico: lab@unodc.org Sitio web: http://www.unodc.org/

2.

Validacin y verificacin de mtodos analticos

2.1 Introduccin: funcin de la validacin en la garanta de calidad y las buenas prcticas de laboratorio
Los mtodos utilizados en un laboratorio de anlisis qumicos han de ser evaluados y sometidos a prueba para asegurarse de que producen unos resultados vlidos y coherentes con el objetivo previsto, es decir, han de ser validados. Los laboratorios que adopten los mtodos recomendados por la UNODC* deben o bien revalidarlos o bien verificarlos como proceda para garantizar su funcionamiento adecuado en su entorno habitual. La verificacin supone menos operaciones experimentales que la validacin (vanse los apartados 2.4. y 2.5. de la Parte II infra). Todos los mtodos nuevos que se introduzcan en un laboratorio deben estar adems documentados, y todos los analistas que los vayan a utilizar han de recibir una formacin adecuada y demostrar su competencia en su utilizacin antes de empezar a actuar en casos concretos. Tambin necesitan una revlida, o al menos una verificacin, los mtodos comercializados. Los procedimientos recomendados por los fabricantes han de respetarse lo mximo posible. En caso contrario, si se introducen cambios importantes, se necesitar una validacin completa. Si un mtodo se modifica o se aplica en una situacin nueva (por ejemplo, una muestra de matriz nueva) se necesitar una revalidacin o una verificacin, segn el alcance de la modificacin y el carcter de la nueva situacin. Por ejemplo, se necesitar una revalidacin si un mtodo diseado para actuar con orina se utiliza con sangre; se necesitar una verificacin si se utiliza una columna cromatogrfica de un carcter o una dimensin diferentes. No se necesitar adoptar ninguna medida si la modificacin es slo pequea, por ejemplo, si se sustituye una columna cromatogrfica por otra del mismo tipo. La validacin o la verificacin de un mtodo se realizan mediante una serie de pruebas normalizadas y experimentales de las que se obtienen datos sobre su exactitud, precisin, etc. El proceso que ha de seguirse para ello debe constar por escrito como procedimiento normalizado de trabajo. Una vez validados o verificados los mtodos, su utilizacin habitual
* La Seccin de Laboratorio y Asuntos Cientficos de la UNODC ha publicado una serie de manuales dedicados a los mtodos recomendados para analizar las principales drogas que son objeto de abuso, que se han publicado con la signatura ST/NAR. Puede solicitarse toda la serie o nmeros individuales.

Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

en el laboratorio debe ser autorizada formalmente por la persona responsable, por ejemplo, el director del mismo [2]. En el certificado de mtodo autorizado o documento similar que se establezca en el manual de garanta de calidad se anotarn los detalles del mtodo y los datos en que se bas su evaluacin, entre ellos los siguientes: y y y y y y y Denominacin del mtodo Analito(s) Matriz de la muestra Fundamento cientfico del mtodo Datos del estudio de validacin (exactitud, precisin, selectividad, intervalo, lmite de deteccin, etc.) Nombre y cargo de la persona responsable de la autorizacin Fecha.

Tmese nota de que los procedimientos normalizados de trabajo para validar o verificar un mtodo, lo mismo que cualquier otro procedimiento normalizado que figure en el manual de calidad del laboratorio, deben ser aprobados por el director del laboratorio. Una vez aprobados, es fundamental que se respeten estrictamente todos ellos. Si se introducen variaciones, debe dejarse constancia documental del hecho. Si se introduce un cambio importante ser necesario volver a validar las nuevas condiciones del mtodo. En cualquier caso, debe utilizarse la ltima versin aprobada de los procedimientos normalizados de trabajo. La documentacin que se maneja en un sistema de garanta de la calidad es compleja por naturaleza y por consiguiente los laboratorios han de disponer de un procedimiento adecuado de control de la documentacin, como se recomienda en las Orientaciones para la implantacin de un sistema de gestin de la calidad en los laboratorios de anlisis de drogas [3]. Los sistemas propuestos en la bibliografa dedicada al proceso de validacin pueden diferir de las presentes directrices en algunos aspectos porque la validacin depende necesariamente del uso previsto. Una de las ventajas de estas directrices es que se ocupan en exclusiva del anlisis cualitativo y cuantitativo de sustancias estupefacientes sometidas a fiscalizacin que se encuentren en materiales incautados o especmenes biolgicos.

2.2 Evolucin de los mtodos nuevos


En las normas ISO y en otras publicaciones [4, 5, 6] pueden encontrarse esquemas de cmo evoluciona un mtodo nuevo. El esquema que figura a continuacin es de aplicacin general.

Validacin y verificacin de mtodos analticos

Etapa ETAPAS PRELIMINARES 1. Identificar los requisitos 2. Elegir el mtodo que se postular (depender de: la disponibilidad de equipo e instalaciones, los conocimientos del personal y los requisitos de capacitacin de ste, las disposiciones de los reglamentos) 3. Desarrollar el mtodo

Supone

Establecer el objetivo final Bsqueda en la bibliografa de informacin sobre el mtodo actual; o identificacin de un mtodo similar; o nuevo enfoque; o recomendacin de colegas, o recomendacin de la UNODC o de otra organizacin competente Evaluacin preliminar para establecer si puede cumplir los requisitos

VALIDACIN DEL MTODO 4. Identificar el tipo de mtodo (los requisitos especficos dependern de que el mtodo sea cualitativo o cuantitativo y de las tcnicas que hayan de utilizarse) 5. Preparar la documentacin de la validacin 6. Redactar las instrucciones para los usuarios (procedimientos normalizados de trabajo con ese mtodo) 7. Recibir la autorizacin de la direccin (Vase el prrafo 4 de la Parte II)

Definir por escrito los trabajos experimentales y el proceso de validacin (vase el prrafo 6 de la Parte II) (Vase ST/NAR/25)

(Vase el prrafo 1 de la Parte II)

SUPERVISIN Y CONTROL DEL FUNCIONAMIENTO DEL MTODO 8. Realizar controles de calidad para vigilar el cumplimiento de los criterios de aceptacin del mtodo, dado el objetivo final (vase la etapa 1) 9. Examinar el mtodo y proponer cambios 10. Recibir autorizacin de la direccin Utilizar normas identificables, muestras en blanco, muestras aadidas con otras sustancias, grficos de control, etc. y programas de anlisis externo de los resultados Volver a validar cuando proceda y preparar revisiones de los procedimientos normalizados de trabajo Actualizar los procedimientos normalizados de trabajo

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2.3 Etapas preliminares


La cuestin fundamental a resolver antes de crear un nuevo mtodo es establecer qu uso se har de los resultados. De este uso derivarn los criterios de calificacin del funcionamiento del mtodo, lo que puede dar lugar a que se establezca, o limite, el nmero de tcnicas entre las que elegir. Valga un ejemplo: cualquier mtodo de anlisis cuantitativo de drogas fiscalizadas en materiales incautados tendr que cumplir algunos requisitos mnimos de exactitud y precisin, selectividad, etc., para que pueda aceptarse su utilizacin general. Un segundo ejemplo sera el siguiente: la utilizacin de un mtodo de anlisis de metabolitos de estupefacientes en especmenes biolgicos en concentraciones dbiles puede exigir a su vez la utilizacin de tcnicas que tengan la mayor sensibilidad y selectividad posibles, condiciones que slo pueden cumplir la cromatografa en fase gaseosa o la cromatografa en fase lquida combinada con una espectrometra de masas. En lo que respecta a los recursos humanos y financieros del laboratorio, es importante evitar la especificacin innecesaria de requisitos de funcionamiento, ya que puede suponer que se prolonguen los plazos para realizar los anlisis, un aumento de los costes y un exceso de informacin.

2.4 Validacin del mtodo


Las buenas prcticas de fabricacin vigentes en los Estados Unidos (Cdigo de Reglamentos Federales, Administracin de Alimentos y Drogas), la Pharmacopoeia Convention de los Estados Unidos, la Asociacin de Salud Pblica Americana y la Conferencia Internacional de Armonizacin [2], entre otros, han sido la base de diversos protocolos de validacin de mtodos que pueden encontrarse en la bibliografa especializada y ser tiles. Adems, el Grupo de trabajo cientfico para el anlisis de drogas incautadas (SWGDRUG), la ENFSI, la UIQPA y Eurachem/CITAC han publicado series detalladas de recomendaciones [5]. Los mtodos se pueden clasificar de distinta forma [7], pero en el presente caso debe establecerse una diferencia clara entre los mtodos cualitativos y los cuantitativos. Los mtodos cualitativos de anlisis de drogas exigen la definicin de una serie de parmetros cuyo cumplimiento es necesario para la validacin: y y y y Especificidad/selectividad Lmite de deteccin Precisin (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio) Estabilidad.

Cuando se trate de mtodos cualitativos en los que sea necesario establecer un nivel de concentracin definido (un umbral) para reflejar resultados, deben determinarse los tres parmetros adicionales siguientes:

Validacin y verificacin de mtodos analticos

y
y y

Linealidad
Exactitud (sesgo) (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio) en el umbral de concentracin Precisin (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio) en el umbral de concentracin.

Los mtodos cuantitativos de anlisis de drogas exigen, para su validacin, que se determine la siguiente serie de parmetros que han de cumplirse: y y y y y y y y Especificidad/selectividad Lmite de deteccin Precisin (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio) Linealidad y rango de trabajo Exactitud (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio) Recuperacin Incertidumbre de la medicin Estabilidad.

Otros parmetros cuya determinacin es aconsejable, pero no fundamental, son el lmite inferior de cuantificacin y la robustez. En el caso de que los mtodos cualitativos y cuantitativos hayan de ser utilizados por ms de un laboratorio, cada uno de ellos debe verificar el mtodo y debe determinar con los otros su precisin y exactitud.

2.5 Verificacin del mtodo


Si un laboratorio est utilizando un mtodo que ya ha sido validado, no es necesario volver a validarlo en su totalidad aunque deba verificarse el cumplimiento de los parmetros mnimos antes enumerados. Normalmente la verificacin supone determinar el cumplimiento de menos parmetros y hacer menos mediciones de cada parmetro que si se tratara de una validacin. Los resultados de la verificacin pueden diferir levemente de los obtenidos en la validacin, pero debe determinarse si son aceptables teniendo en cuenta el objetivo que se persigue al utilizar el mtodo. Los mtodos cualitativos de anlisis de drogas requieren, para su verificacin, que se determine la siguiente serie de parmetros: y y y Especificidad/selectividad, si la matriz de la muestra difiere de la utilizada cuando se elabor el mtodo Lmite de deteccin Precisin (en condiciones de repetibilidad o reproducibilidad).

En el caso de los mtodos cualitativos que tienen un umbral de concentracin para reflejar resultados, deben determinarse los siguientes parmetros adicionales:

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y y

Exactitud (sesgo) en el umbral de concentracin Precisin en el umbral de concentracin.

La exactitud y la precisin deben determinarse en el umbral de concentracin. Los mtodos cuantitativos de anlisis de drogas exigen la determinacin de la siguiente serie de parmetros para su verificacin: y y y Especificidad/selectividad y lmite de deteccin si la matriz de la muestra difiere de la utilizada al elaborarse el mtodo Exactitud (sesgo) (en condiciones de repetibilidad o reproducibilidad) Precisin (en condiciones de repetibilidad o reproducibilidad).

2.6 Parmetros para la validacin/verificacin


Especificidad (selectividad)
Este parmetro se relaciona con el grado en que otras sustancias interfieren en la identificacin y, si procede, en la cuantificacin de los analitos de que se trate. Mide la capacidad del mtodo para identificar/cuantificar los analitos en presencia de otras sustancias, endgenas o exgenas, en una muestra de la matriz en las condiciones exigidas por el mtodo. La especificidad se determina aadiendo materiales que podran encontrarse en la muestra. Por ejemplo, para hacer un ensayo de la especificidad de un mtodo inmunolgico aplicado a especmenes biolgicos pueden utilizarse sustancias que potencialmente reaccionen entre s; una prueba de la especificidad de un mtodo visual sera aadir sustancias interferentes que puedan ocultar o enmascarar la reaccin de color; un mtodo cromatogrfico para determinar la concentracin de drogas ilcitas en muestras clnicas no debe admitir interferencias por parte de los frmacos que quepa esperar que se utilicen simultneamente. La especificidad depende de la concentracin y debe determinarse el margen de error de calibracin en su nivel ms bajo. La validacin debe garantizar el buen funcionamiento del mtodo, y que ste distingue los efectos de las impurezas, las sustancias que reaccionan entre s, etc., que podran estar presentes en la matriz.

Lmite de deteccin
Se trata de la concentracin mnima de analito que puede ser detectada e identificada con un determinado grado de certidumbre. El lmite de deteccin se define tambin como la concentracin mnima que puede distinguirse del ruido de fondo con un determinado grado de confianza. Para estimar el lmite de deteccin pueden utilizarse varios mtodos, todos los cuales dependen del anlisis de especmenes en blanco y el examen de la relacin entre la seal y el ruido. Por lo general se acepta un requisito mnimo de relacin seal/ruido de 3/1. El lmite de deteccin no es un parmetro robusto y puede resultar afectado por cambios menores del sistema analtico (por ejemplo, temperatura, pureza de los reactivos, efectos de

Validacin y verificacin de mtodos analticos

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matriz, condiciones instrumentales). Por tanto, es importante que este parmetro sea siempre verificado por laboratorios que hayan adoptado mtodos previamente validados.

Precisin (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad)


La precisin mide el grado de acuerdo entre los resultados analticos obtenidos de una serie de mediciones repetidas del mismo analito realizadas en las condiciones previstas en el mtodo. La precisin refleja los errores aleatorios que se producen cuando se utiliza un mtodo. Las condiciones en que se mide la precisin se dividen, segn opinin general, en condiciones repetibles y condiciones reproducibles. La repetibilidad de las condiciones existe cuando el mismo analista analiza muestras el mismo da y con el mismo instrumento (por ejemplo, cromatgrafo en fase gaseosa) o los mismos materiales (por ejemplo, reactivos para pruebas visuales) y en el mismo laboratorio. Cualquier cambio de estas condiciones (por ejemplo, diferentes analistas, diferentes das, diferentes instrumentos, diferentes laboratorios) implica que las condiciones slo sern reproducibles. La precisin normalmente se mide en trminos de coeficiente de variacin o desviacin tpica relativa de los resultados analticos obtenidos con patrones de control preparados independientemente. La precisin depende de la concentracin y debe medirse con concentraciones diferentes dentro del rango aceptado, normalmente en la parte baja, media y alta de ste. Una precisin aceptable en el nivel inferior de concentracin es del 20%. Con concentraciones ms altas la precisin debe ser mayor. En algunos casos estos criterios de aceptacin pueden suavizarse, por ejemplo, en los anlisis de muestras de autopsias, en los que los efectos de matriz pueden ser importantes.

