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UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE LA MIXTECA

FERMENTACIN DE MALTA EMPLEANDO UN SISTEMA SEMICONTINUO EN EL PROCESO DE ELABORACIN DE CERVEZA

TESIS
PARA OBTENER EL TTULO PROFESIONAL DE: INGENIERO EN ALIMENTOS PRESENTA: ANABEL SNCHEZ MIGUEL DIRECTOR: M.C. VANIA SHUHUA ROBLES GONZLEZ

HUAJUAPAN DE LEN, OAXACA, FEBRERO 2011

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El presente trabajo se realiz en las instalaciones de los laboratorios de Ciencias Qumico-Biolgicas e Hidrologa de la Universidad Tecnolgica de la Mixteca.

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DEDICATORIAS

Mi tesis la dedico con todo mi amor y cario. A mis padres que me dieron la vida y han estado conmigo en todo momento. Gracias por todo pap y mam, por su comprensin, por haberme dado todo lo que soy como persona, mis valores, mis principios, mi perseverancia y mi empeo. Por darme una carrera para mi futuro y por creer en m, aunque hemos pasado momentos difciles siempre han estado apoyndome y

brindndome todo su amor, por todo esto y ms les agradezco de todo corazn el que estn a mi lado.

A mi hermana y mis hermanos que me han acompaado en el transcurso de la vida. Porque juntos hemos pasado momentos maravillosos que han marcado y dejado huella en mi corazn. Por todos esos bellos momentos y los no tan bellos, Gracias.

A Uri, por ser parte esencial en mi vida. Por hacerme sonrer an en los momentos ms difciles, por brindarme tu cario, amor sincero y apoyo incondicional.

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AGRADECIMIENTOS

Agradezco a mis padres y mi familia porque sin su apoyo y confianza no hubiese logrado concluir este proyecto.

Al M.C. Vania S. Robles Gonzlez quien con sus conocimientos y experiencias me ha guiado en el transcurso del proyecto de tesis. Gracias por su amistad y por hacer de las horas del laboratorio un gusto.

A mis sinodales que con sus conocimientos y correcciones hechas al trabajo han contribuido al fortalecimiento de este proyecto.

A todos los profesores que en su momento me dieron clases, por dejar en m parte de su conocimiento y contribuir en mi formacin profesional y personal.

A Sandy, por ser mi amiga incondicional durante toda la carrera. Porque hemos compartido momentos felices y amargos pero es parte de nuestra amistad y no lo cambiara por nada, gracias.

A Uri, por el inmenso cario y apoyo brindado durante este proyecto. Por estar a mi lado en los momentos de trabajo ms pesado.

A los tcnicos de los diferentes laboratorios, que siempre estuvieron dispuestos a apoyarme con material para la realizacin del proyecto.

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RESUMEN

La fermentacin alcohlica es un conjunto de transformaciones bioqumicas en las que ciertas levaduras se encargan de transformar el mosto, compuesto principalmente por hidratos de carbono, en un lquido con determinado contenido alcohlico y dixido de carbono. La fermentacin de malta de cebada durante el proceso de elaboracin de cerveza es una de las etapas ms estudiadas para conseguir mejoras del producto final, ya que se pueden controlar los tiempos y condiciones de operacin. Dicha etapa se puede llevar a cabo en un sistema continuo o por lote. El proceso continuo ha existido desde principios del siglo XX y ofrece las ventajas de alto rendimiento y elevada productividad volumtrica. Sin embargo, estos beneficios no llegan a compensar las desventajas debidas a la mayor complejidad para la instalacin y manejo de estos procesos, en comparacin con los sistemas de fermentacin por lote (tradicional). El presente trabajo se desarroll con la finalidad de implementar un sistema de fermentacin semicontinuo de malta cervecera, el cual combina la productividad volumtrica alta tpica de los sistemas continuos y la facilidad de operacin de los sistemas por lote. Para las fermentaciones se emple levadura Saccharomyces cerevisiae que fue sometida a una previa aclimatacin en mosto de cebada. En este trabajo se estudiaron 3 tiempos de retencin hidrulica (TRH): 5, 4 y 3 das. Cada TRH fue operado por un periodo de 25 das. Para el TRH de 5 das se obtuvo una productividad volumtrica (r) mayor en 20.2% respecto a la r del sistema por lote. Al emplear un TRH de 4 das la r fue mayor en 50.2% en comparacin al sistema por lote y para un TRH de 3 das la r super en 100.4% a la r del sistema por lote.

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INDICE GENERAL

Pg. Resumen ndice de tablas ndice de figuras Lista de abreviaturas 1. INTRODUCCIN 2. FUNDAMENTOS TERICOS 2.1 La cerveza y sus componentes 2.1.1 Ingredientes de la cerveza 2.1.2 El papel de Saccharomyces 2.2 Proceso de elaboracin de cerveza 2.2.1 Preparacin de la malta 2.2.2 Produccin del mosto 2.2.3 Fermentacin 2.2.4 Procesamiento final 2.3 Evaluacin qumica de la cerveza 2.4 La fermentacin alcohlica en la elaboracin de cerveza 2.5 Sistema de fermentacin 2.5.1 Sistema de operacin por lote 2.5.1.1 Ventajas 2.5.1.2 Desventajas 2.5.2 Sistema de operacin en continuo 2.5.2.1 Ventajas 2.5.2.2 Desventajas V IX XI XIII 1 3 3 5 6 7 8 8 10 11 11 12 15 15 20 20 20 23 24

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2.5.3 Sistema de operacin semicontinuo 2.5.3.1 Ventajas 2.5.3.2 Desventajas 3. HIPTESIS 4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general 4.2 Objetivos especficos 5. METODOLOGA 5.1 Plan de trabajo 5.2 Obtencin de la cepa S. cerevisiae con capacidad de produccin de alcohol (i) Activacin de la levadura comercial (ii) Aislamiento de S. cerevisiae (iii) Mantenimiento de S. cerevisiae (iv) Aclimatacin de S. cerevisiae a un medio de mosto de cebada 5.3 Obtencin del mosto de fermentacin 5.4 Fermentacin mediante el sistema semicontinuo 6. RESULTADOS Y DISCUSIN 6.1 Obtencin de la cepa S. cerevisiae con capacidad de produccin de alcohol (i) Activacin de la levadura comercial (ii) Aislamiento de S. cerevisiae (iii) Mantenimiento de S. cerevisiae (iv) Aclimatacin de S. cerevisiae a un medio de mosto de cebada 6.2 Obtencin del mosto de fermentacin 6.3 Fermentacin mediante sistema semicontinuo 7. CONCLUSIONES 8. PERSPECTIVAS

24 25 26 27 27 27 27 28 29 29

30 30 33 33

39 43 46 46

46 47 48 48

50 53 61 62

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9. REFERENCIAS 9.1 Otras fuentes consultadas APNDICE

63 68 69

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NDICE DE DE TABLAS

Pg. Tabla 1. Tabla 2. Tabla 3. Tabla 4. Tipos de cerveza y caractersticas organolpticas. Reactivos utilizados en la experimentacin. Composicin elemental de un microorganismo. Materias primas empleadas para el medio de cultivo sinttico y su relacin con respecto a la Glucosa como fuente de carbono. Tabla 5. Formulacin del medio de cultivo sinttico balanceado (Medio A) para un volumen de 500 mL. Tabla 6. Condiciones de operacin para la Fase 1 de aclimatacin de S. cerevisiae al medio de mosto de cebada (fermentacin semicontinua). Tabla 7. Tabla 8. Formulacin del mosto de cebada (Medio B). Porcentajes empleados de medio A y B en la aclimatacin de la levadura a mosto de cebada. Tabla 9. Tabla 10. Formulaciones de mosto para fermentacin. Condiciones de operacin de los sistemas semicontinuos para diferentes TRHs. Tabla 11. Pendientes obtenidas al aplicar regresin por mnimos cuadrados a diferentes rangos de datos de biomasa en un sistema semicontinuo en funcin del TRH. Tabla 12. Pendientes obtenidas al aplicar regresin por mnimos cuadrados a diferentes rangos de datos de azcares reductores en un sistema semicontinuo en funcin del TRH. Tabla 13. Pendientes obtenidas al aplicar regresin por mnimos 57 57 55 40 43 37 39 36 35 4 28 34 35

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cuadrados a diferentes rangos de datos de concentracin de alcohol en un sistema semicontinuo en funcin del TRH. Tabla 14. Productividades volumtricas en sistema semicontinuo y por lote. 59

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NDICE DE FIGURAS

Pg. Figura 1. a) Crecimiento de S. cerevisiae en agar dextrosa sabouraud y Levadura S. cerevisiae en: b) Microscopia de contraste de fases x580 aumentos y c) Microscopa electrnica de barrido, x7040 aumentos. Figura 2. Figura 3. Proceso de elaboracin de cerveza. Seguimiento de reacciones para obtener etanol a partir de glucosa. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. Figura 11. Operacin del sistema de fermentacin por lote. Curva de crecimiento de la levadura. Operacin del sistema de fermentacin en continuo. Operacin del sistema de fermentacin semicontinuo. Plan de trabajo general. Diagrama descriptivo del aislamiento de S. cerevisiae. Procedimiento para la obtencin del mosto de cebada. Observacin en fresco de levadura S. cerevisiae libre de contaminacin microbiolgica a partir de colonias en placa de agar dextrosa sabouraud. Figura 12. Cintica de concentracin de alcohol en medio sinttico balanceado para la activacin de S. cerevisiae usando un sistema semicontinuo. Figura 13. Cintica de produccin de alcohol en la sustitucin de medio A por medio B en un sistema por lote. Figura 14. Cintica de consumo de azcares reductores en sistema de fermentacin por lote para diferentes formulaciones de mosto 50 49 48 16 17 21 25 29 32 38 47 7 14 6

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de cebada. Figura 15. Porcentaje de consumo de azcares (Azu) en un sistema de fermentacin por lote, para las diferentes formulaciones de mosto de cebada. Figura 16. Cintica de produccin de alcohol en un sistema de fermentacin por lote para las diferentes formulaciones de mosto de cebada. Figura 17. Cintica de produccin de biomasa usando un sistema semicontinuo para diferentes TRHs. Figura 18. Cintica de consumo de azcares y concentracin de alcohol en un sistema semicontinuo para diferentes TRHs. 56 54 52 51

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LISTA DE ABREVIATURAS

Abreviaturas AT ADS APD CA CGS MP RMD TRH UFC cido tartrico Agar dextrosa sabouraud al 4% Agar papa dextrosa Caldo cido Caldo glucosa sabouraud al 2% Materia prima Rango mltiple de Duncan Tiempo de retencin hidrulico Unidades formadoras de colonia

Nomenclatura [C/E]c [C/E]mc X P S Sa FD F Q G G r Concentracin del elemento en la clula Concentracin del elemento en el medio de cultivo Concentracin de microorganismos (biomasa) Concentracin de producto Concentracin de sustrato Concentracin del sustrato de alimentacin Factor de dilucin Flujo Flujo de alimentacin Gasto del estndar de glucosa Gasto de mosto fermentado Productividad volumtrica