Linealidad y margen de error (rango)


Tradicionalmente se considera que un mtodo es lineal cuando existe una relacin directamente proporcional entre la respuesta obtenida cuando se aplica el mtodo y la concentracin del analito en la matriz dentro del rango de concentraciones del analito buscado (rango de trabajo). El rango de trabajo viene definido por la finalidad del mtodo y puede representar slo una parte de la totalidad de la lnea recta. Habitualmente los criterios de aceptacin implican una prueba de la bondad de ajuste. Frecuentemente se utiliza como criterio de la linealidad un coeficiente de correlacin (r) elevado, del 0,99. Sin embargo, este criterio no basta para demostrar que existe una relacin lineal, por lo que cabe considerar que se puede utilizar un mtodo que no permita establecer un coeficiente de correlacin tan alto como el 0,99 pero permita cumplir los fines previstos. Estos parmetros no son aplicables a los mtodos cualitativos salvo si se establece un umbral de concentracin para reflejar resultados.

Exactitud (sesgo)
Medicin de la diferencia entre los resultados previstos del anlisis y el valor de referencia aceptado, debido a un error sistemtico del mtodo y del laboratorio. Normalmente se expresa

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Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

en porcentaje. La exactitud y la precisin determinan el error total del anlisis. La exactitud se determina tericamente utilizando material de referencia certificado (MRC) si es posible, mtodos de referencia, estudios en colaboracin o mediante comparacin con otros mtodos [4]. En la prctica, pocas veces se dispone de MRC para analizar drogas objeto de consumo indebido. Para las drogas de este tipo que se encuentran en los fluidos biolgicos se dispone de los MRC del Instituto Nacional de Normas y Tecnologa (NIST) de los Estados Unidos, pero no abarcan un gran nmero de sustancias. Como alternativa, pueden utilizarse los patrones de referencia de una organizacin autorizada, como la UNODC, la Direccin de Lucha contra las Drogas (DEA) de los Estados Unidos o un proveedor comercial acreditado. Lo normal es estimar la exactitud analizando muestras aadidas con tres concentraciones distintas (baja, media y alta) que abarquen la totalidad del rango de trabajo. La concentracin de estas adiciones estndar debe ser distinta de la utilizada para preparar las curvas de calibracin y debe prepararse con una solucin estndar de trabajo distinta. Los criterios de aceptacin de la exactitud deben ser similares a los utilizados para medir la precisin.

Recuperacin
Por recuperacin de analitos en un ensayo se entiende la respuesta del detector ante una adicin o extraccin de analito de la matriz, en comparacin con su respuesta ante la concentracin real del estndar de referencia verdadero (los materiales incautados). Tambin puede entenderse como el porcentaje de droga, metabolito o estndar interno presente inicialmente en el espcimen, que llega hasta el final del procedimiento. Tratndose de especmenes biolgicos, las muestras en blanco de la matriz biolgica despus de haberse obtenido los ltimos extractos pueden ser objeto de una adicin estndar del componente puro y autntico con su concentracin real y ser analizados a continuacin. Los experimentos de recuperacin deben hacerse comparando los resultados analticos de las muestras extradas con tres concentraciones (normalmente iguales a las de las muestras de control utilizadas para valorar la precisin y exactitud de un mtodo). No es necesario que la recuperacin del analito sea del 100%, pero el grado de recuperacin (del analito y del estndar interno) debe ser estable (con cualquier tipo de concentracin analizada), precisa y reproducible (ms del 20%).

Medicin de la incertidumbre [8, 9, 10]


Los laboratorios de anlisis deben establecer y aplicar procedimientos de estimacin de la incertidumbre de las mediciones [1]. Tener en cuenta la incertidumbre aumenta la garanta de que los resultados y conclusiones obtenidos con los mtodos y programas analticos utilizados permiten cumplir los objetivos fijados [11]. En metrologa, la incertidumbre se define como un parmetro asociado con el resultado de una medicin que caracteriza la dispersin de los valores que puede atribuirse razonablemente al mensurando. (Mensurando: cantidad concreta medida.). En trminos ms prcticos la incertidumbre se puede definir como la probabilidad o el nivel de confianza. Cualquier medicin que hagamos entraar un cierto grado de incertidumbre, por lo que el intervalo de incertidumbre que se fije ser el rango dentro del cual se situar

Validacin y verificacin de mtodos analticos

13

el valor real con un determinado grado de confianza. Normalmente se utiliza un grado de confianza del 95% [12]. Entender qu significa la incertidumbre es fundamental para interpretar los resultados e informar sobre ellos [11]. El laboratorio debe intentar al menos identificar todos los motivos de incertidumbre y hacer una estimacin razonable de ellos, y debe asegurarse de que la forma de informar sobre los resultados no transmite una falsa sensacin de incertidumbre. La incertidumbre de las mediciones, por lo general, tiene muchos componentes. La incertidumbre se calcula estimando los errores que se producen en las distintas etapas del anlisis, por ejemplo, la etapa preanaltica, la homogeneizacin, el pesaje, el pipeteado, la inyeccin, la extraccin, la derivacin, la recuperacin y las curvas de calibracin. Los datos exigidos para la validacin, por ejemplo, la exactitud y precisin en condiciones de repetibilidad/ reproducibilidad, reflejan ya muchos de estos factores y deben ser utilizados. Pueden hacerse estimaciones de la incertidumbre (con el nivel exigido de confianza del 95%) utilizando la siguiente frmula:

en la que u1, u2 etc. son los motivos individuales de incertidumbre. Los motivos individuales de incertidumbre, que representen menos del 20% del motivo ms importante, tienen escasa incidencia en la incertidumbre general y pueden omitirse en el clculo.

Estabilidad
Para validar un mtodo debe demostrarse en qu medida los analitos se mantienen estables durante todo el procedimiento de anlisis, incluido su almacenamiento antes y despus de ste. En general, la medicin se hace comparando patrones recin preparados con una concentracin conocida con patrones similares almacenados durante diferentes perodos de tiempo y en diferentes condiciones. Vase la nota 13 y las referencias a que remite [13].

2.7 Supervisin y control del funcionamiento del mtodo


Despus de haber sido validado o verificado, y de haberse empezado a utilizar, cualquier sistema de garanta de la calidad exige una vigilancia continua para establecer si sigue funcionando de acuerdo con las especificaciones. Este proceso de vigilancia supone un control continuo de la calidad del mtodo a travs de muestras en blanco, controles y calibradores y el examen de los componentes del sistema (lo que a veces se denomina prueba de la conveniencia del sistema) [14], por ejemplo, funcionamiento de las columnas cromticas en trminos de resolucin y forma de los picos, respuesta de los detectores y especificaciones de los reactivos. Para el control del mtodo deben establecerse unos lmites claros (por

14

Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

ejemplo, la variabilidad aceptable de la respuesta del detector), as como las medidas correctivas que deben adoptarse si se traspasan, entre ellas la recalibracin, la reverificacin o la revalidacin del mtodo.

2.8 Ejercicios de colaboracin entre laboratorios/ pruebas de rendimiento


Estos estudios son fundamentales para establecer la fiabilidad y compatibilidad de los datos que sea necesario compartir. Los ejercicios de colaboracin se pueden considerar un componente de la validacin de mtodos, pues permiten estimar la exactitud y precisin de stos en condiciones de reproducibilidad y determinar su robustez. Algunos ejercicios de este tipo exigen que se utilice en cada instalacin el mismo mtodo. Los ejercicios de colaboracin y los programas de anlisis del rendimiento se pueden utilizar para vigilar y comparar el funcionamiento de un laboratorio con el de otros laboratorios que producen datos equivalentes. Existen varios programas de garanta externa del control de la calidad de los anlisis de drogas fiscalizadas, entre ellos los ejercicios internacionales de colaboracin de la UNODC. Vanse tambin las Guas ISO/IEC 43-1 y 43-2 sobre la acreditacin de proveedores de programas de ensayos de aptitud.

2.9

Directrices prcticas para la validacin de mtodos

2.9.1
Criterios para la aprobacin

Materiales incautados - Anlisis cualitativo

Parmetro

Requisitos para la validacin

a) Pruebas de color
Ninguna interferencia importante (enmascaramiento de los resultados) por parte de sustancias cuya presencia sea normal. y Todas las drogas del grupo de inters dan resultados negativos identificados. y Menos del 5% de las muestras reales o simuladas que se utilizan para la prueba contienen el analito en la concentracin mnima que es probable que se encuentre en las muestras concretas analizadas por el laboratorio y que dan origen a falsos negativos. y La tasa de falsos negativos debe ser rebajada a un mnimo (a ser posible un 0%) cuando se utiliza una prueba de color para hacer una criba inicial y no se realiza otra prueba si el resultado es negativo. y Menos del 10% de las muestras reales o simuladas analizadas que no contienen el analito buscado dan falsos positivos

Validacin y verificacin de mtodos analticos

Especificidad/ selectividad

Analizar las siguientes muestras en las condiciones especificadas para la prueba y tomar nota del color obtenido en el tiempo previsto:

y Todas las drogas fiscalizadas que estn incluidas en el grupo de inters.

Todos los componentes de fuentes naturales o de un proceso de preparacin sinttica que normalmente se encuentren presentes en las muestras incautadas que contienen el grupo de drogas de inters.

y Todas las sustancias que normalmente se encuentren como diluyentes, excipientes, etc., en la matriz incautada que contenga la droga.

y Muestras de drogas fiscalizadas de otros grupos.

y Una gama de muestras reales o simuladas de materiales incautados de composicin conocida por sus efectos de matriz.

El nmero de muestras analizadas debe ser lo ms amplio posible dentro de unos lmites practicables, pero se sugiere un mnimo de 20.

15

16

2.9.1
Criterios para la aprobacin

Materiales incautados - Anlisis cualitativo (continuacin)

Parmetro

Requisitos para la validacin

a) Pruebas de color (continuacin)


El lmite de deteccin debe ser lo suficientemente bajo para que el anlisis pueda cumplir su objetivo.

Lmite de deteccin

Analizar muestras de una seleccin de drogas puras del grupo de inters en cantidades decrecientes hasta que no puedan ser detectadas.

Determinar los efectos de matriz en el lmite de deteccin aadiendo la sustancia a diversas matrices de uso frecuente en un laboratorio.

Normalmente se requerir una prueba para detectar el analito en la concentracin mnima que es probable que se encuentre en las muestras analizadas por el laboratorio.

El mtodo analtico deber especificar la cantidad de material que ha de analizarse. No ms de una muestra de cada cinco (el 20%) debe dar un falso negativo.

Precisin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad

Analizar al menos diez rplicas de muestras de composicin conocida con una concentracin de 1,25 a 2 veces el nivel del lmite de deteccin.

b)

Anlisis de microcristales
El mtodo analtico debe posibilitar por su especificidad y selectividad el cumplimiento de los objetivos (es decir, tasas mnimas de falsos positivos con diferentes matrices cuando se hace una criba inicial de sustancias fiscalizadas).

Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

Especificidad/ selectividad

Examinar cada droga incluida en el grupo de inters en un rango de matrices tpicas en las condiciones especificadas para la prueba, fotografiarlas y anotar las caractersticas que definan una droga en particular o una droga incluida en un grupo establecido.

Lmite de deteccin

Analizar muestras de cada droga concreta perteneciente al grupo de inters en diversas matrices comunes con una serie de diluciones que establezca la concentracin mnima en que todava puede detectarse la droga con confianza. No ms de una muestra de cada cinco (el 20%) debe dar un falso negativo.

El lmite de deteccin debe ser lo suficientemente bajo para que el anlisis pueda cumplir su objetivo. Normalmente se requerir una prueba para detectar el analito en la concentracin mnima que es probable que se encuentre en las muestras analizadas por el laboratorio.

Precisin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad

Analizar al menos diez rplicas de muestras de composicin conocida con una concentracin de 1,25 a 2 veces el nivel del lmite de deteccin.

Validacin y verificacin de mtodos analticos

c) Tcnicas espectroscpicas (UV, IR, NMR, IMS, MS)


El mtodo analtico debe posibilitar por su especificidad y selectividad el cumplimiento de los objetivos (es decir, tasas mnimas de falsos positivos con diferentes matrices cuando se hace una criba inicial de sustancias fiscalizadas).

Especificidad/ selectividad

Analizar en las condiciones especificadas para la prueba e identificar las absorciones, resonancias o iones caractersticos de:

y Muestras de todas las drogas fiscalizadas que estn incluidas en el grupo de inters.

y Muestras de todos los componentes de fuentes naturales o de un proceso de preparacin sinttica que normalmente se encuentren presentes en las muestras incautadas que contienen el grupo de drogas de inters.

y Todas las sustancias que normalmente se encuentren como diluyentes, excipientes, etc., en la matriz incautada que contiene la droga.

y Muestras de drogas fiscalizadas de otros grupos.

17

18

2.9.1
Criterios para la aprobacin

Materiales incautados - Anlisis cualitativo (continuacin)

Parmetro

Requisitos para la validacin

c) Tcnicas espectroscpicas (UV, IR, NMR, IMS, MS (continuacin)

y Una gama de muestras reales o simuladas de materiales incautados de composicin conocida por sus efectos de matriz.

El nmero de muestras analizadas debe ser lo ms amplio posible dentro de unos lmites practicables, pero se sugiere un mnimo de 20. El lmite de deteccin debe ser lo suficientemente bajo para que el anlisis pueda cumplir su objetivo. Normalmente se requerir una prueba para detectar el analito en la concentracin mnima que es probable que se encuentre en las muestras analizadas por el laboratorio. No ms de una muestra de cada cinco (el 20%) debe dar un falso negativo.

Lmite de deteccin

Analizar muestras de una seleccin de drogas incluidas en los grupos de inters en diversas matrices de uso comn en laboratorios en un rango de diluciones para establecer la concentracin mnima en la que todava pueden detectarse las drogas con confianza.

Precisin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad

Analizar al menos diez rplicas de muestras de composicin conocida con una concentracin de 1,25 a 2 veces el nivel del lmite de deteccin.

d)

Cromatografa en capa delgada


El mtodo analtico debe posibilitar por su especificidad y selectividad el cumplimiento de los objetivos (es decir, tasas mnimas de falsos positivos con diferentes matrices cuando se hace una criba inicial de sustancias fiscalizadas).

Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

Especificidad/ selectividad

Teniendo precaucin de no sobrecargar la placa, analizar en las condiciones establecidas para la prueba y anotar los valores Rf y el color obtenidos en el tiempo previsto para:

y Todas las drogas fiscalizadas que estn incluidas en el grupo de inters.

y Todos los componentes de fuentes naturales o de un proceso de preparacin sinttica que normalmente se encuentren en las muestras incautadas que contienen el grupo de drogas de inters.

y Todas las sustancias que normalmente se encuentren como diluyentes, excipientes, etc., en la matriz incautada que contiene la droga.