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E/MP T t TE uA D qs qp V Vop

Relacin elemento-materia prima Temperatura Tiempo Titulacin del estndar de glucosa Unidades de absorbancia Velocidad de dilucin Velocidad especfica de consumo de sustrato Velocidad especfica de formacin de producto Volumen Volumen de operacin

Letras griegas Azu Porcentaje de consumo de azcares Velocidad especfica de crecimiento celular

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1. INTRODUCCIN

La produccin de cerveza, debido a su larga historia, es considerada generalmente como un tpico ejemplo de biotecnologa tradicional. A pesar de que pueden existir variaciones en su elaboracin dependiendo del tipo especfico de cerveza, el proceso completo consiste bsicamente de cuatro etapas: 1) malteado, basado en la germinacin de la cebada; 2) produccin del mosto cervecero, consiste en la extraccin e hidrlisis de componentes de la cebada malteada seguido del hervido con la adicin de lpulo; 3) fermentacin, se divide en fermentacin primaria o principal y maduracin y 4) procesamiento final, involucra las etapas de filtracin, estabilizacin y embotellado (Linko et al., 1998). La etapa ms lenta del proceso es la fermentacin, donde clulas de levadura en suspensin fermentan el mosto en reactores por lote, sin agitacin externa. La fermentacin primaria dura aproximadamente siete das y la maduracin puede tomar de una a varias semanas (Willaert y Nedovic, 2006). La fermentacin primaria de cerveza en un sistema continuo proporciona una serie de ventajas frente a la fermentacin en un sistema por lote: reduccin en el tamao de los equipos, obtencin de un producto con caractersticas uniformes y principalmente una significativa disminucin del tiempo necesario

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para la elaboracin del producto (Virkajrvi et al., 2002). Sin embargo, el fracaso de la explotacin de los fermentadores continuos en la industria cervecera deriva de la mayor complejidad para su instalacin y manejo (Varnan y Sutherland, 1997), as como de la dificultad de lograr el equilibrio correcto de los compuestos sensoriales (Brnyik et al., 2008; Dragone et al., 2007). Generalmente se tiene una concentracin mayor de diacetilo (2,3-butanodiona, que tiene un fuerte sabor a mantequilla) comparado con los sistemas por lote, al finalizar la maduracin la 2,3-butanodioana se reduce a acetona y a 2,3butanodiol los cuales tienen an sabores relativamente altos (Brnyik et al., 2008). Por lo anterior, en este trabajo se implement un sistema de fermentacin semicontinuo que incluye las ventajas de los 2 mtodos de fermentacin mencionados. Para ello como primer paso se obtuvo una cepa de levadura capaz de emplear el mosto de cebada como fuente de carbono con la consecuente produccin de alcohol. Posteriormente se ensayaron 4

formulaciones de mosto de cebada para determinar la ms viable para el estudio. Por ltimo se estudi la fermentacin semicontinua para diferentes tiempos de retencin hidrulico (TRH) mediante el seguimiento del consumo de azcares reductores, la generacin de biomasa y la produccin de alcohol.

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2. FUNDAMENTOS TERICOS

2.1

La cerveza y sus componentes

La cerveza es una bebida alcohlica no destilada que se obtiene de la fermentacin de un mosto elaborado a partir de malta de cebada, con o sin la adicin de otros cereales no malteados (adjuntos). La mezcla de estos cereales con agua se transforma en azcares mediante la digestin enzimtica. Posteriormente se agrega a la mezcla el lpulo y/o sus derivados y finalmente es sometida a un proceso de coccin (Lpez et al., 2002; IICA, 1999; Vincent et al., 2006).

Existen dos tipos bsicos de cerveza: ale y lager. Dentro de cada uno de estos tipos bsicos existen subtipos con diferentes caractersticas que tienen una nomenclatura variable. En la Tabla 1 se presentan algunos nombres registrados en la literatura (Lpez et al., 2002).

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Tabla 1. Tipos de cerveza y caractersticas organolpticas. Tipo de cerveza Ale Pale ale. Es clara, con un alto contenido de lpulo, es seca y muy amarga. Brown ale. Es oscura, contiene poco lpulo y es dulce. Bitter. Es clara con un alto contenido de lpulo y con mucho cuerpo. Mild ale. Es semioscura, de sabor dulce, poco densa y amarga. Stout o Porter. Es muy oscura, con mucho cuerpo, alto contenido de lpulo, amarga, dulce o seca. Lager Pilsener, Hell o Pale. Es clara, con alto contenido de lpulo, seca y con poco cuerpo. Dortmunder. Tiene caractersticas parecidas a la Pilsener pero con un menor contenido de lpulo y sabor ms suave. Munich, Donkel o Dark. Es oscura, de sabor intenso, aromtica, con bajo contenido de lpulo, amargor ligero, dulce y con mucho cuerpo. Bock, Marzen o Marzenbier. Tiene caractersticas parecidas a la Munich, pero con mayor contenido de alcohol.

Subtipos de cerveza

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2.1.1 Ingredientes de la cerveza. Para la elaboracin de cerveza se requiere de las siguientes materias primas: (i) agua, (ii) malta y (iii) lpulo. (i) Agua. El agua empleada en la fabricacin de la cerveza es el componente mayoritario y de acuerdo a la NOM-142-SSA1-1995 debe ser potable y podr utilizarse agua destilada o desmineralizada. (ii) Malta. La malta es un cereal en etapa temprana de germinacin, cuyo proceso de germinacin ha sido controlado y detenido mediante la aplicacin de secado. Aunque existen maltas de diferentes cereales, el trmino normalmente se refiere a la malta de cebada (Lpez et al., 2002). La malta contiene las enzimas necesarias para hidrolizar los hidratos de carbono complejos, proceso necesario para la obtencin del mosto (Hernndez y Sastre, 1999; Lpez et al., 2002; Vincent et al., 2006). (iii) Lpulo. El lpulo se obtiene a partir de los conos maduros de la flor femenina de la planta Humulus lupulus y se agrega al mosto como extracto o productos secados (en polvo o en pastillas) en dosis que varan en funcin del sabor y aroma final deseados para la cerveza (Lpez et al., 2002; Posse, 1993).

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2.1.2 El papel de Saccharomyces. En la elaboracin de cerveza se utilizan principalmente dos especies de levaduras: Saccharomyces cerevisiae (cerveza tipo ale) y Saccharomyces carlsbergensis conocida tambin como Saccharomyces uvarum o pastorianus (cerveza tipo lager). Saccharomyces se encarga de fermentar los azcares como: glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa y maltotriosa presentes en el mosto y en ausencia de oxgeno produce como productos principales etanol y CO2 (Varnan y Sutherland, 1997).

S. cerevisiae es un hongo levaduriforme que presenta clulas alargadas, globosas elipsoidales, pudiendo encontrarse en agrupaciones de dos, en cadenas cortas, racimos o bien sin agruparse. La apariencia de las colonias es muy diversa: de color crema a ligeramente caf, de lisas a rugosas, en ocasiones sectorizadas y brillantes u opacas (Lpez et al., 2002), Figura 1. Esta levadura crece de forma ptima a pHs cidos (Calaveras, 2004; Garca, 2005).

a)

b)

c)

Figura 1. a) Crecimiento de S. cerevisiae en agar dextrosa sabouraud y Levadura S. cerevisiae en: b) Microscopia de contraste de fases x580 aumentos y c) Microscopa electrnica de barrido, x7040 aumentos (Bial-Arstegui, 2002).

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2.2 Proceso de elaboracin de cerveza

Para obtener cerveza deben considerarse 4 etapas principales (Hernndez y Sastre, 1999):

(i) Preparacin de la malta

Cebada cervecera Remojo Germinacin Secado y tostado Molienda Malta

(ii) Produccin del mosto

Maceracin Filtracin Adicin de lpulo y coccin Filtracin

(iii) Fermentacin

Inoculacin de levaduras Fermentacin primaria Maduracin

Mosto

(iv) Procesamiento final

Clarificacin Carbonatacin Envasado Pasteurizacin Cerveza

Figura 2. Proceso de elaboracin de cerveza.

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2.2.1 Preparacin de la malta. Tiene como objetivo obtener un polvo rico en enzimas. Para hacer esto, el grano de cebada tiene que ser puesto a germinar a una temperatura de 10 a 16 C, una humedad de 42 a 46 % y un tiempo de 60 horas. Despus, la cebada germinada se seca usando aire caliente iniciando con un calentamiento suave hasta alcanzar la temperatura final dependiendo de las caractersticas que se deseen en la malta. Normalmente las temperaturas de secado para maltas lager son de 55 a 70 C y de 60 a 95 C para maltas ale. Finalmente se realiza la fragmentacin de los granos tostados para obtener la malta en polvo (Lpez et al., 2002; Varnan y Sutherland, 1997).

2.2.2 Produccin del mosto. La malta ya molida se mezcla con agua y en ocasiones se adicionan entre un 10 y 20% de otros tipos de granos no germinados, tales como el arroz o el maz, que proporcionan un sabor ms ligero. La mezcla se calienta gradualmente hasta una temperatura de 48 C por aproximadamente 20 minutos, en la que se activan principalmente las proteasas, las -glucanasas y la -amilasa. Se contina el calentamiento progresivo por etapas a temperaturas de 60 C por 30 minutos y posteriormente a 72 C por 30 minutos ms, estas temperaturas corresponden a las temperaturas de activacin de las amilasas (Lpez et al., 2002). La solucin se filtra y al lquido obtenido se le aade el lpulo. Finalmente la solucin se somete a ebullicin por una hora para obtener el mosto. |8

Las proteasas hidrolizan las protenas de la malta, dando como resultado la formacin de pptidos y aminocidos, que ms adelante, durante la fermentacin servirn como nutrientes para la levadura. Las -glucanasas hidrolizan los glucanos presentes en la cebada; la degradacin de estos polmeros es importante para disminuir la viscosidad del mosto. La -amilasa hidroliza la amilosa y la amilopectina originando maltosa y dextrinas. Las amilasas que se activan entre 60 y 70 C hidrolizan los enlaces (1 4) de la amilosa y la amilopectina en diferentes puntos del polmero sin acercarse a los puntos de ramificacin y a los extremos de la cadena (Vincent et al., 2006). Al llevarse la coccin del mosto se cubren 7 objetivos tecnolgicos (Varnan y Sutherland, 1997): (i) Concentracin de slidos en el mosto. (ii) Extraccin de los componentes del lpulo. (iii) Inactivacin de las enzimas de la malta. (iv) Esterilizacin del mosto. (v) Eliminacin de compuestos voltiles indeseables. (vi) Formacin de los compuestos responsables del aroma, sabor y color de la cerveza mediante reacciones de Maillard. (vii) Coagulacin de protenas y favorecimiento de la reaccin entre taninos y protenas para la formacin de compuestos insolubles que precipitan clarificando as el producto.

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Despus de enfriar y filtrar la solucin se obtiene un mosto equilibrado compuesto principalmente por carbohidratos fermentables, aminocidos y minerales. El mosto sirve como sustrato para el crecimiento de las levaduras y en la produccin de etanol. As mismo es fuente de precursores de aroma y sabor (Varnan y Sutherland, 1997).

2.2.3 Fermentacin. En la elaboracin industrial de cerveza se emplean dos clases diferentes de fermentacin: (i) fermentacin alta, aplicada a la elaboracin de cerveza tipo ale. Durante esta fermentacin las levaduras forman un aglomerado que flota en el lquido o pueden flocular a inicios de la fermentacin y hundirse el lquido. (ii) fermentacin baja, aplicada a la elaboracin de cerveza tipo lager. En este tipo de fermentacin las levaduras floculan al finalizar la etapa, en aglomerados que se hunden en el lquido (Varnan y Sutherland, 1997). Estas fermentaciones operan bajo condiciones de tiempo y temperatura diferentes, sin embargo en ambas la fermentacin se lleva a cabo en dos pasos (Linko et al., 1998): la fermentacin primaria llamada simplemente fermentacin y la fermentacin secundaria maduracin. En este trabajo se utiliza el trmino fermentacin para la etapa de fermentacin primaria. Durante la fermentacin el mosto se somete a temperaturas que van desde 15 a 22 C para cervezas ale y desde 7 a 15 C para cervezas lager. En esta etapa las levaduras metabolizan los carbohidratos del mosto para la generacin de etanol y CO2 predominantemente. | 10

El proceso de maduracin consiste en someter al mosto fermentado a bajas temperaturas que van desde 4 a 10 C por un tiempo de 5 a 10 das. La maduracin proporciona a la cerveza sus caractersticas finales de olor, color, sabor y brillantez (Hernndez, 2003; Lpez et al., 2002; Varnan y Sutherland, 1997). 2.2.4 Procesamiento final. Una vez concluida la maduracin, la cerveza es clarificada, carbonatada, envasada y pasteurizada para su embalaje y distribucin.

2.3

Evaluacin qumica de la cerveza

Antes de poder determinar la composicin qumica de la cerveza se debe preparar la muestra eliminando el dixido de carbono presente y llevarla a una temperatura que va de 20 a 25 C. Si se tiene presencia de material suspendido, deber eliminarse por filtracin (AOAC, 1997). Segn la AOAC las caractersticas fsicas y qumicas importantes para determinar en la cerveza son: color, gravedad especfica, viscosidad, concentracin de alcohol, etanol, glicerol, pH, azcares reductores, diacetilo, almidn, protena, nitrgeno, dixido de carbono, amargor, minerales residuales y alcoholes superiores.

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2.4

La fermentacin alcohlica en la elaboracin de cerveza

La etapa de fermentacin en la elaboracin de cerveza generalmente dura una semana a una temperatura de 20 C (Stanier et al., 1996; Vincent et al., 2006). Durante este proceso el mosto es transformado en un lquido con determinado contenido de alcohol etlico. Al inicio de la fermentacin, la levadura comienza su proceso de reproduccin. El desarrollo de esta etapa depende de la disponibilidad de oxgeno, fuentes de nitrgeno y de algunos otros nutrientes. Cuando el oxgeno es consumido la reproduccin celular se detiene y comienza el proceso anaerobio en el que la glucosa se transforma en etanol y CO2 (Hernndez, 2003; Pares y Jurez, 1997). Las levaduras son las responsables de esta transformacin, siendo S. cerevisiae la especie de levadura ms frecuentemente usada en la industria cervecera (Varnan y Sutherland, 1997). El balance global de la fermentacin se representa mediante la siguiente ecuacin qumica (Vsquez y Dacosta, 2007):

6 H12 O6 2C2 H5 OH + 2CO2

[1]

A pesar de la simplicidad de esta ecuacin, la secuencia de transformaciones para degradar a una molcula de glucosa hasta dos molculas de etanol y dos molculas de dixido de carbono es un proceso complejo que involucra 2 etapas: (1) la formacin en anaerobiosis de 2 | 12

molculas de piruvato a travs de la ruta metablica de Embden-Meyerhof (gluclisis) y (2) la descarboxilacin del piruvato en anaerobiosis para dar lugar a dos molculas de acetaldehdo que se reducen a etanol (Hernndez, 2003; Varnan y Sutherland, 1997), Figura 3.

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ATP

ADP

Glucosa C6H12O6

Glucosa 6-fosfato C6H13O9P

Fructosa 6-fosfato C6H13O9P


ATP

Dihidroxiacetona fosfato C3H7O6P

ADP

Fructosa 1,6-difosfato C6H14O12P2 Gliceraldehido 3-fosfato C3H7O6P


2 NAD 2 NADH2 2 ADP 2 ATP

Etapa 1 (2) cido 3-fosfoglicrico C3H6O7P

(2) cido 1,3-difosfoglicrico C3H8O10P2

2 H2 0

(2) cido fosfoenolpirvico C3H4O6P


2 ADP 2 ATP

(2) cido 2-fosfoglicrico C3H6O7P

(2) cido pirvico C3H3O3


H
+

CO2 2 NAD 2 NADH2

(2) Acetaldehdo C2H4O

(2) Etanol C2H6O

Etapa 2

Figura 3. Seguimiento de reacciones para obtener etanol a partir de glucosa. | 14

2.5

Sistemas de fermentacin

Un sistema fermentativo se define como el volumen de reaccin limitado por un contenedor fsico (biorreactor). Donde se lleva a cabo la degradacin biolgica anaerobia de molculas orgnicas mediante la accin de ciertas enzimas que actan directamente o como componentes de ciertas bacterias y levaduras. El biorreactor ms simple es el matraz erlenmeyer (Hernndez, 2003; Ruz et al., 2007). En base a su alimentacin, los biorreactores se pueden operar en: continuo, semicontinuo, lote y lote alimentado. En el presente trabajo solo se estudiarn los tres primeros por ser de inters en esta investigacin.

2.5.1 Sistema de operacin por lote. En el sistema de fermentacin por lote inicialmente se aade al biorreactor una solucin rica en nutrientes (concentracin de sustrato, S0) la cual se inocula con microorganismos (concentracin de biomasa, X) que producen un determinado producto de inters (concentracin de producto, P). A medida que procede la fermentacin se tiene un estado no estacionario de los componentes del sistema (S, X y P) (Hernndez, 2003). La multiplicacin celular cesa por limitacin de nutrientes y/o acumulacin de productos txicos de excrecin celular. Una vez que se ha alcanzado el nivel deseado de fermentacin (S, X, P), el biorreactor se vaca, se lava, se esteriliza y el proceso se repite. Los cambios en los componentes del medio de fermentacin dentro del biorreactor producen a su vez cambios en el | 15

metabolismo celular (Harvey y Douglas, 1997; Gummadi, 2007). La ilustracin del sistema es mostrado en la Figura 4.

Figura 4. Operacin del sistema de fermentacin por lote.

El comportamiento del crecimiento de la levadura en el tiempo se representa por una curva de crecimiento (Figura 5), la cual consiste en cuatro fases (Hernndez, 2003): (i) Fase lag. Representa el periodo de adaptacin de la levadura a las nuevas condiciones nutricionales y ambientales. En esta fase no existe aumento en el nmero de clulas debido a que la levadura utiliza la energa disponible para sintetizar las enzimas que requiere para su desarrollo en el nuevo medio. (ii) Fase logartmica o exponencial. En esta fase las clulas se multiplican de manera exponencial. La velocidad de crecimiento puede ser cuantificado con base al nmero de clulas que se producen por unidad de tiempo. La fase termina cuando los

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nutrientes se agotan, las condiciones ambientales se modifican cuando la clula produce metabolitos txicos que inhiben su reproduccin. (iii) Fase estacionaria. En esta fase la velocidad de crecimiento de la levadura es igual a la velocidad de muerte. Una vez que se obtiene la mxima concentracin de clulas, la produccin de etanol disminuye. (iv) Fase de muerte. Es la fase en la que el nmero de muertes es mayor al nmero de nuevas clulas formadas. Esta fase contina hasta que la poblacin disminuye a una pequea fraccin de clulas resistentes o hasta que todas las clulas mueren.

2,5

iii

Biomasa

ii iv i

0 0

Tiempo
Figura 5. Curva de crecimiento de la levadura.

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El balance global de materiales en el sistema por lote se muestra a continuacin (Galndez y Ruiz, 1994): Balance de biomasa = + V
dX dt acumulacin

=00+V

dX dt crecimiento

[2]

Definiendo:
dX dt 1 X

[3]

Y dividiendo entre V se tiene:


dX dt acumulaci n

dX dt crecimiento

= X

[4]

Donde: V = volumen del medio en el biorreactor, X = concentracin de microorganismos (biomasa), t = tiempo y = velocidad especfica de crecimiento celular.

Balance de sustrato = V
dS dt acumulacin

=00V

dS dt consumo

[5]

Definiendo:
dS dt 1 X

= qS

[6]

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Y dividiendo entre V se tiene:


dS dt acumulacin

dS dt consumo

= q S X

[7]

Donde: S = concentracin de sustrato y q S = velocidad especfica de consumo de sustrato.

Balance de producto = + V
dP dt acumulacin

= 00+V

dP dt sntesis

[8]

Definiendo:
dP dt 1 X

= qP

[9]

Y dividiendo entre V se tiene:


dP dt acumulacin

dP dt sntesis

= qP X

[10]

Donde: P = concentracin de producto y q P = velocidad especfica de formacin de producto.

El sistema por lote de fermentacin es el ms empleado en la industria cervecera.

| 19

2.5.1.1

Ventajas. Dentro de las principales ventajas de un proceso por

lote se tienen: bajo riesgo de contaminacin, flexibilidad operacional cuando el fermentador se utiliza para distintos productos, manejo eficiente entre lote y lote y costos de operacin bajos (Gummadi, 2007; Nielsen et al., 2003; Rao, 2005). 2.5.1.2 Desventajas. Las principales desventajas de este modo de

operacin son tiempos muertos largos que se presentan al momento de vaciar, limpiar y esterilizar el biorreactor para la siguiente fermentacin; adicionalmente, este proceso requiere de mucha mano de obra. Dado que se trata de un proceso no estacionario requiere de un mayor cuidado por parte de los operadores. Por otra parte el control y optimizacin del proceso se vuelven complejos y existe el riesgo de mayor variabilidad entre lotes (Atkinson, 2008; Nielsen et al., 2003; Riet y Tramper, 1991).

2.5.2 Sistema de operacin en continuo. En el sistema de fermentacin continuo se aade al biorreactor una solucin rica en nutrientes (S0) la cual se inocula con microorganismos (X0). Una vez inoculado el biorreactor se comienza a suministrar un flujo continuo de alimentacin F(Sa). En los sistemas continuos, el flujo de salida (efluente) del biorreactor es igual al flujo de entrada Figura 6. El flujo de alimentacin F(Sa) est compuesto por los nutrientes del medio de cultivo o sustrato, mientras que el efluente F(Sf,Xf,Pf) contiene el sustrato residual, la biomasa, as como los productos de fermentacin (Zeng et al., 2001). | 20

Figura 6. Operacin del sistema de fermentacin en continuo.