Validacin y verificacin de mtodos analticos

y Muestras de drogas fiscalizadas de otros grupos.

y Analizar mezclas de sustancias de Rf similar y confirmar cules pueden ser identificadas en presencia de las otras. El lmite de deteccin debe ser lo suficientemente bajo para que el anlisis pueda cumplir su objetivo. Normalmente se requerir una prueba para detectar el analito en la concentracin mnima que es probable que se encuentre en las muestras analizadas por el laboratorio. No ms de una muestra de cada cinco (el 20%) debe dar un falso negativo.

Lmite de deteccin

Analizar muestras de una seleccin de drogas incluidas en los grupos de inters en diversas matrices comunes y en un rango de diluciones para establecer la concentracin mnima en la que todava pueden detectarse las drogas con confianza.

Precisin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad

Determinar la variacin dentro del laboratorio y entre distintos laboratorios de los valores Rf relativos obtenidos mediante la comparacin del valor Rf de referencia con el valor Rf obtenido del anlisis en paralelo de un material estndar.

19

20

2.9.1
Criterios para la aprobacin

Materiales incautados - Anlisis cualitativo (continuacin)

Parmetro

Requisitos para la validacin

e) CFG/Cromatografa en fase lquida de alto rendimiento (HPLC)/Electroforesis capilar


El mtodo analtico debe posibilitar por su especificidad y selectividad el cumplimiento de los objetivos (es decir, tasas mnimas de falsos positivos con diferentes matrices cuando se hace una criba inicial de sustancias fiscalizadas).

Especificidad/ selectividad

Analizar en las condiciones establecidas para la prueba y anotar los tiempos de retencin obtenidos para:

y Todas las drogas fiscalizadas que estn incluidas en el grupo de inters.

y Todos los componentes de fuentes naturales o de un proceso de preparacin sinttica que normalmente se encuentren en las muestras incautadas que contengan el grupo de drogas de inters.

y Todas las sustancias que normalmente se encuentren como diluyentes, excipientes, etc., en la matriz incautada que contiene la droga.

y Muestras de drogas fiscalizadas de otros grupos.

Analizar mezclas de sustancias de Rf similar y confirmar que pueden ser identificadas unas en presencia de las otras. El lmite de deteccin debe ser lo suficientemente bajo para que el anlisis pueda cumplir su objetivo. Normalmente se requerir una prueba para detectar el analito en la concentracin mnima que es probable que se encuentre en las muestras analizadas por el laboratorio.

Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

Lmite de deteccin

Analizar muestras de una seleccin de drogas incluidas en los grupos de inters en diversas matrices comunes en un rango de diluciones para establecer la concentracin mnima en la que todava pueden detectarse las drogas con confianza (coeficiente entre la seal y el ruido no inferior a 3/1).

Precisin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad La diferencia entre las RSD debe ser inferior al 2%.

Analizar al menos diez rplicas de muestras de composicin conocida con una concentracin de 1,25 a 2 veces el nivel del lmite de deteccin.

No ms de una muestra de cada cinco (el 20%) debe dar un falso negativo.

Determinar el coeficiente de variacin (desviacin estndar de los residuos (RSD) [15] de los tiempos de retencin en comparacin con la muestra de referencia.

f)

CFG Inmunoensayo (semicuantitativo)


Las especificaciones de los inmunoensayos en trminos de especificidad y selectividad deben permitir cumplir los objetivos previstos (es decir, tasas mnimas de falsos positivos con diferentes matrices cuando se hace una criba inicial de sustancias fiscalizadas).

Validacin y verificacin de mtodos analticos

Especificidad/ selectividad

Utilizando el proceso establecido de extraccin/ pretratamiento, analizar:

y Todas las drogas fiscalizadas que estn incluidas en el grupo de inters.

y Todos los componentes de fuentes naturales o de un proceso de preparacin sinttica que normalmente se encuentren en las muestras incautadas que contengan el grupo de drogas de inters.

y Todas las sustancias que normalmente se encuentren como diluyentes, excipientes, etc., en la matriz incautada que contiene la droga.

y Muestras de drogas fiscalizadas de otros grupos.

y Una gama de muestras reales o simuladas de materiales incautados de composicin conocida por sus efectos de matriz.

El nmero de muestras analizadas debe ser lo ms amplio posible dentro de unos lmites practicables, pero se sugiere un mnimo de 20.
21

22

2.9.1
Criterios para la aprobacin

Materiales incautados - Anlisis cualitativo (continuacin)

Parmetro

Requisitos para la validacin

f)

CFG Inmunoensayo (semicuantitativo) (continuacin)


El lmite de deteccin debe ser lo suficientemente bajo para que el anlisis pueda cumplir su objetivo. Normalmente se requerir una prueba para detectar el analito en la concentracin mnima que es probable que se encuentre en las muestras analizadas por el laboratorio. No ms de una muestra de cada cinco (el 20%) debe dar un falso negativo.

Lmite de deteccin

Analizar muestras de una seleccin de drogas incluidas en los grupos de inters en diversas matrices comunes en un rango de diluciones para establecer la concentracin mnima en la que todava pueden detectarse las drogas con confianza.

Precisin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad

Determinar la precisin en condiciones de repetibilidad analizando al menos diez rplicas de muestras de composicin conocida con una concentracin de 1,25 a 2 veces el lmite.

Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

Nota: En la CFG-EM, el espectrmetro de masas puede funcionar como mecanismo de barrido de iones o como mecanismo SIM (seleccin de un in). En la cromatografa lquida-espectrometra de masas en tndem, el espectrmetro puede operar como mecanismo de barrido de iones o en modo monitorizacin de reaccin mltiple (MRM).

Validacin y verificacin de mtodos analticos

23

En modo barrido de iones, el espectro de las masas se utiliza, junto con el tiempo absoluto o relativo de retencin, para identificar y confirmar la presencia de drogas. Tratndose de una identificacin (que remite a la especificidad y selectividad, y a la exactitud) el tiempo de retencin y el espectro de masa de cada droga que aparezca en la muestra se comparan con los de un patrn analizado en condiciones idnticas, normalmente en la misma tanda o el mismo da. Como alternativa, el espectro se puede comparar con los patrones archivados, utilizndose un sistema de bsqueda de archivos normal. El tiempo de retencin de la presunta droga debe coincidir mucho con el del posible patrn (con un margen de exactitud de 2%) y el espectro debe ser muy parecido visualmente al del patrn o conseguir, en una escala 0-1000, un nivel mnimo de coincidencia en la bsqueda de archivos de 900. Cuando se utiliza en modo SIM/MRM, se eligen para cada analito de inters por lo menos tres iones/transiciones, lo que normalmente incluir los picos de base y los iones moleculares ms otro in de diagnstico. Tratndose de una identificacin, las reas de los picos en los cromatogramas de los iones seleccionados en el tiempo de retencin del analito deben tener una intensidad equivalente a las de un patrn analizado en la misma tanda y en condiciones idnticas, con un margen de error tolerable de 20%, aproximadamente. Criterios similares se pueden aplicar a los cromatogramas de masas generados por computadora a partir de datos obtenidos mediante un barrido total de iones, si este modo de operar ofrece una sensibilidad adecuada y hay un nmero suficiente de espectros de masas (ms de 12) en el pico cromatogrfico para que puedan determinarse reas de picos con una exactitud razonable. Si el espectrmetro de masas opera en modo ionizacin qumica, slo podr haber un in y la identificacin de la droga tendr que hacerse en funcin del tiempo de retencin y del hecho de que ese in est presente.

24

2.9.2
Criterios para la aprobacin

Materiales incautados Anlisis cuantitativo

Parmetro

Requisitos para la validacin

a) Tcnicas espectroscpicas (UV, IR, NMR, IMS, MS)


Como en el anlisis cualitativo Deben cumplirse los requisitos de exactitud y precisin.

Especificidad/ selectividad

Como en el anlisis cualitativo

Lmite de cuantificacin

Analizar muestras de cada droga concreta incluida en la clase (clases) de inters en diversas matrices de uso comn en laboratorios en una serie de diluciones para establecer la concentracin mnima que permite cuantificar todava la droga con confianza.

Linealidad y rango de trabajo*

Analizar una muestra en blanco y otras seis muestras en blanco preparadas independientemente que contengan la droga de inters en seis concentraciones distintas distribuidas en intervalos iguales a lo largo del rango de inters.

El rango de trabajo debe permitir la obtencin de los resultados previstos.

Exactitud

Deben analizarse rplicas de especmenes en blanco aadidos con las drogas de inters en tres niveles distintos (alto, medio y bajo) en tres das consecutivos. El nmero de rplicas en cada nivel de concentracin y en cada da debe ser al menos tres. La diferencia entre el resultado medio y el resultado esperado (vase la Parte II F) debe expresarse en porcentaje.

Todos los resultados se encuentran en una banda de 20% del valor esperado en los niveles de concentracin bajos y del 15% en los niveles de concentracin altos.

Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

Precisin

Comparar los resultados obtenidos para cada espcimen en blanco y aadido en cada nivel de concentracin establecido para determinar la exactitud y expresar la variacin en trminos de desviacin estndar relativa de cada concentracin.

La desviacin estndar relativa no debe ser mayor del 20% en los niveles de concentracin bajos y del 15% en los niveles altos.

Recuperacin (si se necesita una extraccin)

Preparar muestras del analito con tres niveles de concentracin en una matriz tpica. Hganse cinco rplicas de los extractos de cada muestra. Al mismo tiempo analcense las soluciones estndar del analito de que se trate. La recuperacin se calcula a continuacin comparando las respuestas espectroscpicas del analito, por ejemplo, las absorciones, con las de los patrones. Nota: como se indica en la Parte II, el porcentaje de recuperacin absoluta no es fundamental en la medida en que sea reproducible y el lmite bajo de cuantificacin sea adecuado.

La recuperacin debe ser reproducible con un margen de 15%.

Recuperacin % = [A1/A2] x 100.

Para cada muestra utilizada para la extraccin:

A1 = respuesta del analito Como orientacin general, la incertidumbre debe situarse en una banda de 15% del lmite de cuantificacin; 10% del rango medio o alto.

Validacin y verificacin de mtodos analticos

A2 = respuesta del patrn.

Incertidumbre

Estimar los errores en cada etapa del proceso analtico utilizando los datos de la validacin, si se dispone de ellos, y calcular la incertidumbre total (vase el apartado 2.6. de la Parte II).

b) CFG/HPLC/Electroforesis capilar
Como en el anlisis cualitativo El lmite de cuantificacin debe ser adecuado para los fines previstos (es decir, de ser sometido a un control de calidad externo, debe permitir el cumplimiento de los objetivos de calidad que correspondan).

Especificidad/ selectividad

Como en el anlisis cualitativo

Lmite de cuantificacin

Analizar, una sola vez, diez muestras en blanco extradas de una matriz tpica de la droga que contengan sta en concentraciones prximas al nivel mnimo (cercano al lmite de cuantificacin) en el que puede percibirse una seal que indique su presencia.

Expresar el lmite de cuantificacin como desviacin estndar de 3 o 10 del valor de la muestra en blanco en la posicin de la droga.
25

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2.9.2
Criterios para la aprobacin

Materiales incautados Anlisis cuantitativo (continuacin)

Parmetro

Requisitos para la validacin

b)

CFG/HPLC/Electroforesis capilar (continuacin)


El rango de trabajo debe permitir la obtencin de los resultados previstos.

Linealidad y rango de trabajo*

Analizar una muestra en blanco y otras seis muestras en blanco preparadas independientemente que contengan la droga de inters en seis concentraciones distintas distribuidas en intervalos iguales a lo largo del rango de inters.

Precisin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad

Analizar diez muestras en blanco preparadas independientemente y aadidas con la droga de inters en seis concentraciones distribuidas a intervalos iguales dentro del rango de trabajo y expresar la variacin en trminos de desviacin estndar de cada concentracin.

La desviacin estndar de los controles de concentraciones bajas debe ser inferior al 20% y la de los controles de otros niveles debe ser inferior al 15%. Los errores en los controles de concentraciones bajas han de ser inferiores al 20% y en los dems controles inferiores al 15%. La recuperacin debe ser reproducible con un margen de 15%. Nota: como se indic en la Parte II F, el porcentaje absoluto de recuperacin no es fundamental en la medida en que sea reproducible y permita un lmite bajo de cuantificacin que sea adecuado.

Exactitud

Analizar diez muestras en blanco preparadas independientemente y aadidas con la droga de inters en tres niveles de concentracin distintos (alto, medio y bajo) y expresar la diferencia entre el resultado medio y el resultado esperado en porcentaje.

Recuperacin (cuando se necesite una extraccin)

Preparar muestras del analito con tres niveles de concentracin en una matriz tpica. Hganse cinco rplicas de los extractos de cada muestra. Adase a cada extracto una cantidad conocida del patrn interno. Al mismo tiempo analcense soluciones estndar del analito de que se trate que contengan la misma cantidad de patrn interno. La recuperacin se calcula a continuacin comparando la relacin entre las reas del pico del analito con las reas del pico del patrn interno en las muestras de las que se obtuvieron extractos y en las que no.

Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

Recuperacin % = ([A1/A2]/[A3/A4]) x 100.

Para las muestras de las que se obtuvieron los extractos:

A1 = rea del pico del analito

A2 = rea del pico del patrn interno.

Para las soluciones estndar:

A3 = rea del pico del analito

Validacin y verificacin de mtodos analticos

A4 = rea del pico del patrn interno. Como orientacin general, la incertidumbre debe situarse en una banda de 15% del lmite de cuantificacin; 10% del rango medio o alto.

Incertidumbre

Estimar los errores en cada etapa del proceso analtico utilizando los datos de la validacin, si se dispone de ellos, y calcular la incertidumbre total (vase el apartado 2.6. de la Parte II).

Nota: En la CFG-EM, el espectrmetro de masas puede funcionar como mecanismo de barrido de iones o como mecanismo SIM (seleccin de un in). En la cromatografa lquida-espectrometra de masas en tndem, el espectrmetro puede operar como mecanismo de barrido de iones o en modo monitorizacin de reaccin mltiple (MRM).