Si se tiene un mezclado homogneo en el biorreactor, las condiciones son uniformes y espordicamente se alcanza el estado estacionario (estado de equilibrio dinmico) (Atkinson, 2008). El estado estacionario se define como una condicin de estabilidad en la que varios factores permanecen constantes a travs del tiempo, entre ellos el volumen de operacin y las concentraciones de biomasa, de sustrato y de producto (Hernndez, 2003).

El balance global de materiales en sistemas continuos es el siguiente (Galndez y Ruiz, 1994): Balance de biomasa = + V
dX dt acumulacin dX dt acumulacin

= 0 FX + V =
FX V

dX dt crecimiento

[11] [12]

dX dt crecimiento

| 21

Definiendo:
F V

=D

[13]

Se tiene que:
dX dt acumulacin

= DX +
dX

dX dt crecimiento

[14] [15] [16]

Dado que
dX dt acumulacin

dt crecimiento

= X

= DX + X = X D

Donde: F = flujo y D = velocidad de dilucin.

En estado de equilibrio dinmico, los valores de cada una de las velocidades de acumulacin se hacen cero por lo que se tiene que: 0= X D =D Balance de sustrato = V
dS dt acumulacin dS dt acumulacin dS dt acumulacin

[17] [18]

= FSa FS V = DSa DS = D Sa S

dS dt consumo dS dt consumo dS dt consumo

[19] [20] [21]

| 22

Dado que:
dS dt consumo dS dt acumulacin

= qS X

[22] [23]

= D Sa S q S X

Donde: Sa = concentracin del sustrato de alimentacin.

Balance de productos = + V
dP dt acumulacin dP dt acumulacin

= 0 FP + V = DP +
dP

dP dt sntesis

[24] [25]

dt sntesis

Dado que:
dP dt sntesis dP dt acumula cin

= qP X

[26] [27]

= DP + q P X = q P X DP

2.5.2.1

Ventajas. En la prctica, el sistema continuo provee una

pequea fluctuacin de nutrientes, metabolitos y biomasa (Zeng et al., 2001). El mtodo de fermentacin permite a los microorganismos crecer en condiciones de estado estacionario en el que el crecimiento ocurre a una velocidad constante. Se logra mantener un estado fisiolgico estable en el que se mantiene a la poblacin microbiana en un estado de mxima productividad siempre y cuando los TRHs a los que se opere el sistema no sean mayores a | 23

la velocidad especfica de crecimiento (Hernndez, 2003; Galndez y Ruz, 1994). 2.5.2.2 Desventajas. Puede presentarse contaminacin en la

alimentacin continua del reactor o durante la operacin. Esto obligara a parar el proceso, desechar el producto y a volver a alcanzar el estado estacionario, lo cual puede tomar varias semanas. Otro problema de estos sistemas es que las levaduras pueden mutar a variedades no productoras de etanol (Van Balken, 1997). El proceso continuo requiere costos de inversin y operacin elevados, adems de que es inflexible cuando se trata de fermentar diferentes productos (Lpez et al., 2002; Varnan y Sutherland, 1997). Las mutaciones se manifiestan espontneamente como alteraciones tanto en niveles morfolgicos como bioqumicos. Durante la fermentacin en sistema continuo, las levaduras de cerveza presentan mutacin entre 0.5 y 5% de los cuales aproximadamente el 50% de clulas mutadas surgen despus de nueve meses de operacin. El almacenamiento prolongado, la falta de nutrientes y el estrs por etanol son factores que aumentan la aparicin de mutaciones (Brnyik et al., 2008).

2.5.3 Sistema de operacin semicontinuo. Se aade al biorreactor una solucin rica en nutrientes (S0) la cual se inocula con microorganismos (X0). Una vez inoculado el biorreactor se tiene un comportamiento similar al sistema por lote en el cual se permite un tiempo de crecimiento celular y de formacin

| 24

del producto (paso 2, Figura 7), a este tiempo se le conoce como tiempo de retencin hidrulico (TRH). Despus de transcurrido este tiempo cierto volumen del medio de cultivo se extrae del biorreactor purga Vpurga(Sf,Xf,Pf) y se sustituye por el mismo volumen de medio nutritivo fresco, Valimentacin(S0). El proceso de purga y alimentacin (recambio de medio) se realiza peridicamente a intervalos de tiempo constantes. En el nuevo medio de fermentacin las levaduras continan su crecimiento, as como la formacin de productos (Laing y Helm, 1981; Victores et al., 2008).

Figura 7. Operacin del sistema de fermentacin semicontinuo.

Las ecuaciones obtenidas del balance de materiales para el sistema semicontinuo global son similares a las del sistema continuo. 2.5.3.1 Ventajas. El uso de este sistema elimina los tiempos muertos

en la lnea de produccin. Dado que la nueva etapa despus del recambio de medio se comienza con un volumen importante de biomasa en crecimiento, el

| 25

tiempo de adaptacin (fase lag) se reduce de manera importante entre una etapa y otra. Otra ventaja es la posibilidad de operar el biorreactor con

concentraciones altas de biomasa y tasas de formacin de producto altas con respecto a los sistemas por lote (Victores et al., 2008). Lo anterior se traduce en un aumento de la productividad volumtrica del sistema semicontinuo en comparacin con el sistema por lote. 2.5.3.2 Desventajas. El sistema es ms caro de operar y de instalarse contaminacin

en comparacin al sistema por lote, puede presentarse microbiolgica y

mutacin de la cepa si la levadura se mantiene en

procesamiento durante largos periodos de tiempo (Brnyik et al., 2008; Fondevila y Prez, 2007).

| 26

3. HIPTESIS

La aplicacin de un sistema semicontinuo en el proceso de fermentacin de malta de cebada aumenta la productividad volumtrica con respecto al mtodo tradicional de fermentacin por lote.

4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general Obtener una mayor productividad volumtrica de mosto fermentado a partir de malta de cebada mediante el uso de un sistema semicontinuo, en comparacin con un sistema por lote.

4.2

Objetivos especficos

1. Aislar y aclimatar levadura liofilizada comercial de panificacin, S. cerevisiae, a un medio de fermentacin de cebada malteada para la produccin de alcohol. 2. Seleccionar la mejor formulacin de mosto de cebada para el proceso de fermentacin, utilizando un sistema por lote. 3. Comparar la productividad volumtrica de los sistemas de fermentacin semicontinuo y por lote con base en cinticas de biorreaccin. | 27

5. METODOLOGA

Durante la experimentacin se emplearon los reactivos mostrados en la Tabla 2, todos grado reactivo. En lo que respecta a la formulacin del mosto de cebada se emple extracto de malta en polvo; Maltex, Mxico, y extracto de lpulo; Seheyex Lote SH-020305, Mxico. Para el sistema de biorreaccin se emple levadura liofilizada, S. cerevisiae para panificacin; Nevada.

Tabla 2. Reactivos utilizados en la experimentacin. Reactivo cido tartrico Agar dextrosa sabouraud al 4% Agar papa dextrosa Caldo cido Caldo glucosa sabouraud al 2% Glucosa NaOH (Hidrxido de sodio) (NH4)2SO4 (sulfato de amnio granular) K2HPO4 (fosfato de potasio dibsico) KNaC4H4O64H2O (tartrato de sodio y potasio) CuSO4 (sulfato cprico) J.T. Baker Abreviatura AT ADS APS CA CGS Marca J.T. Baker Merk Bioxon DIBICO Merk Abaquim J.T. Baker J.T. Baker Tcnica Qumica J.T. Baker

| 28

5.1

Plan de trabajo

Obtencin de la cepa pura de levadura con capacidad de produccin de alcohol Obtencin del mosto de fermentacin

Fermentacin mediante sistema por lote (referencia)

Fermentacin mediante sistema semicontinuo

Figura 8. Plan de trabajo general.

5.2

Obtencin de la cepa S. cerevisiae con capacidad de

produccin de alcohol Se parti de levadura liofilizada comercial para panificacin y se realizaron los siguientes pasos: (i) Activacin de la levadura comercial. (ii) Aislamiento de S. cerevisiae. (iii) Mantenimiento de S. cerevisiae. (iv) Aclimatacin de S. cerevisiae a un medio de mosto de cebada.

A continuacin se detalla la metodologa desarrollada en cada una de estas etapas.

| 29

(i) Activacin de la levadura comercial La levadura liofilizada comercial para panificacin, S. cerevisiae, se activ usando CGS. Se prepararon 25 mL de caldo en un frasco de dilucin, despus de lo cual, el medio se esteriliz. Se le agreg un inculo de 3.0 g de levadura liofilizada en una campana de flujo laminar (Labconco modelo 3612550). Se incub en estufa a 28 C durante 5 das, despus de los cuales se midi el pH con un potencimetro (Hach modelo 54650-18). Finalmente se tom una muestra por frotis simple y se observ el crecimiento celular en un microscopio ptico. Debido a la existencia de contaminacin microbiolgica en la muestra, se realiz el aislamiento de la levadura S. cerevisiae como se describe a continuacin.

(ii) Aislamiento de S. cerevisiae El aislamiento de la levadura se realiz mediante el empleo de medios selectivos; APD, CA y ADS (Gutirrez y Gmez, 2008; Yegres et al., 2003; Zapata et al., 2002). Durante esta etapa se realiz la toma de muestra y siembra en condiciones aspticas, para cada una de las siguientes subetapas (Figura 9): a. Del producto obtenido en la etapa (i) se tom 1 mL de inculo, se sembr en APD por vertido en placa y se incub en una estufa a 28 C durante 5 das. Se realiz un frotis simple de una de las colonias resultantes y se observ el crecimiento obtenido en el microscopio. | 30

b. Se colocaron 25 mL de CA (pH = 4.1) en un frasco de dilucin. Se inocul con dos hisopos de levadura provenientes de la fase (a) y se incub a 28 C durante 5 das. c. Del cultivo de levaduras obtenido en la fase (b), se tom 1 mL y en medio ADS acidificado con 0.2 mL de AT al 10% se sembr por vertido en placa. Se incub a 28 C durante 5 das y se observ al microscopio. d. Se realizaron resiembras por estriado de la cepa obtenida en medio ADS acidificado hasta observar en el microscopio una cepa de levadura sin contaminacin microbiolgica. .

| 31

1 mL de caldo de la etapa (i)

Sembrar en APD por vertido en placa Incubar a 28 C por 5 das Tomar 2 hisopos de levadura Sembrar en 25 mL de caldo cido Incubar a 28 C por 5 das Tomar 1 mL del cultivo anterior Sembrar por vertido en placa en ADS acidificado Incubar a 28 C por 5 das Tomar una muestra por frotis simple y observar al microscopio Tomar una muestra por frotis simple y observar al microscopio Tomar una muestra por frotis simple y observar al microscopio

Resiembra por estriado de la levadura en ADS acidificado La levadura est contaminada microbiolgicamente? No Detener el aislamiento

Si

Figura 9. Diagrama descriptivo del aislamiento de S. cerevisiae.

| 32

(iii) Mantenimiento de S. cerevisiae Se tom una asada de la cepa pura obtenida en la etapa anterior y se sembr mediante la tcnica de estriado en cajas petri y tubos de ensaye en medio de cultivo ADS acidificado. Los medios inoculados se incubaron a 28 C durante 5 das. Posteriormente, para descartar la posibilidad de contaminacin microbiolgica, se realiz la observacin del crecimiento obtenido en el microscopio. (iv) Aclimatacin de S. cerevisiae a un medio de mosto de cebada La aclimatacin de S. cerevisiae en el medio de mosto de cebada se realiz en dos fases: La Fase 1 consisti en la formulacin de un medio de cultivo sinttico para S. cerevisiae, empleando glucosa como fuente de carbono de fcil asimilacin (Lpez et al., 2002). La Fase 2 consisti en la adaptacin de S. cerevisiae a un medio de cultivo complejo (mosto de cebada) utilizado para la elaboracin de cerveza. Aclimatacin Fase 1 en medio de cultivo balanceado. La preparacin del medio de cultivo sinttico consisti en formular un medio de cultivo balanceado (medio A) que cubriera las necesidades nutricionales para el crecimiento de la levadura. El medio de cultivo incluye glucosa como fuente de carbono y energa, as como los siguientes componentes: nitrgeno, fsforo, potasio y azufre (Quintero, 1981; Rodrguez, 1987; Vong, 1996). La masa necesaria de cada componente se determin en base a la fuente de carbono y tomando en cuenta la composicin elemental de un microorganismo (Galndez y Ruiz,

| 33

1994), Tabla 3. Empleando las materias primas descritas en la Tabla 4 se calcul la relacin del elemento con respecto a la materia prima [E/MP] dividiendo el peso del nmero de tomos del elemento entre el peso molecular de la materia prima. Se continu con el clculo de la cantidad de materia prima con respecto a la fuente de carbono [MP/Glucosa] aplicando la ecuacin [28] (Galndez y Ruiz, 1994):

MP Glucosa = 0.40 / C E

mc

E MP

[28]

Tabla 3. Composicin elemental de un microorganismo (Galndez y Ruiz, 1994). Elemento [E] %C %N %P %K %Mg %S %Ca Composicin celular 50 10 1.5 2.0 0.3 0.6 0.1 Relacin [C/E]c en la clula 5.0 33 25 166 83 500 Relacin [C/E]mc en el medio de cultivo 7.5 50 38 251 125 750

| 34

Tabla 4. Materias primas empleadas para el medio de cultivo sinttico y su relacin con respecto a la Glucosa como fuente de carbono. Relacin [E/MP] [g/g] 0.40 0.21 0.18 0.45 0.24 Relacin [MP/Glucosa] [g/g] 1 0.254 0.044 0.023 0.013

Elemento [E] C N P K S

[MP] Glucosa (NH4)2SO4 K2HPO4 K2HPO4 (NH4)2SO4

Peso Molecular 180 132 174 174 132

Para la formulacin del medio de cultivo sinttico se sugirieron 5 g de glucosa y la formulacin qued como se resume en la Tabla 5. Tabla 5. Formulacin del medio de cultivo sinttico balanceado (Medio A) para un volumen de 500 mL.

Elemento C NyS PyK

Reactivo C6H12O6 (NH4)2SO4 K2HPO4

Cantidad (g) 5 1.335 0.34

Se prepar un volumen de operacin (Vop ) de 500 mL del medio A, despus de lo cual se esteriliz y acidific con AT. Posteriormente el medio se inocul con dos asadas de levadura provenientes de la etapa (iii), bajo condiciones aspticas. Despus de esto se realiz la fermentacin en sistema semicontinuo usando las condiciones de operacin mostradas en la Tabla 6. | 35

Tabla 6. Condiciones de operacin para la Fase 1 de aclimatacin de S. cerevisiae al medio de mosto de cebada (fermentacin semicontinua).

Parmetro T ( C)* Q (mL/da) TRH (das)

Valor 221 C 100 5

Nota: * Temperatura del cuarto de incubacin controlada por un sistema de enfriamiento (Mini Split, Carrier modelo TAC490).

Las condiciones de fermentacin empleadas se basan en las mencionadas por Varnan y Sutherland (1997) y Desrosier (1998) para cerveza tipo Ale. Determinacin de alcohol. Se determin la concentracin de alcohol en grados Gay-Lussac (GL) tomando una muestra de 50 mL del volumen de medio fermentado purgado diariamente. Se coloc la muestra en un matraz baln, se agreg 100 mL de agua destilada y la mezcla se destil hasta obtener 45 mL de volumen destilado. El destilado se transfiri a una probeta de 50 mL y se complet el volumen con agua destilada, se coloc el densmetro cuidando que este no tocara las paredes de la probeta y se tomo la lectura en GL (Sierra et al., 2007). Se oper el sistema de fermentacin hasta obtener una concentracin alcohlica detectable. La levadura obtenida en esta etapa se conserv en medio selectivo ADS acidificado, para lo cual bajo condiciones aspticas se tom un 1

| 36

mL del caldo de fermentacin y se sembr por vertido en placa. Una vez crecidas las colonias, se tom una muestra y se resembr por estriado en cajas petri y en tubo inclinado. Las muestras se incubaron a 28 C durante 5 das. Aclimatacin Fase 2 en medio de mosto de cebada. Esta fase consisti en aclimatar a las clulas de S. cerevisiae al medio de mosto de cebada (Medio B) el cual consisti en la formulacin descrita en la Tabla 7. Tabla 7. Formulacin del mosto de cebada (Medio B). Materia prima Malta Lpulo Agua Cantidad 166.4 g 2.5 g 960 mL

Para preparar el mosto de cebada se llev a cabo el procedimiento mostrado en la Figura 10 (Lpez, et al., 2002).

| 37

Suspensin de malta y agua

Calentamiento suave hasta alcanzar 48 C, 20 minutos 60 C por 30 minutos

72 C por 30 minutos

Ebullicin por 30 minutos Lpulo Ebullicin por 1 hora Figura 10. Procedimiento para la obtencin del mosto de cebada (Lpez, et al., 2002).

Para lograr el objetivo de la Fase 2, se sustituy progresivamente el medio A por medio B de acuerdo a la Tabla 8. Inicialmente se inocul un medio que contena 90% de A y 10% de B, con 2 asadas de levadura de la Fase 1. Se realiz una fermentacin semicontinua, bajo las siguientes condiciones de operacin Vop = 1000 mL, TRH = 5 das, Q = 200 mL/da, T = 22 1 C. Para pasar de un medio de fermentacin a otro, se inocularon 10 mL del medio fermentado anterior en 990 mL de medio fresco con la nueva composicin.

| 38

Tabla 8. Porcentajes de medio A y B empleados en la aclimatacin de la levadura a mosto de cebada. Medio de Fermentacin Semana (MF) 1 1 2 3 4 5 6
7 8 9 10

Medio A (%) 90 80 70 60 50 40
30 20 10 0

Medio B (%) 10 20 30 40 50 60
70 80 90 100

3 5 7 9 11
13 14 15 16

Se determin diariamente la concentracin de alcohol usando el mtodo del densmetro. Para la conservacin de la levadura aclimatada se realiz el procedimiento mencionado en la Fase 1.

5.3

Obtencin del mosto de fermentacin

El mosto de fermentacin es el producto obtenido de la mezcla de malta, lpulo y agua (Hernndez, 2003). Para la seleccin del mosto de fermentacin, se ensayaron 4 formulaciones de mosto de cebada, de las cuales de la

| 39

formulacin F1 a la F4 se vari la cantidad de lpulo para disminuir el amargor del producto final, Tabla 9. Tabla 9. Formulaciones de mosto para fermentacin. Formulacin F1
1

Reactivo Malta Lpulo Agua


1

F22 100 g 2.5 g 960 mL


2

F3* 100 g 1.5 g 960 mL

F4*

166.4 g 2.5 g 960 mL

100 g 0.7 g 960 mL

Notas: Angiolani, 1960; Hernndez y Sastre,1999; *Propuestas.

Para cada formulacin se prepar un Vop de 1400 mL de la solucin de malta y agua y se someti a tres incrementos de temperatura. Esto tuvo como finalidad activar las enzimas de la malta y propiciar la hidrlisis de azcares complejos (Varnan y Sutherland, 1997), Figura 10. Los mostos resultantes de las formulaciones mostradas en la Tabla 9 se fermentaron usando el sistema por lote con las siguientes condiciones de operacin: Vop = 1400 mL, T = 19 1 C y t = 5 das. Se realizaron muestreos en el reactor cada 24 horas tomando un volumen de 70 mL para determinar la concentracin de alcohol (GL) y la concentracin de azcares reductores (g/L). Determinacin de azcares reductores. La determinacin de azcares reductores se realiz por el mtodo de Fehling usando azul de metileno como indicador (CPNT, 1995). Inicialmente se tomaron 10 mL de mosto fermentado y

| 40

se llevaron a un aforo de 100 mL con agua desionizada, y la mezcla se coloc en una bureta. Por otro lado en un matraz erlenmeyer se colocaron 5 mL de solucin A de Fehling y 5 mL de solucin B de Fehling (Apndice B), se aadieron 2 gotas de azul de metileno y 20 mL de agua desionizada. La solucin se llev a calentamiento con agitacin y una vez iniciada la ebullicin se agreg gota a gota el mosto fermentado hasta que se alcanz un color rojo ladrillo. Se tom la lectura del volumen utilizado y se sustituy en la ecuacin [29] para determinar el contenido de azcares reductores en g/L.

x=

1000 TE G

FD

[29]

En la ecuacin [29], TE tiene un valor de 0.0484 y se determin de la titulacin del estndar de glucosa (Apndice B); G es el gasto del mosto fermentado y FD el factor de dilucin. Determinacin de alcohol. La concentracin de alcohol se midi por el mtodo del densmetro como se describe en la seccin 5.2 (p.36). Finalizada la etapa de fermentacin se llev a cabo la etapa de maduracin. El producto obtenido de la fermentacin se centrifug en un equipo IEC HN-SII a 9000 rpm durante 10 minutos. Despus de lo cual, el sobrenadante se coloc en un matraz erlenmeyer estril y se refriger a 4 C durante 4 das. Al finalizar la maduracin se determin la concentracin de alcohol, los azcares reductores y el pH. | 41

Se realiz un anlisis de varianza (ANOVA) usando un diseo factorial simple sobre los parmetros de concentracin de azcares reductores y de alcohol para determinar la existencia de diferencia significativa entre los datos en funcin del tiempo de fermentacin. Para el anlisis estadstico se emple el software Desing-Expert 6.0.10, utilizando un valor de 0.05. Posteriormente se aplic la prueba del rango mltiple de Duncan (RMD) con un nivel de significancia de 0.05 y 8 grados de libertad (Montgomery, 2006), para determinar los pares de medias que presentaran diferencia significativa, en los parmetros de concentracin azcares reductores y alcohol.

| 42

5.4

Fermentacin mediante el sistema semicontinuo

El estudio de la fermentacin semicontinua se realiz mediante un diseo experimental factorial simple que relaciona el efecto del factor tiempo de retencin hidrulico (TRH) con 3 niveles (5, 4 y 3 das) sobre tres variables de respuesta: concentracin de biomasa, concentracin de azcares reductores y concentracin de alcohol.