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Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

En modo barrido de iones, el espectro de las masas se utiliza, junto con el tiempo absoluto o relativo de retencin, para identificar y confirmar la presencia de drogas. Tratndose de una identificacin (que remite a la especificidad y selectividad, y a la exactitud) el tiempo de retencin y el espectro de masa de cada droga que aparezca en la muestra se comparan con los de un patrn analizado en condiciones idnticas, normalmente en la misma tanda o el mismo da. Como alternativa, el espectro se puede comparar con los patrones archivados, utilizndose un sistema de bsqueda de archivos normal. El tiempo de retencin de la presunta droga debe coincidir mucho con el del posible patrn (con un margen de exactitud de 2%) y el espectro debe ser muy parecido visualmente al del patrn o conseguir, en una escala 0-1000, un nivel mnimo de coincidencia en la bsqueda de archivos de 900. Cuando se utiliza en modo SIM/MRM, se eligen para cada analito de inters por lo menos tres iones/transiciones, lo que normalmente incluir los picos de base y los iones moleculares ms otro in de diagnstico. Tratndose de una identificacin, las reas de los picos en los cromatogramas de los iones seleccionados en el tiempo de retencin del analito deben tener una intensidad equivalente a las de un patrn analizado en la misma tanda y en condiciones idnticas, con un margen de error tolerable de 20%, aproximadamente. Criterios similares se pueden aplicar a los cromatogramas de masas generados por computadora a partir de datos obtenidos mediante un barrido total de iones, si este modo de operar ofrece una sensibilidad adecuada y hay un nmero suficiente de espectros de masas (ms de 12) en el pico cromatogrfico para que puedan determinarse reas de picos con una exactitud razonable. Si el espectrmetro de masas opera en modo ionizacin qumica, slo podr haber un in y la identificacin de la droga tendr que hacerse en funcin del tiempo de retencin y del hecho de que ese in est presente. A efectos de cuantificacin, uno de los iones/transiciones que se elija se considerar in/transicin de cuantificacin y los dems servirn como iones de control para confirmar la identidad de la presunta droga. Los cromatogramas obtenidos de los iones/transiciones de cuantificacin se utilizan para la validacin de mtodos de manera semejante a los obtenidos con otros detectores CFG como el detector de ionizacin de llama.

2.9.3 Especmenes biolgicos Anlisis cualitativo


Requisitos para la validacin Criterios para la aprobacin

Parmetro

a) Cromatografa en capa delgada

Especificidad/ selectividad

Analizar en las condiciones establecidas para la prueba y anotar los valores de Rf (factor de retencin) de:

y Soluciones estndar de drogas y/o metabolitos dentro del grupo de inters;

Validacin y verificacin de mtodos analticos

y Especmenes en blanco aadidos con drogas y/o metabolitos del grupo de inters;

y Soluciones estndar de drogas de otros grupos.

Verificar que el mtodo analtico permite satisfacer los objetivos previstos en trminos de especificidad y selectividad (es decir, produce unas tasas de falsos positivos mnimas con distintas matrices cuando se utiliza para hacer una criba inicial de sustancias fiscalizadas).

Analizar una matriz en blanco de cinco fuentes distintas por lo menos y verificar la ausencia de sustancias que interfieran en los valores Rf del analito o analitos de inters.

Si otras drogas o sustancias tienen valores Rf similares a los de alguno de los analitos buscados, analizar una mezcla para comprobar si pueden ser diferenciadas del analito o analitos buscados. El lmite de deteccin debe ser lo suficientemente bajo para que el anlisis pueda cumplir sus objetivos. El mtodo debe permitir la deteccin de todos los analitos buscados que sobrepasen los valores de umbral.
29

Lmite de deteccin y umbral

Analizar diez rplicas independientes y aleatorias de extractos (de una matriz tpica de la droga) en blanco, aadidos con la droga de inters y con distintos niveles de concentracin.

Establecer el nivel mnimo en el que se detecta la droga con fidelidad.

Si se ha definido un umbral de concentracin (concentracin crtica), el funcionamiento del mtodo (la cromatografa en capa delgada) se verificar realizando controles de muestras aadidas con una concentracin un 25% superior a la del umbral aproximadamente.

30

2.9.3 Especmenes biolgicos Anlisis cualitativo (continuacin)


Requisitos para la validacin
La RSD debe ser inferior al 20%.

Parmetro

Criterios para la aprobacin

a)

Cromatografa en capa delgada (continuacin)

Precisin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad

Determinar la variabilidad (RSD) de los valores Rf obtenidos de las muestras de control. Si se ha fijado un valor de umbral, la RSD debe determinarse con muestras aadidas con una concentracin que sea un 25% superior al valor de umbral aproximadamente.

b)

CFG/HPLC/Electroforesis capilar
Verificar la ausencia de sustancias que interfieran en el tiempo de retencin de los analitos de inters y del patrn interno.

Especificidad/ selectividad

Analizar en las condiciones establecidas para la prueba y anotar los tiempos de retencin de:

y Soluciones estndar de drogas y/o metabolitos dentro del grupo de inters;

y Especmenes en blanco aadidos con drogas y/o metabolitos del grupo de inters;

y Soluciones estndar de drogas de otros grupos.

Analizar una matriz en blanco de cinco fuentes distintas por lo menos y verificar la ausencia de sustancias que interfieran en los tiempos de retencin de los analitos de inters.

Verificar que el mtodo analtico permite satisfacer los objetivos previstos en trminos de especificidad y selectividad (es decir, produce unas tasas de falsos positivos mnimas con distintas matrices cuando se utiliza para hacer una criba inicial de sustancias fiscalizadas).

Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

Si otras drogas o sustancias tienen tiempos de retencin similares a los de alguno de los analitos buscados, analizar una mezcla para comprobar si pueden ser diferenciadas del analito o analitos buscados.

Lmite de deteccin El lmite de deteccin debe ser lo suficientemente bajo para que el anlisis pueda cumplir su objetivo. Normalmente se requerir una prueba para detectar el analito en la concentracin mnima que es probable encontrar en los especmenes analizados por el laboratorio. No ms de una muestra de cada cinco (el 20%) debe dar un falso negativo. La diferencia entre los RSD debe ser inferior a 2%.

Analizar muestras de una seleccin de drogas incluidas en los grupos de inters en diversas matrices comunes en un rango de diluciones para establecer la concentracin mnima en la que todava pueden detectarse las drogas con confianza (coeficiente entre la seal y el ruido no inferior a 3/1).

Validacin y verificacin de mtodos analticos

Precisin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad

Analizar al menos diez muestras similares de composicin conocida con una concentracin de 125 a 2 veces el nivel del lmite de deteccin.

Determinar el coeficiente de variacin (RSD) de los tiempos de retencin en comparacin con la muestra de referencia.

31

32

2.9.3 Especmenes biolgicos Anlisis cualitativo (continuacin)


Requisitos para la validacin
La reactividad con otras drogas o sustancias no debe ser importante.

Parmetro

Criterios para la aprobacin

c)

Inmunoensayos (semicuantitativos)

Especificidad/ selectividad

Los inmunoensayos comerciales contienen ya informacin sobre la especificidad y selectividad del mtodo. No es necesario verificar esta informacin si el inmunoensayo se utiliza nicamente para los fines previstos.

La utilizacin del inmunoensayo con matrices biolgicas distintas de las ya validadas por el fabricante, por ejemplo, sangre en lugar de orina, exigir su validacin, especialmente en lo que respecta a los efectos de matriz.

Para validar un inmunoensayo, analizar en las condiciones establecidas para la prueba:

y Muestras aadidas con drogas y/o metabolitos fiscalizados del grupo de inters; y Muestras de drogas fiscalizadas de otras clases; y Sustancias que por lo comn se encuentran en la matriz en que se analiza la droga; y Al menos 20 especmenes que se sepa que son positivos; y Al menos 20 especmenes que se sepa que son negativos procedentes de distintas personas Debe ser sustancialmente inferior al nivel de concentracin fijado como umbral para que puedan clasificarse las muestras como positivas o negativas de una forma fiable.

Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

Lmite de deteccin

Los inmunoensayos comerciales normalmente contienen informacin sobre este lmite.

De ser necesaria una validacin, por ejemplo, para analizar un nuevo derivado anfetamnico en la misma matriz o para buscar drogas en diferentes matrices, analizar diez rplicas independientes y al azar de especmenes blancos aadidos con la droga de inters con distintos niveles de concentracin para poder determinar la concentracin mnima que puede detectarse con fiabilidad.

Precisin en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad. Para establecer la repetibilidad (precisin dentro del da) y la precisin intermedia (precisin en distintos das), los valores de la RSD no deben ser inferiores al 20%. Las muestras de control aadidas han de ser clasificadas correctamente por el inmunoensayo segn su nivel de concentracin superior o inferior al umbral.

En la mayora de los inmunoensayos, la decisin de informar sobre la presencia o ausencia de una determinada sustancia no debe basarse en el lmite de deteccin del mtodo sino en el umbral de concentracin establecido como criterio para dar positivo.

Validacin y verificacin de mtodos analticos

El buen funcionamiento de un inmunoensayo con un umbral de concentracin definido (concentracin crtica) debe verificarse analizando muestras de control en tandas aadidas con concentraciones prximas al umbral (25% del umbral de concentracin).

La precisin dentro del da (repetibilidad) puede determinarse analizando muestras de control aadidas con una concentracin del analito que sea un 25% superior al umbral de concentracin. Debe calcularse la RSD de estos datos.

La precisin en distintos das (precisin intermedia) puede obtenerse acumulando datos sobre muestras de control aadidas con una concentracin del analito que sea un 25% superior al umbral, lo que debe hacerse habitualmente con cada tanda de anlisis. Debe calcularse el RSD de estos datos.

Nota: En la CFG-EM, el espectrmetro de masas puede funcionar como mecanismo de barrido de iones o como mecanismo SIM (seleccin de un in). En la cromatografa lquida-espectrometra de masas en tndem, el espectrmetro puede operar como mecanismo de barrido de iones o en modo monitorizacin de reaccin mltiple (MRM)

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Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

En modo barrido de iones, el espectro de masas se utiliza, junto con el tiempo absoluto o relativo de retencin, para identificar y confirmar la presencia de drogas. Tratndose de una identificacin (que remite a la especificidad y selectividad, y a la exactitud) el tiempo de retencin y el espectro de masa de cada droga que aparezca en la muestra se comparan con los de un patrn analizado en condiciones idnticas, normalmente en la misma tanda o el mismo da. Como alternativa, el espectro se puede comparar con los patrones archivados, utilizndose un sistema de bsqueda de archivos normal. El tiempo de retencin de la presunta droga debe coincidir mucho con el del posible patrn (con un margen de exactitud de 2%) y el espectro debe ser muy parecido visualmente al del patrn o conseguir, en una escala 0-1000, un nivel mnimo de coincidencia en la bsqueda de archivos de 900. Cuando se utiliza en modo SIM/MRM, se eligen para cada analito de inters por lo menos tres iones/transiciones, lo que normalmente incluir los picos de base y los iones moleculares ms otro in de diagnstico. Tratndose de una identificacin, las reas de los picos en los cromatogramas de los iones seleccionados en el tiempo de retencin del analito deben tener una intensidad equivalente a las de un patrn analizado en la misma tanda y en condiciones idnticas, con un margen de error tolerable de 20%, aproximadamente. Criterios similares se pueden aplicar a los cromatogramas de masas generados por computadora a partir de datos obtenidos mediante un barrido total de iones, si este modo de operar ofrece una sensibilidad adecuada y hay un nmero suficiente de espectros de masas (ms de 12) en el pico cromatogrfico para que puedan determinarse reas de picos con una exactitud razonable. Si el espectrmetro de masas opera en modo ionizacin qumica, slo podr haber un in y la identificacin de la droga tendr que hacerse en funcin del tiempo de retencin y del hecho de que ese in est presente.

2.9.4
Requisitos para la validacin Criterios para la aprobacin

Especmenes biolgicos Anlisis cuantitativo

Parmetro

a) CFG/HPLC/Electroforesis capilar

Especificidad/ selectividad

Analizar en las condiciones establecidas para la prueba y anotar los tiempos de retencin de:

y Soluciones estndar de drogas y/o metabolitos del grupo de inters;

Validacin y verificacin de mtodos analticos

y Especmenes en blanco aadidos con las drogas y/o metabolitos del grupo de inters; y

Verificar que no hay un nivel importante de sustancias que interfieren en el tiempo de retencin del analito de inters y del patrn interno. Se considerar un nivel importante el equivalente o superior al lmite de cuantificacin.

y Soluciones estndar de drogas de otros grupos.

Analizar una matriz en blanco obtenida de diez fuentes diferentes por lo menos y verificar la ausencia de sustancias interferentes en los tiempos de retencin de los analitos de inters.

Si una droga u otra sustancia tiene un tiempo de retencin similar a alguno de los analitos considerados, analizar una mezcla de ellos para comprobar si pueden diferenciarse del analito buscado.

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2.9.4
Requisitos para la validacin Criterios para la aprobacin
La prueba de la linealidad debe confirmar que el mtodo es lineal, por ejemplo, el coeficiente de regresin debe ser superior a 0,99 en el rango de trabajo y ste debe ser adecuado al objetivo buscado. Los lmites de deteccin y de cuantificacin deben ser muy inferiores al punto ms bajo de calibracin.

Especmenes biolgicos Anlisis cuantitativo (continuacin)

Parmetro

a)

CFG/HPLC/Electroforesis capilar (continuacin)

Linealidad y rango de trabajo*

Analizar una muestra en blanco que contenga la droga de inters con cinco concentraciones distintas que cubran todo el rango de inters. Las concentraciones deben estar separadas por intervalos iguales.

Debern analizarse seis rplicas de la muestra, por lo menos, por cada nivel de concentracin a fin de identificar y excluir los valores atpicos. Para tal fin pueden utilizarse las pruebas de Grubbs o de Dixon.

Calcular una curva de calibracin utilizando los valores medios de cada concentracin y controlar su linealidad, utilizando por ejemplo el anlisis de regresin lineal para obtener el coeficiente de regresin r2.

En los estudios de la linealidad pueden estimarse parmetros tales como el lmite de deteccin y el lmite de cuantificacin. Esa estimacin puede realizarse multiplicando por tres (si se trata del lmite de deteccin) o por diez (si se trata del lmite de cuantificacin) el coeficiente de la relacin entre la desviacin estndar observada en el nivel inferior de calibracin y la pendiente de la regresin lineal. Todos los resultados deben situarse dentro de la banda 20% del valor esperado en los niveles de concentracin bajos y de 15% en los niveles altos.

Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

Exactitud

Deben analizarse rplicas de especmenes en blanco aadidas con las drogas de inters con tres niveles distintos (alto, medio y bajo) en tres das consecutivos. El nmero de rplicas por nivel de concentracin y da debe ser por lo menos tres. La diferencia entre el resultado medio y el resultado esperado (vase la Parte II F) debe expresarse en porcentaje.

Precisin en condiciones de reproducibilidad La recuperacin debe ser reproducible con un margen de 15%. Nota: como se indica en la Parte II F, el porcentaje de recuperacin absoluta no es fundamental en la medida en que sea reproducible y el lmite bajo de cuantificacin sea adecuado.

Comparar los resultados obtenidos con cada espcimen en blanco aadido en La RSD debe ser inferior al 20% en cada nivel de concentracin cuando se determin la exactitud, y expresar la los niveles de concentracin bajos e variacin en trminos de RSD de cada concentracin. inferior al 15% en los niveles altos.

Validacin y verificacin de mtodos analticos

Recuperacin (cuando se necesite una extraccin)

Preparar especmenes del analito buscado con tres concentraciones distintas en una matriz en blanco. Preparar cinco rplicas de extractos de cada espcimen. Aadir a cada extracto una cuanta conocida de estndar interno. Al mismo tiempo, analizar soluciones estndar del analito buscado que contengan la misma cantidad de patrn interno. (Nota: si se conocen efectos de matriz, debe obtenerse una cantidad equivalente de extractos de una matriz en blanco y aadirse a las soluciones estndar junto con el estndar interno).

La recuperacin se calcula a continuacin comparando el coeficiente entre el rea donde se sita el pico del analito y el rea donde se sita el pico del patrn interno en las muestras de las que se obtuvieron los extractos y en las que no.

Recuperacin % = ([A1/A2]/[A3/A4]) x 100.

Para las muestras de las que se obtuvieron los extractos: A1 = rea del pico del analito A2 = rea del pico del patrn interno.

Para las soluciones estndar: A3 = rea del pico del analito A4 = rea del pico del patrn interno. Como orientacin general, la incertidumbre debe situarse en una banda de 25% del lmite de cuantificacin; 20% del rango medio o alto.
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Incertidumbre

Estimar los errores en cada etapa del proceso analtico utilizando los datos de la validacin, si se dispone de ellos, y calcular la incertidumbre total (vase el apartado 2.6. de la Parte II).

Nota: En la CFG-EM, el espectrmetro de masas puede funcionar como mecanismo de barrido de iones o como mecanismo SIM (seleccin de un in). En la cromatografa lquida espectrometra de masas en tndem, el espectrmetro puede operar como mecanismo de barrido de iones o en modo monitorizacin de reaccin mltiple (MRM).

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Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

En modo barrido de iones, el espectro de las masas se utiliza, junto con el tiempo absoluto o relativo de retencin, para identificar y confirmar la presencia de drogas. Tratndose de una identificacin (que remite a la especificidad y selectividad, y a la exactitud) el tiempo de retencin y el espectro de masa de cada droga que aparezca en la muestra se comparan con los de un patrn analizado en condiciones idnticas, normalmente en la misma tanda o el mismo da. Como alternativa, el espectro se puede comparar con los patrones archivados, utilizndose un sistema de bsqueda de archivos normal. El tiempo de retencin de la presunta droga debe coincidir mucho con el del posible patrn (con un margen de exactitud de 2%) y el espectro debe ser muy parecido visualmente al del patrn o conseguir, en una escala 0-1000, un nivel mnimo de coincidencia en la bsqueda de archivos de 900. Cuando se utiliza en modo SIM/MRM, se eligen para cada analito de inters por lo menos tres iones/transiciones, lo que normalmente incluir los picos de base y los iones moleculares ms otro in de diagnstico. Tratndose de una identificacin, las reas de los picos en los cromatogramas de los iones seleccionados en el tiempo de retencin del analito deben tener una intensidad equivalente a las de un patrn analizado en la misma tanda y en condiciones idnticas, con un margen de error tolerable de 20%, aproximadamente. Criterios similares se pueden aplicar a los cromatogramas de masas generados por computadora a partir de datos obtenidos mediante un barrido total de iones, si este modo de operar ofrece una sensibilidad adecuada y hay un nmero suficiente de espectros de masas (ms de 12) en el pico cromatogrfico para que puedan determinarse reas de picos con una exactitud razonable. Si el espectrmetro de masas opera en modo ionizacin qumica, slo podr haber un in y la identificacin de la droga tendr que hacerse en funcin del tiempo de retencin y del hecho de que ese in est presente. A efectos de cuantificacin, uno de los iones/transiciones que se elija se considerar in/ transicin de cuantificacin y los dems servirn como iones de control para confirmar la identidad de la presunta droga. Los cromatogramas obtenidos de los iones/transiciones de cuantificacin se utilizan para la validacin de mtodos de manera semejante a los obtenidos con otros detectores CFG como el detector de ionizacin de llama.

3.

Calibracin/Verificacin del funcionamiento de instrumentos y equipo

3.1 Introduccin
El funcionamiento de los instrumentos y el equipo de laboratorio pueden alterarse con el paso del tiempo, ya sea a corto plazo, debido a las fluctuaciones del entorno, o a largo plazo, debido al envejecimiento de los componentes mecnicos, pticos o electrnicos. Los pequeos cambios pueden pasar desapercibidos e inducir a error en los resultados obtenidos. Adems, el funcionamiento puede resultar afectado por reparaciones o por la sustitucin de mdulos o componentes. Tambin es posible que un equipo nuevo no haya sido controlado o sometido a prueba antes de la entrega para establecer si cumple las especificaciones. En un laboratorio que mantenga un sistema de gestin de la calidad, todos estos aspectos del trabajo analtico se controlan, y se controlan tambin los posibles errores instrumentales por medio de unos procedimientos peridicos de mantenimiento y calibracin preventivos. La forma en que se controla el funcionamiento de los instrumentos y el equipo (para referirse a este proceso se utilizan los trminos verificacin [4] o calificacin [16] del funcionamiento), y la frecuencia de las calibraciones (intervalo), deben estar estipuladas en los procedimientos normalizados de trabajo. La verificacin del funcionamiento debe basarse en pruebas que no se ajusten especficamente a un mtodo concreto y en las que se utilicen calibradores y patrones rastreables, permitiendo as que el equipo pueda ser comparado entre laboratorios. La verificacin del funcionamiento no se relaciona expresamente ni con mtodos de criba inicial ni con mtodos de confirmacin. La calibracin de los instrumentos y el equipo (por ejemplo, calibracin de la longitud de onda de un espectrmetro infrarrojo, calibracin de masas de un espectrmetro con un sistema acoplado de cromatografa en fase gaseosa) es independiente del tipo de muestra que se utilice. Existen dos enfoques tericos del proceso de calibracin: y y El enfoque tradicional, segn el cual han de calibrarse todos los instrumentos y el equipo, y El enfoque que parte del supuesto de que slo deben calibrarse los instrumentos que realicen mediciones fsicas y cuyos resultados sean una medicin directa de un parmetro fsico rastreable. Por ejemplo, pueden calibrarse balanzas, espectrmetros, termmetros, centrifugadoras y cronmetros porque existen unos estndares
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Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

rastreables que determinan el nivel de incertidumbre de las mediciones. En todos los dems casos, en el laboratorio slo podr hacerse una verificacin del funcionamiento del equipo/instrumentos, pues sin una estimacin de la incertidumbre no puede hacerse una calibracin. El laboratorio tiene que decidir qu enfoque prefiere.

3.2

Requisitos metrolgicos

El laboratorio debe disponer de todos los artculos necesarios para medir muestras y del equipo de anlisis que se necesite para realizar pruebas y calibraciones correctas. Antes de su utilizacin, debe comprobarse y calibrarse el equipo para asegurarse de que cumple los requisitos de laboratorio y las especificaciones estndar. El laboratorio debe disponer de un programa y unos procedimientos establecidos de calibracin de su equipo [17]. Algunos proveedores de instrumentos y equipo pueden encargarse de certificar la calibracin a travs de un contrato ordinario de mantenimiento. Las exigencias actuales en materia de garanta de la calidad y buenas prcticas de laboratorio obligan a anotar en el cuaderno de cada instrumento todos los controles y procedimientos de calibracin que se lleven a cabo y las medidas correctivas adoptadas si un control indica que un instrumento no est bien calibrado, de acuerdo con en el siguiente cuadro.

Datos que deben anotarse en el cuaderno de mantenimiento del instrumento [4]


Denominacin del equipo Nombre del fabricante, modelo y/o tipo Nmero de serie Fecha de recepcin del equipo en el laboratorio Condicin en que se recibi (nuevo, usado) Informacin detallada sobre los controles del cumplimiento de las especificaciones pertinentes de calibracin o estndares analticos Fecha en que entr en servicio el equipo en el laboratorio Ubicacin actual en el laboratorio, cuando proceda Copia de las instrucciones de manejo del fabricante Definicin de los criterios que se utilizarn para juzgar el buen funcionamiento en consonancia con los requisitos para realizar el tipo de anlisis que haya de hacerse con ese instrumento Datos detallados sobre las actividades de mantenimiento realizadas y del posterior control del funcionamiento Historial de los daos, problemas de funcionamiento, modificaciones o reparaciones de los instrumentos y de los posteriores controles del funcionamiento Frecuencia de los controles del cumplimiento de los criterios de buen funcionamiento

Calibracin/Verificacin del funcionamiento de instrumentos y equipo

41

3.3 Procedimientos de calibracin/verificacin del funcionamiento de instrumentos y equipo


Los procedimientos de calibracin de aparatos utilizados en qumica analtica frecuentemente son descritos por el propio fabricante, que aporta adems informacin sobre las actividades normales de mantenimiento y la frecuencia con que deben realizarse. A continuacin se ofrecen directrices para establecer procedimientos estndar de calibracin de instrumentos y equipo de uso comn, y aplicar a stos dichos procedimientos [13, 15].

Pipetas automticas
El mantenimiento ordinario exige que, aparte de una calibracin, se realicen controles peridicos de las lneas de pipetas, desarmndolas y limpindolas en caso necesario. Parmetro a calibrar: volumen de la descarga. Mtodo: si se trata de pipetas de volumen fijo, se pipetea agua destilada en un recipiente de peso conocido para controlar el volumen efectivamente librado. Se consigue una mayor exactitud si la balanza utilizada para controlar el peso viene acompaada de una cmara de pesaje que pueda saturarse con vapor de agua, que con frecuencia se libra como accesorio con las balanzas electrnicas modernas. Las pipetas de volumen variable deben calibrarse al menos en cuatro niveles: el nivel mximo, el nivel mnimo fijado por el encargado de las pipetas automticas y dos o ms niveles intermedios, uno de los cuales debe ser inferior al punto medio de la escala. Si una pipeta de volumen variable se utiliza nicamente para dispensar un volumen fijo slo podr ser calibrada para ese volumen fijo. Los ajustes del mecanismo de fijacin del volumen deben hacerse, en caso necesario, siguiendo las instrucciones del fabricante. Intervalo de calibracin: el ritmo de deterioro de la calibracin debe determinarse haciendo controles frecuentes (diarios) del calibrado. El intervalo de las calibraciones podr alargarse entonces para adaptarlo a las condiciones del laboratorio (normalmente el intervalo ser de tres meses).

Aparatos de medicin del punto de fusin


Parmetro a calibrar: Exactitud del termmetro. Mtodo: Los puntos de fusin de las sustancias de referencia se miden por lo menos dos veces. Intervalo de calibracin: Cada seis meses.

Medidores del pH
Parmetro a calibrar: Exactitud y linealidad del pH. Mtodo: Los indicadores preparados comercialmente o los indicadores estndar (que pueden buscarse en cualquier farmacopea) han de utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Intervalo de calibracin: Diariamente cuando est en uso.

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Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

Hornos y calefactores
Parmetro a calibrar: Temperatura. Mtodo: El control se realiza con un pirmetro porttil o un termmetro de precisin, que deben situarse lo ms cerca posible del sensor de temperatura del horno. Intervalo de calibracin: Anualmente, y despus de cada reparacin que pueda influir en el funcionamiento del horno/calefactor.

Baos de agua
Parmetro a calibrar: Temperatura. Mtodo: Termmetro de precisin/de referencia. Intervalo de calibracin:Trimestralmente, cuando se sustituya el termmetro del bao de agua o cuando ste no haya sido utilizado durante un tiempo prolongado (semanas o meses).

Balanzas
Antes de su utilizacin, las balanzas deben ser comprobadas para asegurarse de que estn limpias y equilibradas en la superficie en que se encuentren. Es fundamental que cada ao haga una visita de mantenimiento un ingeniero calificado. Las balanzas utilizadas para realizar mediciones fundamentales (es decir, cuando la suma de las incertidumbres que genere el proceso de pesaje represente un factor importante de la exactitud del resultado final o, en otros trminos, cuando puedan significar un 10% del error total) deben disponer como mnimo de un certificado de calibracin. Estos certificados deben ser emitidos por un organismo acreditado externo o por un personal de laboratorio adecuadamente capacitado. Los certificados deben ser renovados anualmente. Parmetro a calibrar: exactitud. Mtodo: Los pesos de referencia se utilizan de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El usuario puede decidir, cuando as lo exijan los resultados requeridos, utilizar unos patrones de peso con un nivel de exigencia mayor que los preparados por el fabricante. Una secuencia tpica sera controlar el punto cero de la balanza con el platillo vaco y a continuacin poner en ste el peso de referencia y ajustar la lectura para que refleje el valor correcto. Obsrvese que los patrones de peso deben manejarse con gran cuidado utilizndose pinzas con las puntas lisas, ya que las puntas rugosas pueden daarlos. Las balanzas electrnicas modernas frecuentemente disponen de sistemas internos de calibracin del peso y el control se realiza de forma automtica de acuerdo con una secuencia prefijada por el fabricante o, en su caso, por el usuario. Intervalo de calibracin: Las microbalanzas utilizadas para preparar patrones de referencia deben ser controladas diariamente o, si no se utilizan diariamente, cada vez que lo sean. Las balanzas de mesa para reactivos y para medir pesos menos importantes pueden ser controladas con menor frecuencia, por ejemplo, cada semana o mes, pero es importante comprobar la rapidez con que se producen los desajustes a fin de determinar cul es el intervalo de calibracin correcto. Tambin deben realizarse controles de la calibracin cada vez que se mueva la balanza de sitio.

Calibracin/Verificacin del funcionamiento de instrumentos y equipo

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Refrigeradores y congeladores
Parmetro a calibrar: Temperatura. Mtodo: Termmetro de precisin. La temperatura debe mantenerse dentro de una banda mxima de 5 grados de la temperatura requerida. Intervalo de calibracin: Continuamente.