Para cada TRH se realizaron tres corridas con un Vop de 1400 mL de mosto de cebada preparado segn la formulacin seleccionada en la seccin 5.3. Posteriormente, el mosto se inocul aspticamente con 2 asadas de cepa pura de S. cerevisiae y se puso a fermentar bajo condiciones anaerbicas. Las condiciones de operacin de los diferentes tratamientos se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10. Condiciones de operacin de los sistemas semicontinuos para diferentes TRHs. TRH (das) 5 4 3 T (C) 19 1 19 1 19 1 Q (mL/da) 280 350 467

| 43

Del volumen de purga realizada cada 24 h se tom una muestra como se menciona en el apartado 5.3 (p. 40) y se midi la concentracin de biomasa, azcares y alcohol. Determinacin de Biomasa. La determinacin se llev a cabo en dos pasos: (i) Se tom una muestra de mosto fermentado y se midi la densidad ptica a 620 nm (Silva et al., 2008); (ii) Se tom 1 mL de la muestra de mosto fermentado y se hicieron las diluciones correspondientes para sembrar por vertido en placa en medio ADS acidificado. Se realiz una curva de calibracin que relaciona las UFC en funcin de la densidad ptica (Apndice A). Con la curva de calibracin se pudo determinar las UFC de la muestra mediante el uso de la ecuacin de calibracin que relaciona la densidad ptica con la biomasa. La determinacin de la concentracin de alcohol y azcares reductores se realizaron como se mencionan en los apartados 5.2 (p.36) y 5.3 (p.40) respectivamente. Se realizaron observaciones de muestras de mosto fermentado cada 48 h mediante la tcnica de frotis simple. Los sistemas de fermentacin semicontinuo fueron operados hasta el momento en que se present contaminacin microbiolgica. Para el anlisis de resultados se tom en cuenta el tiempo de fermentacin de la muestra que present contaminacin con mayor rapidez. Los mostos fermentados que no sufrieron contaminacin se llevaron a

| 44

maduracin, despus de la cual se determinaron los siguientes parmetros: azcares reductores, concentracin alcohlica y pH. Es de inters en este estudio el determinar si el sistema semicontinuo llega al equilibrio dinmico (en el que no hay cambios significativos en las variables de respuesta en el transcurso de los TRHs). Para probar esto, los datos obtenidos de las cinticas (variables de respuesta vs tiempo) se ajustaron a una ecuacin lineal empleando la metodologa de regresin por mnimos cuadrados. Considerando que la ecuacin de la lnea recta ajustada est dada por F x = ax + b, los coeficientes de regresin lineal son (Larson et al., 2006):
n n xi yi n xi n yi i=1 i=1 i=1 n n xi 2 i=i
2 n i=1 xi

a=

[30]

b=n

n i=1 yi

n i=1 xi

[31]

El valor de a representa la pendiente y b es la ordenada al origen de la recta de ajuste. Cuando el valor de a es cero la recta es horizontal. Se aplic el mtodo de regresin por mnimos cuadrados a los datos cinticos para los diferentes TRHs. Se establecieron rangos de datos para probar si la pendiente es cercana a cero y por lo tanto si el sistema lleg al equilibrio dinmico.

| 45

6. RESULTADOS Y DISCUSIN

6.1 Obtencin de la cepa S. cerevisiae con capacidad de produccin de alcohol Para desarrollar el objetivo propuesto en este trabajo, primero se trabaj en la obtencin de una cepa pura de levadura S. cerevisiae con la capacidad de aprovechar los carbohidratos presentes en el mosto de cebada y generar alcohol. A continuacin se detallan los resultados obtenidos en el proceso de activacin y aclimatacin de la levadura.

(i) Activacin de la levadura comercial La levadura liofilizada comercial para panificacin, S. cerevisiae fue inoculada en medio CGS. El medio tena un pH inicial de 4.5, que es un pH idneo para el crecimiento de levaduras (Calaveras, 2004). Sin embargo, al realizar la observacin al microscopio se detect contaminacin bacteriana (bacilos). Debido a la contaminacin observada fue necesario aislar la cepa mediante resiembras sucesivas en placa.

| 46

(ii) Aislamiento de S. cerevisiae Para obtener una cepa de levadura libre de contaminacin microbiolgica se aisl la cepa usando medios selectivos (APD, CA y ADS). Se logr la purificacin de la cepa (Figura 11) al cabo de 15 resiembras en medio ADS acidificado.

Figura 11. Observacin en fresco de levadura S. cerevisiae libre de contaminacin microbiolgica a partir de colonias en placa de agar dextrosa sabouraud.

En la resiembra en ADS nmero 15 se observaron al microscopio clulas de levadura elipsoidales, en su mayora sin agruparse y con gemacin multilateral. Las colonias en el medio slido presentaron apariencia color crema, brillante, hmeda y lisa, lo cual es caracterstico de las levaduras S. cerevisiae (Lpez et al., 2002).

| 47

(iii) Mantenimiento de S. cerevisiae Despus del aislamiento de S. cerevisiae, se hicieron resiembras de la cepa para su mantenimiento. Mediante observaciones al microscopio se determin que los cultivos estaban libres de contaminacin microbiolgica.

(iv) Aclimatacin de S. cerevisiae a un medio de mosto de cebada Aclimatacin Fase 1 en medio de cultivo balanceado. Durante los primeros 29 das de fermentacin del sistema semicontinuo no hubo

produccin de alcohol. No fue sino hasta el comienzo de la semana 5 cuando se obtuvo un incremento en la concentracin alcohlica, llegndose a obtener un mximo de 5.5 0.1 GL a principios de la sexta semana, Figura 12.

Concentracin de alcohol ( GL)

6 5 4 3 2 Semana 4 Semana 5

Semana 6

1
0 0 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

Tiempo (das)
Figura 12. Cintica de concentracin de alcohol en medio sinttico balanceado para la activacin de S. cerevisiae usando un sistema semicontinuo.

| 48

Aclimatacin Fase 2 en medio de mosto de cebada. Una vez obtenida la cepa de S. cerevisiae con capacidad de producir alcohol se continu con la Fase 2 en la cual se sustituy de forma gradual el medio A (medio sinttico balanceado) por el medio B (mosto). Se monitore la concentracin de alcohol de las diferentes etapas de fermentacin con el aumento paulatino del contenido de medio B, hasta llegar al medio de mosto de cebada al 100%, Figura 13. 12

Concentracin de alcohol (GL)

90% A-10% B

80% A-20% B

10 8 6 4 2 0

70% A-30% B

60% A-40% B

50% A-50% B

40% A-60% B

30% A-70% B

20% A-80% B

10% A-90% B

15

30

45

60

75

90

105

120

135

150

Tiempo (das)
Figura 13. Cintica de produccin de alcohol en la sustitucin de medio A por medio B en un sistema por lote.

En la Figura 13 se observa un incremento gradual de la concentracin de alcohol conforme aumenta el porcentaje de medio B en el biorreactor. Lo anterior podra deberse a que a medida que sustituimos el medio A por B, la concentracin de azcares disponibles en el medio de fermentacin aumenta

| 49

0% A-100% B

gradualmente. La concentracin mxima de alcohol obtenida en el lote donde se emple el 100% del medio B fue de 10 GL.

6.2

Obtencin del mosto de fermentacin 4

Para obtener la formulacin del mosto de cebada se probaron

formulaciones en procesos de fermentacin por lote, en las cuales se vari la cantidad de malta y lpulo.

Azcares reductores (g/L)

120 90 60 30 0 1 2
F1

3
F2

4
F3

5
F4

Tiempo (das)

Figura 14. Cintica de consumo de azcares reductores en sistema de fermentacin por lote para diferentes formulaciones de mosto de cebada.

En la Figura 14 se observa que la concentracin de azcares reductores disminuy con respecto al tiempo. La concentracin inicial de azcares reductores para F1, F2, F3 y F4 fueron de: 104.01, 57.69, 53.40 y 67.94 g/L respectivamente y la concentracin final para las mismas formulaciones fueron de: 18.11, 11.71, 11.50 y 11.04 g/L respectivamente. Al final de las | 50

fermentaciones, los porcentajes de consumo de azcares (Azu) para las formulaciones F1, F2, F3 y F4 fueron de 82.53 1.39 %, 79.59 1.47 %, 78.46 0.50 % y 83.74 0.8 % respectivamente, Figura 15.

88,0 84,0

Azu (%)

80,0 76,0 72,0 F1 F2 F3 F4

Formulaciones
Figura 15. Porcentaje de consumo de azcares (Azu) en un sistema de fermentacin por lote, para las diferentes formulaciones de mosto de cebada.

Los resultados del estudio de ANOVA y el RMD (Apndice C) demuestran que no existe diferencia significativa entre los pares de medias de F1 y F4 (grupo a) y entre los pares de medias de F2 y F3 (grupo b) y que a su vez el grupo (a) es estadsticamente diferente del grupo (b). El criterio escogido para el parmetro de concentracin de azcares reductores fue el que mayor porcentaje de consumo de azcares presentara. Dado que el mayor porcentaje de consumo de azcares lo presenta el grupo (b) se puede elegir la formulacin F1 F4 indistintamente. | 51

Concentracin de alcohol (GL)

12 9 6 3 0 1 2
F1

3
F2

4
F3

5
F4

Tiempo (das)
Figura 16. Cintica de produccin de alcohol en un sistema de fermentacin por lote para las diferentes formulaciones de mosto de cebada.

La concentracin final mxima de alcohol para la formulacin de mosto de cebada F1 fue de 10 GL, mientras que para el resto de las formulaciones fue de 8 GL. Los resultados del estudio de ANOVA y el RMD (Apndice D) demuestran que la concentracin final de alcohol es igual para los pares de medias de F2, F3 y F4 y que F1 es diferente a estas. Lpez et al. (2002) mencionan que en general las cervezas tienen un contenido alcohlico que va de 3 a 6 GL y que existen cervezas con mayor contenido de alcohol, sin embargo en Mxico se consumen en su mayora cervezas de bajo contenido de alcohol. Debido a lo anterior se opt por trabajar con las formulaciones que presentaron menor contenido alcohlico resultando las formulaciones 2, 3 y 4 como posibles formulaciones a emplear.

| 52

Una vez terminada la fermentacin, los medios fermentados se pasaron al proceso de maduracin. Las concentraciones de azcares reductores residuales despus de la maduracin disminuyeron en 1 g/L en todos los casos. El grado alcohlico se mantuvo constante y el valor promedio del pH fue de 4.40 0.10. Estos valores concuerdan con los valores reportados por Sierra et al. (2007) para cerveza tipo ale. Se seleccion la formulacin F4 de mosto de cebada para llevar a cabo todos los estudios de fermentacin en sistema semicontinuo debido a que present una concentracin alcohlica de 8 GL y un mayor Azu respecto a las otras formulaciones.