Instrumentos para mtodos inmunolgicos


Existen muchos mtodos inmunolgicos distintos y la mayora depende de una comparacin directa con un patrn de calibracin incluido en cada tanda de muestras a analizar. Tiene especial importancia el umbral de concentracin del analito utilizado, por lo que el analista debe conocer cul es el umbral de concentracin establecido por el fabricante del juego de inmunoensayo que utilice. Los procedimientos de calibracin a seguir son los establecidos por el fabricante. Como excepcin notable a este procedimiento general cabe sealar los juegos de inmunoensayo desechables (a veces denominados pruebas de palito), que a veces tienen mecanismos de control interno, pero no siempre. En principio, deben reflejar un resultado positivo o negativo si la concentracin del analito buscado es superior o inferior al umbral. Cabe sealar que con frecuencia interviene un cierto grado de interpretacin por parte de quien realiza la prueba y que, como siempre, un operador capacitado y con experiencia obtendr resultados ms exactos y coherentes que otro con menos experiencia.

Espectrofotmetros de radiacin ultravioleta-visible


Parmetro a calibrar: Exactitud de la longitud de onda y repetibilidad, exactitud fotomtrica. Mtodo: La absorcin de las longitudes de onda de las radiaciones UV se controla con filtros de holmio y didimio, que deben ser suministrados por el fabricante. La exactitud de la longitud de onda y la repetibilidad se controlan en toda la gama de radiacin UV-visible. Han de obtenerse por lo menos dos espectros. La desviacin mxima ha de ser 1,0 nm. Intervalo de calibracin: Anualmente.

Espectrmetros infrarrojos
Los procedimientos que se indican a continuacin afectan slo a los espectrmetros independientes. Los instrumentos combinados, como los espectrmetros CFG/FT-IR se deben calibrar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Parmetro a calibrar: Resolucin.

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Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

Mtodo: Se comprueba la gama total del instrumento con una pelcula de poliestireno. Debe diferenciarse el pico de absorcin de 3095 nm del de 3080 nm y la absorcin de 3020 nm debe diferenciarse de la de 3015 nm. Intervalo de calibracin: Trimestralmente. Parmetro a calibrar: Exactitud de la longitud de onda. Mtodo: Se escanea una pelcula de poliestireno y se controla la exactitud de los picos en 2852, 1602 y 1028 nm [18]. La exactitud debe ser de 3-5 nm en el rango 4000-2000 nm y de 1,5-2,5 nm en el rango inferior a 2000 nm. Intervalo de calibracin: Trimestralmente.

Cromatgrafos de gases
Entre las operaciones ordinarias de mantenimiento cabe mencionar los controles del septum, el sistema de inyeccin, las presiones del gas y los filtros internos (por ejemplo, filtros de oxgeno, impurezas, humedad e hidrocarburos), el nivel de la seal de base y el ruido de fondo. Dependiendo del grado de utilizacin del instrumento, puede ser conveniente establecer un programa de mantenimiento ordinario que suponga un cambio semanal del septum y el mezclador del inyector (con mayor frecuencia si se analiza un gran nmero de muestras). Parmetro a calibrar: Temperatura del horno. Mtodo: Controlar con un pirmetro porttil de referencia o un termmetro de precisin, que debe situarse lo ms cerca posible del sensor de temperatura del horno. Intervalo de calibracin: Anualmente. Parmetros a verificar: Calidad de la columna (eficiencia, resolucin, forma del pico, tiempos de retencin). Mtodo: Se analiza un grupo de estndares de uso ordinario. La precisin de los tiempos de retencin puede medirse inyectando el estndar tres veces o ms. Tambin pueden medirse las reas de los picos (vase ms adelante integradores). Es til dibujar un diagrama de control de los parmetros, como tiempos/ndices de retencin. Intervalo de la verificacin: Mensualmente. Parmetros a verificar: Sensibilidad del detector, seal de base y ruido de fondo. Mtodo: Se analiza un grupo de patrones de uso ordinario y se compara con resultados anteriores. Intervalo de verificacin: Mensualmente.

Calibracin/Verificacin del funcionamiento de instrumentos y equipo

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Parmetro a calibrar: Capacidad de lectura del detector de gases. Mtodo: Se utiliza un medidor de flujos de pompas de jabn o un medidor electrnico calibrado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Intervalo de calibracin: Cuando se limpie o repare el detector, o cuando se cambie la columna analtica o se deteriore el funcionamiento. La dificultad de encendido de un detector de ionizacin de llama indica muchas veces que la velocidad de flujo es incorrecta.

Cromatgrafos lquidos de alto rendimiento


Los trabajos ordinarios de mantenimiento de los sistemas de cromatografa de lquidos de alto rendimiento (HPLC) incluye el recambio peridico de los filtros, internos y en lnea, y de las columnas de almacenaje, lo que normalmente debe hacerse cuando la presin inversa supera el lmite aceptable (es decir, se sita por encima del nivel mximo de presin dentro de la columna). Si los mtodos se transfieren de un instrumento a otro puede ser necesario comprobar la exactitud de algunos parmetros como la velocidad de flujo, la temperatura de la columna y la composicin del eluyente, que influyen en los tiempos absolutos y relativos de retencin. Parmetro a calibrar: Exactitud del flujo. Mtodo: Los efluyentes de la columna se recogen en una probeta o frasco volumtrico durante el tiempo adecuado. Intervalo de calibracin: La velocidad absoluta del flujo con frecuencia es menos importante que su variacin durante una tanda de anlisis, pero debe ser controlada si se utiliza un mtodo estndar, oficial o recomendado. Parmetro a calibrar: Repetibilidad del flujo y precisin volumtrica del inyector. Mtodo: Se inyecta tres veces, o ms, un grupo de estndares de uso ordinario y se mide la precisin de los tiempos de retencin y las reas de los picos. Intervalo de calibracin: Mensualmente, o bien diariamente si esta prueba est integrada en un sistema de comprobacin diaria del buen estado de los aparatos. Parmetro a calibrar: Coeficiente seal del detector/ruido. Mtodo: Se analiza un grupo de estndares utilizados normalmente y se comparan los resultados con los de anlisis anteriores. El ruido de base se mide en intervalos de 0,5 a 1 minutos y se calcula el promedio. El ruido se calcula con un programa informtico (si lo suministra el fabricante) o grficamente, definiendo dos lneas horizontales que abarquen todas las variaciones observadas y midiendo la distancia vertical entre ellas. El nivel del ruido puede medirse mientras fluyen los eluyentes y sin ese flujo, para definir as la contribucin del sistema de alimentacin de eluyentes al ruido. Intervalo de calibracin: Mensualmente.

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Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

Parmetro a calibrar: Exactitud del detector de longitudes de onda (detectores de UV-visible y de fluorescencia). Mtodo: La absorcin de las longitudes de onda UV se comprueba con un filtro de xido de holmio, suministrado por el fabricante (y rastreable hasta el patrn primario) que tiene un mximo de absorcin de longitud de onda de 361 nm que es caracterstico. La exactitud de la longitud de onda y la reproducibilidad se controlan en todo el rango de radiacin UV-visible. La desviacin mxima (admisible) es de 1,0 nm. La emisin de longitudes de onda de la fluorescencia normalmente se controla utilizando un patrn, por ejemplo, sulfato de quinina, que tiene unos picos de excitacin de 255 y 355 nm y un pico de emisin de 455 nm. Intervalo de calibracin: Anualmente.

Espectrmetros de masas
Los espectrmetros de masas se regulan y calibran de forma semejante tanto si son un instrumento independiente o estn combinados con interfaces cromatogrficas (GC-MS y LC-MS y sus derivaciones con mltiples sectores). Existen diferencias entre los instrumentos cuadrupolares y los de sector magntico, en especial si estos ltimos son capaces de ofrecer una alta resolucin. La mayora de los instrumentos de laboratorio de este tipo estn controlados directamente por un sistema informtico y la regulacin y calibracin se realizan automticamente. El sistema informtico genera un mensaje de advertencia cuando el instrumento deja de cumplir los requisitos de funcionamiento prefijados, y muchas veces ordena directamente una intervencin del operador, por ejemplo, limpiar la fuente. Parmetros a calibrar: Regulacin de la fuente y calibracin de las masas. Mtodo: Se introduce en el espectrmetro un compuesto de calibracin, como el perfluorokeroseno (PFK) o la heptacosafluoroperbutilamina (perfluoroperbutila-mina) por la rendija correspondiente. La fuente se regula por medio de una seleccin de fragmentos de iones para obtener una sensibilidad y un rea de los picos ptimas, y obtener unas relaciones masa/ carga de los picos (por ejemplo, m/z 69, 219 y 264, y 502, en el espectro de la perfluoroperbutilamina), que normalmente vienen determinados por el fabricante. Los espectros se almacenan y comparan con el espectro de referencia en lo que respecta a la asignacin de masas y la intensidad relativa de los picos. Intervalo de calibracin: Diariamente o inmediatamente antes de su utilizacin.

Integradores cromatogrficos y sistemas de datos


La validacin de los sistemas y los programas informticos es un trmite de especial importancia que debe estar a cargo del fabricante. Sin embargo, sigue siendo responsabilidad del usuario asegurarse de que los programas informticos han sido validados. La validacin formal de los programas informticos puede ser realizada por el proveedor en nombre del usuario, pero este ltimo deber ensayarlos para que se produzca la aceptacin formal. El ensayo permite establecer si se satisfacen los criterios establecidos para los programas informticos. Los fabricantes incluyen actualmente de forma rutinaria en sus productos funciones de prueba y diagnstico para validar los sistemas.

Calibracin/Verificacin del funcionamiento de instrumentos y equipo

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Parmetro a calibrar: Exactitud de las reas integradas de los picos. Mtodo: O bien se utiliza la funcin de prueba integrada en el cromatgrafo o bien se realiza un anlisis de un patrn ordinario y se compara con anlisis anteriores. Intervalo de calibracin: Las comprobaciones ordinarias se realizan por lo general diariamente. Las pruebas de funcionamiento del material informtico pueden realizarse a intervalos ms amplios, por ejemplo, mensualmente.

4.

Modelo de procedimiento normalizado de trabajo para la validacin de un nuevo mtodo analtico

Para validar un mtodo se necesita un procedimiento normalizado de trabajo que est redactado con claridad. Se han publicado varios ejemplos de procedimientos normalizados de trabajo para mtodos cromatogrficos [19]. El modelo que figura a continuacin no es aplicable universalmente ya que no es posible preparar un solo protocolo o procedimiento normalizado de trabajo que abarque todas las situaciones. Las directrices que a continuacin se ofrecen abarcan las situaciones ms comunes.
Nombre del laboratorio Revisin Pgina

1/x
Autor Responsable del examen Responsable de la aprobacin Revisin anterior Fecha

Archivo

Cdigo

Ttulo del procedimiento normalizado de trabajo Por ejemplo, validacin de mtodos de cromatografa en fase gaseosa. Objetivo del procedimiento normalizado de trabajo En esta seccin debe consignarse una breve descripcin del mtodo a validar, con inclusin de la planificacin, el funcionamiento y la documentacin que correspondan. Realizacin de la validacin Indquense detalladamente las medidas previstas para determinar el cumplimiento de los parmetros de la validacin.

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Puede adoptar la forma de un plan de trabajo, un cuadro, etc., como el siguiente:


Linealidad, exactitud 36-48

Tanda

36 a 48 muestras (6 niveles de concentracin, 6-8 anlisis de rplicas en cada nivel, y adems 20 especmenes

Total

Este cuadro corresponde a un estudio previo a la validacin para determinar la utilidad del mtodo. Muestras de validacin

Tanda Exactitud 3 3 3 3 3 139-175 muestras 8 12 3 3 3 3 3 Recuperacin Estabilidad Exactitud

Patrones de calibracin Nivel intermedio

Lmite inferior de cuantificacin

Lmite superior de cuantificacin Selectividad 12 Muestras totales 27-29 27-29 23-25 15-17 15-17

6 niveles + 1 blanco

Exactitud

6-8 rplicas

6-8 rplicas

6-8 rplicas

6-8 rplicas

6-8 rplicas

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Total

Modelo de procedimiento normalizado de trabajo para la validacin de un nuevo mtodo analtico

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Clculo de los resultados e interpretacin Describir los procedimientos para calcular el cumplimiento de los parmetros a partir de los resultados de los experimentos y de los criterios de aceptacin Vase el prrafo 2.9. de este manual. Informacin de los resultados Informar sobre los resultados de la validacin. Debe describirse el mtodo, deben documentarse los resultados de cada parmetro de validacin y deben extraerse conclusiones acerca de si el mtodo permite cumplir los objetivos. Archivo de los datos del estudio de validacin El informe de la validacin (firmado, fechado y autorizado) debe ser conservado, junto con el plan de validacin y todos los datos experimentales, en un almacn seguro, y ser fcilmente recuperables. Referencias Se trata de las referencias propias de este procedimiento normalizado de trabajo, por ejemplo, las referencias tericas del mtodo de validacin.

Referencias
1. Publicaciones de la UNODC: Brochure on the International Quality Assurance Programme y Protocolo de los ejercicios internacionales de colaboracin. Pueden descargarse en ingls en el sitio web de la UNODC: http://www.unodc.org/unodc/en/scientists/publications.html. 2. D.R. Jenke, Chromatographic Method Validation: A review of Current Practices and Procedures. I. General Concepts and Guidelines, J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., vol. 19 (1996), pgs. 719 a 736. 3. Oficina de las Naciones Unidas contra la Droga y el Delito, Orientaciones para la implantacin de un sistema de gestin de la calidad en los laboratorios de anlisis de drogas, ST/NAR/37, 2009. 4. General criteria of competence for calibration and testing laboratories, UKAS, Teddington, Reino Unido. 5. Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs, Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs (SWGDRUG) Recommendations, 2008. 6. Organizacin Internacional de Normalizacin/Comisin Electrotcnica Internacional, ISO/IEC 17025:2005 General Requirements for Competence of Testing and Calibration Laboratories. 7. E. Prichard (ed.), Trace Analysis: A structural approach to obtaining reliable results. (Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1996), pgs. 32 a 39. 8. Eurachem/Cooperation on International Traceability in Analytical Chemistry (CITAC), EURACHEM/CITAC Guide: Expression of uncertainty in qualitative testing, 2003. 9. Eurachem/Cooperation on International Traceability in Analytical Chemistry (CITAC), EURACHEM/CITAC Guide: Measurement uncertainty arising from sampling: a guide to methods and approaches, 2007. 10. Eurachem/Cooperation on International Traceability in Analytical Chemistry (CITAC), EURACHEM/CITAC Guide CG4: Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, 2nd Edition, 2000. 11. SWGDRUG, Quality Assurance/General Practices Recommendations, 2008. 12. A.G. Rowley, Evaluating Uncertainty for Laboratories, A Practical Handbook (versin 1.1, 2001).
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13. Eurachem/Cooperation on International Traceability in Analytical Chemistry (CITAC), EURACHEM/CITAC Guide: Guide to Quality in Analytical Chemistry, 2002. 14. L. Huber, Good Laboratory Practice: A primer for HPLC, CE and UV-visible spectroscopy (Hewlett-Packard Co., publicacin nm. 12-5091-6259E, 1993). 15. Organizacin Internacional de Normalizacin, ISO 9000:2000 Quality management systems Fundamentals and vocabulary. 16. Organizacin Internacional de Normalizacin, ISO 9001:2008. Quality management systems Requirements. 17. Organizacin Internacional de Normalizacin/Comisin Electrotcnica Internacional ISO/IEC 17025:2005 General Requirements for Competence of Testing and Calibration Laboratories, prrafos 5.5 y 5.6. 18. Organizacin Mundial de la Salud, Farmacopea internacional, tercera edicin. Volumen 1: Mtodos generales de anlisis. 19. David M. Bliesner, Validating Chromatographic Methods, (John Wiley & Sons, 2006, pg. 72).

Puede obtenerse ms informacin sobre los documentos de referencia en las siguientes direcciones (al 16 de junio de 2009): UNODC SWGDRUG ISO EURACHEM http://www.unodc.org/ http://www.swgdrug.org/ http://www.iso.org/iso/home.htm http://www.eurachem.org/

ANEXO

Glosario de trminos utilizados en el manual de validacin y calibracin

Las definiciones estn tomadas del Glosario de la UNODC (ST/NAR/26) al que se han aadido trminos o definiciones (sealadas con un asterisco). Si no se encuentran al final, las referencias de las fuentes de las definiciones pueden encontrarse en el Glosario antes citado. anlisis replicado: Realizacin de mltiples anlisis de distintas partes de un material de ensayo utilizando el mismo mtodo en las mismas condiciones, por ejemplo, el mismo operador, los mismos aparatos, el mismo laboratorio. analito (o analito buscado): Sustancia que debe identificarse o medirse. analito sustitutivo: Sustancia bien caracterizada que se toma como representativa del analito [3]. bondad de ajuste: Grado en que un modelo, una distribucin terica o una ecuacin se ajusta a los datos reales. calibracin: Serie de operaciones que sirven para determinar, en condiciones especificadas, la relacin existente entre los valores indicados por un instrumento o un sistema de medicin, o los valores de una medida real, y los valores conocidos del mensurando. calibrador: Analito puro en un disolvente o matriz apropiado que se utiliza para preparar la curva de calibracin. Los calibradores tienen una composicin semejante a los controles de calidad pero se han de preparar de forma independiente, ya que los segundos se utilizan para comprobar la exactitud de la curva de calibracin. calificacin del funcionamiento*: Vase verificacin del funcionamiento. caractersticas de funcionamiento*: Aspectos fundamentales de un mtodo analtico que se evalan a los efectos de desarrollarlo y validarlo, entre ellos, exactitud (sesgo), linealidad, lmite de deteccin, lmite de cuantificacin, rango, recuperacin, repetibilidad, reproducibilidad, robustez y especificidad (selectividad). certificacin: Procedimiento por el que un organismo de certificacin reconoce oficialmente que un organismo, persona o producto cumple determinadas especificaciones. certificado de mtodo autorizado*: Documento que certifica que un mtodo analtico ha sido validado para sus fines previstos en el laboratorio y ha sido autorizado a tal fin por el director del mismo, quien deber firmar el certificado.
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cocromatografa*: Procedimiento que consiste en dividir la solucin purificada que ser analizada antes de realizar la cromatografa en dos partes y: - una de ellas es cromatografiada directamente; - la otra parte es aadida con el analito que ha de ser identificado en una cantidad conocida y esta mezcla de la solucin a analizar y el analito se cromatografan. La cantidad de analito ha de ser similar a la cantidad estimada de analito en la solucin analizada [5]. coeficiente de correlacin: Nmero que indica el grado de relacin recproca de dos variables. Los coeficientes de correlacin varan entre 0 (sin correlacin) y -1 o +1 (correlacin perfecta). coeficiente de variacin (o desviacin estndar relativa): Medida utilizada para comparar la dispersin o variacin en grupos de mediciones. Es el cociente entre la desviacin estndar y la media, multiplicada por 100 para expresarla en porcentaje del promedio. comparaciones de ensayos entre laboratorios (comparaciones de ensayos interlaboratorios): Vase estudios en colaboracin. concentracin: Cantidad de una sustancia, expresada en unidades de masa o molares, que hay en una unidad de volumen de fluido. concentracin crtica (o umbral): Concentracin de una droga en un espcimen que se utiliza para determinar si se debe considerar ese espcimen positivo o negativo. En algunas circunstancias se recomienda que la concentracin crtica sea igual al lmite de deteccin. Vase umbral. contaminacin*: Aumento del analito en el proceso de extraccin, en lugar de producirse las prdidas que normalmente se registran cuando se estima la recuperacin. control de calidad: Sistema general de procedimientos y procesos de laboratorio encaminados a controlar la calidad de los resultados analticos de un laboratorio. controles: Especmenes utilizados para determinar la validez de la curva de calibracin, es decir, la linealidad y estabilidad de un ensayo cuantitativo o de una determinacin cuantitativa a lo largo del tiempo. Los controles se preparan a partir de material de referencia (separadamente de los calibradores, es decir, se pesan o miden por separado), que se adquiere o se obtiene de una reserva de especmenes o muestras anteriormente analizados. Siempre que sea posible, los controles debern prepararse en las mismas matrices que los especmenes o muestras y que los calibradores. correccin de la recuperacin*: La recuperacin de analitos frecuentemente es inferior al 100%. Si no se hace una adicin estndar (que compensa automticamente la recuperacin incompleta) los resultados del anlisis han de ser multiplicados por un factor de correccin con objeto de obtener los valores que se hubieran registrado si la recuperacin fuera del 100%. Esto implica que la recuperacin del mtodo sea conocida, lo que ser cierto si el mtodo ha sido validado ya que la recuperacin es una de las caractersticas funcionales que se mide. criterios de aceptacin: Condiciones que han de cumplirse para que una operacin, proceso o artculo, como un componente del equipo, se considere satisfactorio o que se ha completado de forma satisfactoria. A continuacin se ofrecen ejemplos concretos.

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criterios de aceptacin (para programas informticos)*: Criterios que ha de cumplir un producto informtico para completar con xito la fase de prueba o satisfacer los requisitos de la entrega. criterios de aceptacin de especmenes o muestras: Procedimientos para aceptar o rechazar los especmenes recibidos en el laboratorio de anlisis. Esos procedimientos se centran en la evaluacin de la idoneidad de la cadena de custodia. curva de calibracin: Relacin existente entre la respuesta de seales del instrumento y diversas concentraciones del analito en un disolvente o matriz apropiado. desviacin estndar (o tpica): Dato estadstico que muestra la extensin o dispersin de las puntuaciones en una distribucin de stas. Se calcula determinando la raz cuadrada de la varianza. Se aplica a toda clase de mediciones repetidas, por ejemplo, entre lotes, dentro de un mismo lote, en la repetibilidad y en la reproducibilidad. diagrama de control: Grfico de los resultados de ensayos con respecto a un perodo de tiempo o a una secuencia de mediciones en el que se trazan los lmites dentro de los cuales se prev que estarn los resultados si el plan analtico est en un estado de control estadstico [6]. director de laboratorio*: Persona calificada que asume la responsabilidad profesional, organizativa, educativa y administrativa de los anlisis de drogas del laboratorio. distribucin de probabilidad terica: El nmero de veces que cabe esperar obtener un nmero determinado de aciertos en un gran nmero de ensayos. Distribuciones de probabilidad terica importantes son la normal, la t, la de x2 y la F. efecto de matriz*: Alteracin o interferencia directa o indirecta en la respuesta de un instrumento, como un espectrmetro LC-MS/MS, debida a la presencia de analitos no buscados (en el anlisis) o de otras sustancias interferentes en las muestras. ensayo (o prueba): Operacin tcnica que consiste en determinar una o ms caractersticas o comportamientos de un producto, material, equipo, organismo, fenmeno fsico, proceso o servicio dado, de conformidad con un procedimiento especificado. equipo*: En general, los aparatos necesarios para una operacin [7] Ms en concreto, el equipo fsico necesario para realizar una medicin analtica, por ejemplo, un cromatgrafo en fase gaseosa. error: Accin considerada incorrecta o equivocada. error aleatorio: Componente del error total de una medicin que vara de forma impredecible. Ello hace que los distintos resultados queden a ambos lados del valor promedio. error sistemtico: Componente del error total de una medicin que vara de forma constante. Ello hace que todos los resultados sean errneos en el mismo sentido. error total: Suma de errores aleatorios y sistemticos. especificacin: Exposicin de requisitos, normalmente por escrito.

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especificidad: a) Vase selectividad. b) Porcentaje de resultados negativos acertados que se obtiene cuando se analizan muestras que se sabe que no contienen el analito. c) Capacidad de un mtodo para medir nicamente lo que se aade a las muestras. Por especificidad se entiende la capacidad de identificar inequvocamente el analito en presencia de otros previsibles componentes. Normalmente se tratar de impurezas, degradantes, matriz, etc. espcimen: Todo material sometido a examen, estudio o anlisis. estabilidad (de una muestra durante el anlisis): Resistencia a la descomposicin o a otros cambios qumicos, o a la desintegracin fsica. estndar (patrn) de referencia: Estndar, generalmente de la mejor calidad disponible en un determinado lugar, del que se derivan las mediciones hechas en ese lugar. estndar (patrn) del analito*: Sustancia claramente definida en su mayor nivel de pureza disponible que se utiliza como referencia en el anlisis. estndar (patrn) interno: Adicin de una cantidad fija de una sustancia conocida que no se encuentra presente como constitutiva del espcimen, a fin de identificar o cuantificar otros componentes. Las caractersticas fisicoqumicas del estndar interno deben aproximarse lo ms posible a las del analito. Compuesto de laboratorio (por ejemplo, un compuesto anlogo de estructura similar y estable) que se aade a los patrones de calibracin y las muestras con una concentracin conocida y constante para facilitar la cuantificacin del analito buscado. estndar (patrn) nacional*: Estndar o patrn reconocido mediante una decisin nacional oficial como base para fijar el valor, en un pas, de todos los dems estndares o patrones de la cantidad de que se trate. estndar (patrn) primario*: Estndar o patrn que tiene las mejores calidades metrolgicas en un campo determinado. estndar (patrn) rastreable*: Estndar o patrn de referencia que tiene tambin la propiedad de ser rastreable. Normalmente tendr un certificado de anlisis que ofrecer informacin detallada sobre los estndares nacionales o internacionales utilizados para determinar su composicin. estudio de la interferencia*: Estudio realizado para comprobar la selectividad (o especificidad) de un mtodo, que se realiza aadiendo materiales que podran encontrarse en los especmenes y que se sospecha que estn causando interferencias. estudios en colaboracin (o comparaciones de ensayos entre laboratorios): Organizacin, realizacin y evaluacin de ensayos de elementos o materiales idnticos o similares por dos o ms laboratorios diferentes segn condiciones predeterminadas. Su finalidad principal es la convalidacin de mtodos analticos o la formulacin de mtodos de referencia. exactitud (sesgo, veracidad): Capacidad para obtener un resultado verdadero [1]. En los ensayos cuantitativos, la exactitud expresa el grado de acuerdo entre el valor verdadero y el

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valor obtenido despus de repetir el ensayo cierto nmero de veces. La exactitud se ve afectada por los errores sistemticos y los errores aleatorios. exactitud (de un instrumento de medicin): Capacidad de un instrumento de medicin de dar respuestas prximas al valor verdadero. Nota: en este contexto la exactitud es un concepto cualitativo [2]. falso negativo: Resultado de un ensayo que indica que no hay droga ni metabolito presentes cuando, en realidad, esa droga o metabolito est presente en cantidad superior al umbral o concentracin crtica designada. fiabilidad: Grado en que un experimento, ensayo o procedimiento de medicin arroja resultados exactos en ensayos repetidos. garanta de calidad: Todas las actividades planificadas y sistemticas que se llevan a cabo en el marco de un sistema de garanta de la calidad a fin de garantizar adecuadamente que un laboratorio cumplir los requisitos de calidad. Parte de la gestin de la calidad se centra en garantizar que se cumplirn los requisitos de calidad. grado de confianza (o coeficiente de confianza): Medida de probabilidad relacionada con un intervalo de confianza, que expresa la probabilidad de la verdad de una afirmacin en el sentido de que el intervalo incluir el valor del parmetro. incertidumbre: Parmetro asociado con el resultado de una medicin que caracteriza la dispersin de los valores que puede atribuirse razonablemente al analito. Estimacin que acompaa a los resultados de un anlisis y que define el rango de valores en el que se afirma que se sita el valor verdadero. instrumento (instrumentacin, aparato de medicin)*: Dispositivo para hacer una medicin, por s solo o en combinacin con otro equipo. intervalo de calibracin*: Frecuencia con que se comprueba el funcionamiento especfico de cada instrumento o componente del equipo segn el programa de mantenimiento preventivo de laboratorio. intervalo de confianza: Serie de valores que comprende el valor verdadero con un determinado grado de probabilidad. Este grado de probabilidad se llama grado de confianza. laboratorio: Instalaciones donde se realizan anlisis a cargo de personal calificado con equipo adecuado. lmite de cuantificacin/lmite inferior de cuantificacin: El menor contenido mensurable que permite cuantificar el analito con un grado razonable de exactitud y precisin. En algunos laboratorios, el lmite inferior de cuantificacin se considera equivalente a la concentracin mnima de calibracin del rango de trabajo, ya que la exactitud y precisin de esta concentracin se verifica en todos los lotes/tandas de anlisis.