6.3

Fermentacin mediante el sistema semicontinuo

Se estudi el efecto del tiempo de retencin hidrulico (TRH) en la concentracin de biomasa, azcares reductores y alcohol durante procesos de fermentacin semicontinua del mosto con formulacin F4. Los sistemas semicontinuos se operaron por triplicado con duracin de 25 das cada uno debido a que fue el tiempo mximo sin contaminacin microbiolgica.

| 53

5 E+08

Biomasa (UFC)

3 E+08

2 E+08

0 E+00 0 4 8
TRH, 5 das

12

16
TRH, 4 das

20

24
TRH, 3 das

28

Tiempo (das)
Figura 17. Cintica de produccin de biomasa usando un sistema semicontinuo para diferentes TRHs.

Las pendientes resultantes al aplicar regresin por mnimos cuadrados a diferentes rangos de datos de concentracin de biomasa en funcin del TRH (Apndice E) se muestran en la Tabla 11.

| 54

Tabla 11. Pendientes obtenidas al aplicar regresin por mnimos cuadrados a diferentes rangos de datos de biomasa en un sistema semicontinuo en funcin del TRH. TRH (das) 5 4 3 aA 1.1294 1.3147 1.3491 Seccin aB 0.2350 0.7200 0.0700 aC 0.0028 0.0021 0.0071 Tiempo de estabilizacin (da)
8 5 5

Notas: aA pendiente de la recta de ajuste de regresin por mnimos cuadrados en la seccin A; aB pendiente en la seccin B; aC pendiente en la seccin C.

A medida que transcurre el tiempo de fermentacin la pendiente disminuye hasta llegar a un valor aproximado a cero (Tabla 11), lo cual nos indica que el sistema semicontinuo alcanza un estado de equilibrio dinmico (Galndez y Ruiz, 1994).

| 55

Azcares reductores (g/L)

60 40

8 6 4

20 0 0 5 10 15 20 25

2 0

Tiempo (das)
azcares (TRH, 5 das) azcares (TRH, 3 das) grado alcohlico (TRH, 4 das) azcares (TRH, 4 das) grado alcohlico (TRH, 5 das) grado alcohlico (TRH, 3 das)

Figura 18. Cintica de consumo de azcares y concentracin de alcohol en un sistema semicontinuo para diferentes TRHs.

Las pendientes resultantes de aplicar la regresin por mnimos cuadrados a los datos de concentracin de azcares reductores y

concentracin de alcohol al trabajar con los diferentes TRHs (Apndice F) se muestran las Tablas 12 y 13 respectivamente.

Grado alcohlico (GL)


| 56

80

10

Tabla 12. Pendientes obtenidas al aplicar regresin por mnimos cuadrados a diferentes rangos de datos de azcares reductores en un sistema semicontinuo en funcin del TRH. TRH (das) 5 4 3 aA -9.8594 -5.4119 -7.8947 Seccin aB -1.1780 -17.3134 -13.8241 aC 0.0075 0.0203 0.0004 Tiempo de estabilizacin (da)
11 5 5

Notas: aA pendiente de la recta de ajuste de regresin por mnimos cuadrados en la seccin A; aB pendiente en la seccin B; aC pendiente en la seccin C.

Tabla 13. Pendientes obtenidas al aplicar regresin por mnimos cuadrados a diferentes rangos de datos de concentracin de alcohol en un sistema semicontinuo en funcin del TRH. TRH (das) 5 4 3 aA 2.6667 3.0000 2.2000 Seccin aB 0.5392 1.0000 0.3137 aC 0.0004 0.0001 0.0006 Tiempo de estabilizacin (da)
8 5 9

Notas: aA pendiente de la recta de ajuste de regresin por mnimos cuadrados en la seccin A; aB pendiente en la seccin B; aC pendiente en la seccin C.

Como podemos ver en las Tablas 12 y 13, a medida que transcurre el tiempo de fermentacin las pendientes disminuyen hasta llegar a un valor aproximado a cero, esto nos confirma que el sistema semicontinuo alcanza un estado de equilibrio dinmico entre lotes secuenciales.

| 57

Los tiempos mnimos de fermentacin a partir de los cuales se obtuvo un estado de equilibrio dinmico para todas las variables de respuesta en funcin de los TRHs de 5, 4 y 3 das fueron en los das 11, 5 y 9 de fermentacin respectivamente. Para evaluar el sistema de fermentacin semicontinuo con respecto al sistema de fermentacin tradicional (sistema por lote), se compararon las productividades volumtricas de ambos sistemas de fermentacin, las cuales se calcularon mediante la ecuacin [32]. r=
V producto t

[32]

Donde r es la productividad volumtrica, Vproducto el volumen de producto obtenido y t el tiempo requerido para la obtencin del producto. La fermentacin en sistema por lote requiere de 6 das: 5 das para la fermentacin y 1 da para la preparacin del material y del medio de fermentacin. Se considera un volumen de operacin de 1400 mL, por ser el volumen con el que se oper el sistema semicontinuo. Sustituyendo estos datos en la ecuacin [32] se tiene una productividad volumtrica para un sistema por lote de: r=
1400 mL 6 das

= 233 mL/da

Para calcular las productividades volumtricas del sistema semicontinuo en funcin del TRH, se consideraron para Vproducto los volmenes de producto | 58

obtenidos a partir del momento en que el sistema semicontinuo alcanz el equilibrio dinmico y t los tiempos que permaneci el equilibrio dinmico. En la Tabla 14 se presentan los tiempos de equilibrio dinmico en funcin del TRH, los volmenes de producto obtenidos durante el equilibrio y las productividades volumtricas en funcin del TRH.

Tabla 14. Productividades volumtricas en sistema semicontinuo y por lote. Tiempo Volumen (mL) de: de TRH equilibrio Producto Purga dinmico (semicontinuo) (das) 5 14 280 3920 4 3 20 16 350 467 7000 7472

r (mL/da) r (mL/da) (semicontinuo) (por lote) 280 350 467 233

Como se puede observar en la Tabla 14 la productividad volumtrica de la fermentacin en sistema semicontinuo para los tres TRHs fue mayor con respecto a la productividad del sistema por lote. Para un TRH de 5 das la productividad volumtrica fue mayor respecto al sistema por lote en 47 mL/da, el TRH de 4 das present una productividad volumtrica superior en 117 mL/da y para un TRH de 3 das esta productividad fue mayor en 234 mL/da en comparacin a l sistema por lote.

| 59

De acuerdo a los resultados anteriores, la fermentacin en sistema semicontinuo para los tres TRHs ensayados provee de un mayor volumen de producto bajo condiciones de equilibrio dinmico.

| 60

7. CONCLUSIONES

1. Se aisl y se conserv una cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae libre de contaminantes microbiolgicos a partir de una levadura comercial para panificacin y fue capaz de producir alcohol, obtenindose valores entre 5 y 10GL. 2. La formulacin F4 de mosto de cebada con 100 g de malta, 0.7 g de lpulo y 960 mL de agua, se escogi de acuerdo a los criterios establecidos. 3. Se pueden realizar fermentaciones en sistema semicontinuo con TRHs de 5, 4 y 3 das por un periodo de 25 das. 4. Empleando un TRH de 5 das se obtuvo 20.2% mayor productividad volumtrica con respecto a un sistema por lote, para un TRH de 4 das esta productividad fue mayor respecto al sistema por lote en un 50.2% mientras que para un TRH de 3 das la productividad volumtrica respecto al sistema por lote fue mayor en un 100.4%. 5. El sistema semicontinuo representa una opcin viable de fermentacin de mosto de cebada para la obtencin de cerveza.

| 61

8. PERSPECTIVAS

1. Determinar los azcares reductores en cervezas comerciales para tener un rango de comparacin. 2. Implementar un mtodo diferente para la determinacin de la concentracin de alcohol. 3. Realizar ensayos de manipulacin de la formulacin para llegar a una concentracin alcohlica deseada. 4. Implementar el proceso de gasificacin para el producto madurado mediante el empleo de un gasificador y un dosificador de CO2. 5. Realizar una evaluacin de las caractersticas organolpticas del producto. 6. Realizar el perfil de aromas del producto obtenido para descartar la presencia de 2,3-butanodiona debido a que confiere sabores indeseables al producto final.

| 62

9. REFERENCIAS

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| 67

9.1

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| 68

APNDICE

A. Curva de calibracin de la formulacin F4 de mosto de cebada Se graficaron los valores de densidad ptica vs UFC obtenidos para la formulacin.

5E+08

y = 6E+08x - 1E+07 R = 0,998

Biomasa (UFC)

4E+08 3E+08

2E+08
1E+08 0E+00 0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

Densidad ptica (uA)

Figura A1. Curva de Calibracin de la formulacin F4 de mosto de cebada.

| 69

B. Titulacin del estndar de Glucosa

1. Se prepar una solucin estndar de glucosa, 2 en 1000 y se coloc en una bureta. 2. En un matraz erlenmeyer se colocaron 5 mL de solucin A de Fehling, 5 mL de solucin B, 2 gotas de azul de metileno y 20 mL de agua desionizada. (i) Solucin A de Feheling. Se prepar una solucin al 3% de sulfato cprico cristalizado. (ii) Solucin B de Feheling. Se prepar una solucin al 15% de sal de Rochelle (tartrato de sodio y potasio) en solucin acuosa al 5% de NaOH. 3. La solucin se calent con agitacin y una vez iniciada la ebullicin se agreg lentamente la solucin estndar de glucosa hasta que se alcanz un color rojo ladrillo. 4. El volumen de estndar de glucosa gastado (G) fue de 24.2 mL y se sustituy en la ecuacin B1 para determinar el valor de la titulacin del estndar de glucosa (TE).

TE = 1000 =

2xG

2 24.2 1000

= 0.0484

[B1]

| 70

C. Anlisis de varianza (ANOVA) y rango mltiple de Duncan (RMD) para el porcentaje de consumo de azcares de las formulaciones de mosto de cebada

Tabla C1. ANOVA de los porcentajes de consumo de azcares reductores para las formulaciones de mosto. Fuente de Suma de variacin cuadrados Mtodos Error Total 55,830 10,3768 66,207 Grados de libertad 3 8 11 Cuadrado medio 18,610 1,2971

F0

Prob > F

14,3475

0.0014

significativa

Para la prueba del rango mltiple de Duncan (RMD) se tiene un MSE (cuadrado medio del error) de 1.2971, N (numero de observaciones) de 12, n (numero de rplicas) de 3 y 8 grados de libertad. Los promedios de los tratamientos (formulaciones) se muestran en la Tabla C2.

| 71

Tabla C2. Promedio de los tratamientos para el consumo de azcares reductores para las formulaciones de mosto, en orden ascendente. Formulacin 3 2 1 4 Promedio 78,460 79,590 82,530 83,740

El error estndar de cada promedio es =

1.2971 3 = 0.658 . Del conjunto

de rangos significativos de la Tabla VII del apndice para 8 grados de libertad (Montgomery, 2006) y de 0.05 se obtienen los datos de la columna r0.05(formulacin,8) de la Tabla C3 y al calcular los rangos de significancia mnima (ecuacin C1) se tiene la columna Rformulacin de la Tabla C3.