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El contenido igual o superior al punto de concentracin mnima en la curva de calibracin. lmite de deteccin: El menor contenido mensurable del que se puede deducir la presencia del analito, con un grado razonable de certeza estadstica. La menor concentracin de un analito que el mtodo de anlisis puede diferenciar con fiabilidad del ruido de fondo. El menor contenido que puede medirse con una certeza estadstica razonable. lmite superior de cuantificacin: El mayor contenido de analito de una muestra que puede definirse cuantitativamente con precisin y exactitud. linealidad: La linealidad de un mtodo analtico designa su capacidad de obtener resultados de laboratorio que son proporcionales directamente, o por medio de un clculo matemtico bien definido, con la concentracin de analitos en las muestras de un determinado rango. (Vase tambin regresin lineal.) La linealidad define la capacidad del mtodo de obtener resultados analticos proporcionales a la concentracin del analito. lote (o tanda de anlisis): Grupo compuesto por una o ms muestras que se analizan en condiciones prximas a la repetibilidad. Normalmente debe contener calibradores y muestras de control de calidad adems de las muestras que han de analizarse. lote (o tanda de anlisis)*: Serie completa de muestras analticas con un nmero adecuado de patrones y muestras de control de la calidad para su validacin. En un da pueden completarse varias tandas (o lotes) de anlisis o bien el anlisis de un lote (o tanda) puede llevar varios das. manual de prcticas de calidad: Documento en que se indican las polticas, los procedimientos y las prcticas de calidad generales de una organizacin [10]. Documento en que se especifica el sistema de gestin de la calidad de una organizacin. material de referencia certificado (MRC): Material de referencia del cual se han certificado por un procedimiento tcnico una o ms propiedades, que va acompaado de un certificado o de otra documentacin expedido(a) por un organismo de certificacin relacionado(a) con esa documentacin. matriz: Material que contiene el analito, por ejemplo, orina o sangre. matriz biolgica*: Material discreto de origen biolgico del que pueden extraerse muestras que pueden ser procesadas de forma reproducible. Como ejemplo cabe citar la sangre, el suero, el plasma, la orina, las heces, la saliva, los esputos y varios tejidos discretos. media: Si no se especifica otra cosa, designa la media aritmtica. media aritmtica o promedio: Suma de los distintos valores de una serie, dividida por el nmero de valores. medicin*: Conjunto de operaciones que tienen por objeto determinar el valor de una cantidad. mtodo (o mtodo analtico): Procedimiento detallado (definido) para realizar un anlisis. mtodo postulado*: Mtodo analtico que ha sido seleccionado y desarrollado para

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resolver un determinado problema analtico y que ha de ser validado para demostrar que puede cumplir el objetivo analtico previsto antes de ser utilizado. mtodo de referencia: Mtodo desarrollado por organizaciones o grupos que recurren a los estudios en colaboracin o a modalidades anlogas para su convalidacin. Su valor depende de la autoridad de las organizaciones que lo propugnan. muestra aadida: Material de ensayo que contiene una adicin conocida de analito. muestra en blanco: Espcimen o muestra que no contiene el analito. negativo: Indica que el analito est ausente o por debajo de una concentracin crtica. Si bien a veces se utiliza no detectado como sinnimo de negativo, no se recomienda este uso. organismo de certificacin: Organizacin independiente de carcter cientfico con facultades para expedir certificaciones. El organismo de certificacin puede estar acreditado, o no. organizacin: Empresa, sociedad o instituto (o una parte de ellos, por ejemplo, un laboratorio), privado o pblico, con funciones y administracin propias. Entre las organizaciones internacionales que se ocupan del anlisis qumico se encuentran las siguientes: Asociacin Internacional de Toxiclogos Forenses (AITF), Comit Olmpico Internacional (COI), Federacin Internacional de Qumica Clnica (FIQC), Organizacin de Cooperacin y Desarrollo Econmicos (OCDE), Organizacin Internacional de Normalizacin (ISO), Programa Internacional de Proteccin frente a los Productos Qumicos (PIPPQ) y Unin Internacional de Qumica Pura y Aplicada (UIQPA). patrn externo*: Patrn preparado directamente con una sustancia de referencia, por ejemplo, como solucin madre o como serie de diluciones de la solucin madre. No se prepara con el mismo tipo de matriz de los especmenes o muestras que se analizarn y por consiguiente no es necesaria una extraccin antes del anlisis. patrn de calibracin*: Matriz biolgica a la que se ha aadido una cantidad conocida del analito. Los patrones de calibracin se utilizan para calcular curvas de calibracin a travs de las cuales se determina la concentracin de analitos en las muestras de control de calidad y en las muestras con una cantidad del analito desconocida. patrn internacional*: Patrn reconocido por un acuerdo internacional como base para fijar el valor de todos los dems patrones de la cantidad de que se trate. positivo: Indica la presencia del analito en grado superior a una concentracin crtica designada. practicabilidad*: Capacidad de poner algo en prctica. En el laboratorio, significa la ausencia de equipo, reactivos, instrumentos o condiciones ambientales que sean innecesariamente complicados, lo que permite utilizar un mtodo de forma habitual [9]. precisin: Grado de acuerdo (o desacuerdo) entre los resultados independientes de ensayos obtenidos en condiciones prescritas. Por lo general depende de la concentracin del analito, dependencia que debe determinarse y documentarse. La precisin se expresa normalmente como imprecisin y se calcula como desviacin estndar de los resultados de los ensayos. Una mayor imprecisin se traduce en una desviacin estndar tambin mayor. Por resultado independiente se entiende el obtenido sin que medie influencia alguna de otros resultados

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anteriores obtenidos con un material idntico o anlogo. La precisin comprende la repetibilidad y la reproducibilidad. Medida de la reproducibilidad de mediciones de un conjunto, es decir, de la dispersin de un conjunto en torno a su valor central. precisin (intermedia)*: Precisin medida en condiciones intermedias a las de repetibilidad y reproducibilidad: por ejemplo, precisin medida por diferentes analistas, a lo largo de un plazo prolongado, dentro de un solo laboratorio. Expresa la variacin dentro de un laboratorio: diferentes das, diferentes analistas, diferente equipo, etc. probabilidad: Medicin matemtica de la verosimilitud de que algo ocurra, expresada en una fraccin o un porcentaje. Los valores de probabilidad estadstica varan entre 1 100% (siempre) y 0 0% (nunca). La frecuencia relativa obtenida despus de una larga serie de mediciones o resultados dar aproximaciones adecuadas de la verdadera probabilidad. Tambin se entiende de otras maneras: como expresin, en cierta forma indefinible, de un grado de creencia, o como la frecuencia lmite de una ocurrencia en una serie aleatoria infinita. procedimiento: Forma especificada de realizar una actividad. A efectos de la garanta de calidad, los procedimientos deben consignarse por escrito. Forma establecida de realizar una actividad o proceso. procedimientos normalizados de trabajo: Procedimientos consignados por escrito en los que se describe cmo realizar ciertas actividades de laboratorio. promedio: Vase media aritmtica. prueba de la conveniencia del sistema*: Validacin de un sistema analtico. Se hace una prueba para comprobar el funcionamiento del sistema y si un determinado mtodo analtico cumple las especificaciones de funcionamiento que constan en la documentacin [12]. prueba de la robustez*: Programa experimental entre laboratorios que se pone en prctica antes de un estudio entre laboratorios, con el fin de examinar el comportamiento de un proceso analtico cuando se introducen pequeos cambios en las condiciones ambientales y/o de trabajo, similares a los que pueden producirse en los distintos laboratorios. rango (rango de trabajo, rango de calibracin): Intervalo de concentraciones en el que puede lograrse una exactitud y una precisin aceptables. Estadsticamente, es la diferencia entre los valores mnimo y mximo de un conjunto de mediciones. rango de cuantificacin (cuantificacin)*: El rango de concentraciones, incluidos los lmites inferior y superior de cuantificacin, que pueden ser cuantificadas de forma fiable y reproducible, y con exactitud y precisin, a travs de la relacin entre la concentracin y la respuesta (vase tambin rango). rastreabilidad: Capacidad de rastrear la historia, aplicacin o ubicacin de una entidad por medio de los registros o actas en que se haya consignado. Propiedad de un mtodo cuyas mediciones arrojan resultados que pueden relacionarse, con un grado determinado de incertidumbre, con una determinada referencia, por lo general un estndar nacional o internacional,

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mediante una cadena ininterrumpida de comparaciones. Propiedad de los resultados de una medicin o del valor de un estndar que permite relacionarlos, con un grado determinado de incertidumbre, con una determinada referencia, por lo general un estndar nacional o internacional (es decir, mediante una cadena ininterrumpida de comparaciones). Capacidad de rastrear la historia, aplicacin o ubicacin de lo que se est considerando. recuperacin: Porcentaje de droga, metabolito o estndar interno presente inicialmente en el espcimen y que llega hasta el final del procedimiento. Trmino utilizado en qumica analtica y de preparaciones para designar la fraccin de la cantidad total de una sustancia que se recupera despus de un proceso qumico. Se mide aadiendo una cantidad conocida de analito en una matriz en blanco y comparando el resultado con la cantidad realmente reflejada en el anlisis. regresin lineal: Mtodo de describir la relacin entre dos o ms variables mediante el clculo de la lnea recta o las coordenadas de ajuste ptimo. repetibilidad: Grado de acuerdo entre los resultados de mediciones sucesivas de un mismo analito realizadas en condiciones repetibles, por ejemplo, el mismo mtodo, el mismo material, el mismo operador, el mismo laboratorio, y en un perodo de tiempo breve. Los resultados deben expresarse en trminos de desviacin estndar de la repetibilidad, coeficiente de variacin de la repetibilidad o intervalo de confianza del valor medio. Grado de acuerdo entre los resultados de mediciones sucesivas del mismo mensurando realizadas en las mismas condiciones de medicin. reproducibilidad (en laboratorio): Grado de acuerdo entre los resultados de mediciones sucesivas del mismo analito de un material idntico realizadas utilizando el mismo mtodo en condiciones diferentes, por ejemplo, operadores diferentes, laboratorios diferentes y en el curso de un perodo de tiempo largo. Los resultados deben expresarse en trminos de desviacin estndar de la reproducibilidad, coeficiente de variacin de la reproducibilidad o intervalo de confianza del valor medio. Designa tambin la precisin del mtodo en las mismas condiciones de trabajo en un perodo corto de tiempo. Grado de acuerdo entre los resultados de mediciones del mismo mensurando realizadas en condiciones de medicin distintas. resultado (o decisin final)*: Etapa final de la secuencia prevista por un mtodo analtico, que normalmente supone aplicar una tcnica a un extracto o preparacin a fin de obtener datos sobre la composicin de la muestra. robustez*: Capacidad de un mtodo para no verse afectado por pequeas variaciones deliberadas de sus principales parmetros. La robustez de un procedimiento analtico mide su capacidad para no verse afectado por pequeas variaciones deliberadas de los parmetros del mtodo y sirve de indicio de su fiabilidad en su uso normal. Tambin: capacidad de un proceso de medicin para soportar pequeas variaciones incontroladas o involuntarias en sus condiciones de funcionamiento. La robustez de un mtodo analtico mide el grado de reproducibilidad de los resultados

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Directrices para el anlisis de drogas ilcitas en materiales incautados y especmenes biolgicos

analticos obtenidos de las mismas muestras en diversas condiciones, por ejemplo, diferentes laboratorios, analistas, instrumentos, lotes de reactivos, tiempos de ensayo, temperaturas o das. La robustez normalmente refleja la no influencia en los resultados analticos de las variables que representan los mtodos y ambientes de trabajo y que influyen en el mtodo analtico. La robustez mide la reproducibilidad de los resultados analticos a pesar de la variacin normal de las condiciones entre un laboratorio y otro, y un analista y otro. selectividad (o especificidad): Designa el grado en que un mtodo permite determinar la presencia de un analito o analitos concretos en una mezcla compleja sin interferencia de los dems componentes de esa mezcla. El mtodo perfectamente selectivo para un analito o grupo de analitos se denomina especfico. En laboratorio, el trmino especfico designa el mximo de selectividad. cualitativa: Grado en que otras sustancias interfieren en la identificacin de una sustancia por medio de un determinado procedimiento; cuantitativa: este adjetivo se utiliza con un sustantivo (por ejemplo, coeficiente constante, ndice, factor, nmero) para definir cuantitativamente las interferencias. sensibilidad: a) Diferencia en la concentracin del analito que corresponde a la menor diferencia de respuesta del mtodo susceptible de ser detectada. Est representada por la pendiente de la curva de calibracin. Tambin equivale a tres veces el promedio del ruido de fondo de muestras en blanco del mximo de fuentes distintas posible (cinco como mnimo, pero lo ideal seran 20). A veces se emplea errneamente con el significado de lmite de deteccin. b) Porcentaje de resultados positivos acertados cuando se analizan muestras que se sabe que contienen el analito [11]. c) Evaluacin de la respuesta de un instrumento de medicin en funcin de la evolucin del estmulo. sistema analtico (sistema de medicin)*: Conjunto completo de instrumentos de medicin, y otro equipo, ensamblados para realizar una medicin concreta [4]. En el contexto del anlisis de drogas fiscalizadas en materiales incautados o especmenes biolgicos, el sistema analtico est formado por balanzas de laboratorio, medidores de pH, cromatgrafos, equipo de cromatografa en capa delgada, etc., que utiliza el analista para desempear sus funciones. tcnica*: Una tcnica es un principio cientfico, por ejemplo, la cromatografa en fase gaseosa o la espectrometra ultravioleta, que se puede utilizar para obtener datos sobre la composicin de un material. No es frecuente aplicar directamente una tcnica a una muestra, ya que muchas veces es necesaria una extraccin u otra operacin. Por tanto, una tcnica se utiliza en la ltima etapa de un mtodo analtico que normalmente es la de decisin final. umbral: Cantidad, nivel o lmite particular y significativo a partir del cual algo comienza a ocurrir o a producir efectos. Vase concentracin crtica. validacin (validacin de mtodos)*: Confirmacin, mediante el examen y la aportacin de pruebas objetivas, de que se cumplen todos los requisitos particulares del uso especfico al que se pretende destinar el mtodo [8]. La Pharmacopoeia de los Estados Unidos define la validacin de un mtodo analtico como el proceso que permite establecer, mediante estudios de laboratorio, que las caractersticas de funcionamiento del mtodo satisfacen los requisitos

Anexo

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que han de cumplir los anlisis previstos. Como definicin de trabajo debe retenerse la idea de que un mtodo vlido: - ha de ser apropiado (fiable) para los fines previstos; - ha de proporcionar datos analticos tiles en una determinada situacin; - ha de cumplir los requisitos preestablecidos (especificaciones) para resolver el problema analtico; - ha de ofrecer el nivel de resultados establecidos (exactitud, coherencia, fiabilidad); - ha de hacer lo que se supone que hace. valor: Expresin de una magnitud en trminos de un nmero y una unidad de medicin apropiada. valor verdadero: Valor que caracteriza una magnitud perfectamente definida en las condiciones existentes cuando se examina esa magnitud. El valor verdadero de una magnitud es un concepto ideal y, en general, no puede conocerse exactamente. Valor conforme con la definicin de una magnitud determinada. verificacin: Confirmacin mediante el examen y la aportacin de pruebas objetivas de que se han cumplido los requisitos especificados. verificacin (o calificacin) del funcionamiento*: Mtodo oficial y rastreable nacionalmente de evaluacin del funcionamiento de un instrumento en funcin de procedimientos y especificaciones definidos previamente. La verificacin del funcionamiento debe implicar la utilizacin de pruebas que no sean especficas de un mtodo concreto y para las que se utilicen calibradores y estndares rastreables nacionalmente.

Bibliografa
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Vienna International Centre, PO Box 500, 1400 Vienna, Austria Tel.: (+43-1) 26060-0, Fax: (+43-1) 26060-5866, www.unodc.org

ST/NAR/41 V.09-84581Febrero de 2010