R formulacin = r0.05 formulacin, 8

[C1]

Tabla C3. Rangos de significacin mnima para los datos de azcares reductores de las formulaciones de mosto. Formulacin r0.05(formulacin,8) Rformulacin

F2 F3 F4

3,26 3,39 3,47

2,144 2,229 2,282

| 72

Los resultados de comparacin son mostrados en la tabla C4.

Tabla C4. Comparacin de pares de medias para los datos de azcares reductores de las formulaciones de mosto. F4 vs F3: F4 vs F2: F4 vs F1: F1 vs F3: F1 vs F2: F2 vs F3: 83.74 - 78.46 = 83.74 - 79.59 = 83.74 - 82.53 = 82.53 - 78.46 = 82.53 - 79.59 = 79.59 - 78.46 = 5.28 4.15 1.21 4.07 2.94 1.13 > > < > > < 2.282 2.229 2.144 2.229 2.144 2.144

Por el anlisis se observa que hay diferencias significativas entre los pares de medias de las formulaciones (F4 vs F3), (F4 vs F2), (F1 vs F3) y (F1 vs F2) y que no existe diferencia significativa entre los pares de medias de (F1 vs F4) y (F2 vs F3).

| 73

D. Anlisis de varianza (ANOVA) y rango mltiple de Duncan (RMD) para la concentracin de alcohol de las formulaciones de mosto de cebada

Tabla D1. ANOVA de la concentracin de alcohol para las formulaciones de mosto. Fuente Grados Suma de Cuadrado de de cuadrados medio variacin libertad Mtodos Error Total 9,000 0,000 9,000 3 8 11 3,000 0,000 Prob > F

F0

6,37E+07 < 0.0001


significativa

Para la prueba del rango mltiple de Duncan (RMD) se tiene un MSE (cuadrado medio del error) de 0.000, N (numero de observaciones) de 12, n (numero de rplicas) de 3 y 8 grados de libertad. Los promedios de los tratamientos (formulaciones) se muestran en la Tabla D2.

| 74

Tabla D2. Promedio de los tratamientos para la concentracin de alcohol en orden ascendente. Formulacin 2 3 4 1 Promedio 8 8 8 10

El error estndar de cada promedio es =

0 3 = 0.00 . Del conjunto de

rangos significativos de la Tabla VII del apndice para 8 grados de libertad y de 0.05 (Montgomery, 2006) se obtienen los datos de la columna r0.05(formulacin,8) de la Tabla D3 y al calcular los rangos de significancia mnima (ecuacin C1) se tiene la columna Rformulacin de la Tabla D3.

Tabla D3. Rangos de significacin mnima para los datos de concentracin de alcohol de las formulaciones de mosto. Formulacin r0.05(formulacin,8) Rformulacin

F2 F3 F4

3,26 3,39 3,47

0.00 0.00 0.00

| 75

Los resultados de comparacin son mostrados en la tabla D4.

Tabla D4. Comparacin de pares de medias para los datos de concentracin de alcohol de las formulaciones de mosto. F1 vs F2: F1 vs F3: F1 vs F4: F4 vs F2: F4 vs F3: F3 vs F2: 10 10 10 8 8 8 8 8 8 8 8 8 = = = = = = 2 2 2 0 0 0 > > > = = = 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

Por el anlisis se observa que hay diferencia significativa entre los pares de medias de las formulaciones (F1 vs F2, F3 y F4) y que no existe diferencia significativa entre los pares de medias de (F4 vs F2 y F3) y (F3 vs F2).

| 76

E. Rectas de regresin por mnimos cuadrados de los diferentes rangos de datos de concentracin de biomasa para los diferentes TRHs

Para calcular la recta de regresin de mnimos cuadrados, inicialmente se segment la curva de acuerdo a su comportamiento. Posteriormente se calcularon las sumatorias de x, y, xy y x2 para cada segmento y se sustituyeron en las ecuaciones [30] y [31].

i.

TRH de 5 das

5 E+08

Biomasa (UFC)

4 E+08 3 E+08 2 E+08

A 1 E+08

0 E+00
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27

Tiempo (das)
Figura E1. Segmentacin de la curva de produccin de biomasa para un TRH de 5 das.

| 77

La seccin A abarc del da 1 al 4, la seccin B los das 4 al 7 y la seccin C del da 8 al 25.

Tabla E1. Sumatorias de la seccin A de la curva de produccin de biomasa para TRH de 5 das. X 1,0000 2,0000 3,0000 4,0000 Y 0,00458 0,0618 1,9800 3,1300 XY 0,0046 0,1236 5,9400 12,5200 X2 1,0000 4,0000 9,0000 16,0000

Sumatorias 10,0000 5,1764 18,5882 30,0000

Tabla E2. Sumatorias de la seccin B de la curva de produccin de biomasa para TRH de 5 das. X 4,0000 7,0000 8,0000 Y 3,1300 3,9100 4,0400 XY 12,5200 27,3700 32,3200 X2 16,0000 49,0000 64,0000

Sumatorias 19,0000 11,0800 72,2100 129,0000

| 78

Tabla E3. Sumatorias de la seccin C de la curva de produccin de biomasa para TRH de 5 das. X 8,0000 9,0000 10,0000 11,0000 14,0000 15,0000 16,0000 17,0000 18,0000 21,0000 22,0000 23,0000 24,0000 25,0000 Y 4,0400 4,1000 4,0100 4,0100 3,9200 3,9400 3,9800 4,0200 4,0000 4,0500 4,0200 4,0600 4,0800 4,1000 XY 32,3200 36,9000 40,1000 44,1100 54,8800 59,1000 63,6800 68,3400 72,0000 85,0500 88,4400 93,3800 97,9200 102,5000 X^2 64,0000 81,0000 100,0000 121,0000 196,0000 225,0000 256,0000 289,0000 324,0000 441,0000 484,0000 529,0000 576,0000 625,0000

Sumatorias 233,0000 56,3300 938,7200 4311,0000

Al sustituir las sumatorias en las ecuaciones [30] y [31] para cada seccin se obtuvieron valores de a y b mostrados en la Tabla E4.

| 79

Tabla E4. Valores de a y b en las diferentes secciones de la curva de produccin de biomasa para TRH de 5 das. Seccin A a b 1.1294 -1.5295 B 0.2350 2.2050 C 0.0028 3.9764

ii.

TRH de 4 das

5 E+08 C

Biomasa (UFC)

4 E+08 3 E+08 2 E+08 1 E+08 0 E+00 0

12

15

18

21

24

27

Tiempo (das)
Figura E2. Segmentacin de la curva de produccin de biomasa para un TRH de 4 das.

| 80

La seccin A abarc del da 1 al 3, la seccin B del da 3 al 5 y la seccin C del da 5 al 25. Los datos se manejaron de forma similar a los de TRH de 5 das, obtenindose en las diferentes secciones los valores de a y b mostrados en la Tabla E5.

Tabla E5. Valores de a y b en las diferentes secciones de la curva de produccin de biomasa para TRH de 4 das. Seccin A a b 1.3147 - 1.7510 B 0.7200 0.5133 C 0.0021 4.0959

| 81

iii.

TRH de 3 das

5 E+08 C

Biomasa (UFC)

4 E+08 3 E+08

2 E+08
1 E+08 0 E+00 A

12

15

18

21

24

27

Tiempo (das)
Figura E3. Segmentacin de la curva de produccin de biomasa para un TRH de 3 das.

La seccin A abarc del da 1 al 3, la seccin B los das 3 al 5 y la seccin C del da 5 al 25. Los datos se manejaron de forma similar a los de TRH de 5 das, obtenindose en las diferentes secciones los valores de a y b mostrados en la Tabla E6.

| 82

Tabla E6. Valores de a y b de las diferentes secciones de la curva de produccin de biomasa para TRH de 3 das. Seccin A a b 1.3491 -1.7903 B 0.0700 0.4633 C 0.0071 3.9948

| 83

F. Recta de regresin por mnimos cuadrados de los datos de concentracin de azcares reductores y concentracin de alcohol para los diferentes TRHs

Los pasos para aplicar la regresin de mnimos cuadrados fueron los seguidos en el apndice E.

75

Azucares (g/L)

60 45 A

30
15 0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 B C

Tiempo (das)
Figura F1. Segmentacin de la curva de consumo de azcares reductores para un TRH de 5 das.

La seccin A abarc del da 1 al 7, la seccin B los das 7 al 10 y la seccin C del da 11 al 25.

| 84

75

Azucares (g/L)

60 45 30 15 0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 B

Tiempo (das)
Figura F2. Segmentacin de la curva de consumo de azcares reductores para un TRH de 4 das.

La seccin A abarc del da 1 al 2, la seccin B los das 2 al 5 y la seccin C del da 5 al 25.

| 85

75

Azucares (g/L)

60 45

B 30 15 0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 C

Tiempo (das)
Figura F3. Segmentacin de la curva de consumo de azcares reductores para un TRH de 3 das.

La seccin A abarc del da 1 al 2, la seccin B los das 2 al 5 y la seccin C del da 5 al 25. Al aplicar la ecuacin [30] y [31] en las diferentes secciones se obtuvieron los valores de a y b mostrados en la Tabla F1.

| 86

Tabla F1. Valores de a y b de las diferentes secciones de la curva de concentracin de azcares reductores para los diferentes TRHs. TRH (das) a 5 b a 4 b a 3 b 65.9747 75.1212 6.9212 69.3078 -7.8947 92.2579 -13.8241 7.2523 0.0004 79.1200 -5.4119 19.7782 -17.3134 6.6565 0.0203 Seccin A -9.8954 B -1.1780 C 0.0075

| 87

10 C

Grado alcohlico ( Gay-Lussac)

8 6 4

A 2 0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27

Tiempo (das)
Figura F4. Segmentacin de la curva de produccin de alcohol para un TRH de 5 das.

La seccin A abarc del da 1 al 3, la seccin B los das 3 al 8 y la seccin C del da 8 al 25.

| 88

10 C

Grado alcohlico ( Gay-Lussac)

8 6 4 2 0 0

12

15

18

21

24

27

Tiempo (das)
Figura F5. Segmentacin de la curva de produccin de alcohol para un TRH de 4 das. La seccin A abarc del da 1 al 3, la seccin B los das 3 al 5 y la seccin C del da 5 al 25.

| 89

10 C

Grado alcohlico ( Gay-Lussac)

8 6 4 2 0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 A B

Tiempo (das)
Figura F6. Segmentacin de la curva de produccin de alcohol para un TRH de 3 das.

La seccin A abarc del da 1 al 3, la seccin B los das 3 al 5 y la seccin C del da 5 al 25.

| 90

Al aplicar la ecuacin [30] y [31] en las diferentes secciones se obtuvieron los valores de a y b mostrados en la Tabla F2.

Tabla F2. Valores de a y b de las diferentes secciones de la curva de concentracin de alcohol para los diferentes TRHs. TRH (das) a 5 b a 4 b a 3 b -0.8000 4.9052 8.0191 -2.6667 2.2000 2.6667 0.3137 8.0093 0.0006 -1.8333 3.0000 3.7843 1.0000 8.0149 0.0001 Seccin A 2.6667 B 0.5392 C 0.0004

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