Libro de Practicas

Farmacologa
Prcticas de laboratorio para alumnos universitarios

Ricardo Borges Jurado Profesor Titular de Farmacologa y Manuel Feria Rodrguez Catedrtico de Farmacologa Universidad de La Laguna Tenerife. Espaa.
R. Borges y M. Feria Universidad de La Laguna La Laguna, Espaa. 2005. ISBN. 84-689-2100-9 http://webpages.ull.es/users/rborges
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"The night before Easter Sunday of that year I awoke, turned on the light, and jotted down a few notes on a tiny slip of thin paper. Then I felt asleep again. It occurred to me at six o'clock in the morning that I had written down something most important, but I was unable to decipher the scrawl. The next night, at three o'clock, the idea returned. It was the experiment to determine whether or not the hypothesis of chemical transmission that I had uttered seventeen years ago was correct. I got up immediately, went to the laboratory, and performed a simple experiment on a frog heart according to the nocturnal design" Extrado de Otto Loewi: An Autobiographic Sketch (Univ. of Chicago Press, 1960)
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ndice.
I.II.III.Objetivos actuales de las prcticas de Farmacologa. Demostraciones o prcticas? Material necesario para demostraciones prcticas. 6 7 9
Prcticas 1.- Eliminacin de salicilatos en el hombre. 2.- Control farmacolgico de la glucemia. 3.- Accin de los diurticos en la rata. 4.- Evaluacin de un neurofrmaco. Demostraciones prcticas 5.- Evaluacin de los anestsicos locales en el cobayo. 6.- Accin de frmacos sobre el sistema cardiovascular de la rata anestesiada. 7.- Accin de los broncodilatadores en la rata anestesiada. 8.- Curvas concentracin-respuesta en la aorta de rata. 9.- Bloqueantes neuromusculares. 10.- Crono- e inotropismo de la aurcula de rata. 11.- Modificacin farmacolgica de la motilidad uterina. 12.- Tono vasomotor. 13.- Cuantificacin de antihistamnicos. Apndices. Bibliografa. 34 40 45 49 53 59 63 66 72 81 31 15 19 21 23
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I.-
Objetivos actuales de las prcticas de Farmacologa

La enseanza prctica de la Farmacologa ha evolucionado segn han ido
cambiando los propios objetivos de las carreras. En particular el uso masivo de animales de experimentacin, la escasez de espacio donde ubicar grandes salas de prcticas y la dificultad para acomodar sesiones de muchas horas de duracin en programas docentes muy sobrecargados han condicionado la aparicin de diversas alternativas a las prcticas tradicionales. En los ltimos aos, un sin nmero de programas de ordenador y vdeos explicativos han venido a sustituirlas. Por otro lado, la desidia y la comodidad de muchos docentes ha motivado el fraude que supone hacer pasar como prcticas a seminarios ms o menos tericos a fin de justificar el elevado nmero de horas asignadas por los programas oficiales a la enseanza prctica. Constituye la visualizacin de un vdeo una prctica? Entenderamos como prctica de Obstetricia a un programa de simulacin de un parto por ordenador? Creemos, no obstante, que las prcticas tienen un valor primordial en la formacin de los futuros profesionales sanitarios, bsicamente porque ensean que las cosas no son tan radicales y deterministas como pueda deducirse de los libros de texto o los programas de ordenador. La prevalencia de lo aprendido en las facultades se reduce a medida que utilizamos sistemas docentes ms alejados del medio natural. Existen bastantes estudios que demuestran que, finalizada la carrera, muy pocos alumnos logran recordar cul fue el contenido de una sesin de ordenador. El contacto directo con los alumnos se ha mermado sensiblemente en los ltimos aos, ello en gran parte se lograba a base de horas de conversacin durante las sesiones de prcticas. Una vieja gua pedaggica de la OMS recomendaba: "hablar a los estudiantes, hablar con los estudiantes y fomentar que los estudiantes hablen entre ellos". La llegada de las llamadas nuevas tecnologas ha venido en nuestra ayuda permitiendo realizar demostraciones experimentales antao vedadas por razones econmicas, de espacio o de disponibilidad de equipos. Hoy es posible implementarlas para grupos de alumnos suficientemente pequeos como para mantener con ellos un contacto directo con un coste econmico aceptable. En este libro abordamos varias prcticas y demostraciones prcticas a las que se les puede sacar un alto rendimiento docente. Algunas son adaptaciones de viejas preparaciones en rgano aislado o en animal anestesiado, solo que ahora se 6
Farmacologa: Prcticas de laboratorio para alumnos universitarios
emplea un nmero muy limitado de animales lo cual reduce los problemas ticos derivados del contacto directo de los alumnos con los animales. Estas enseanzas prcticas de la Farmacologa deben pues ser concebidas para satisfacer los siguientes objetivos: - Facilitar el aprendizaje de los aspectos de difcil comprensin. - Familiarizar a los estudiantes con el mtodo cientfico. - Ensear tcnicas y hbitos de laboratorio. - Motivar a los futuros profesionales hacia la investigacin y reclutar vocaciones cientficas.
II.-
Demostraciones o prcticas?
Aunque ya la masificacin ha desaparecido de la mayora de las facultades
y escuelas aun estamos lejos de reunir las cualidades idneas para llevar a cabo una adecuada enseanza prctica de la Farmacologa. Por un lado, la sencilla comparacin entre el nmero de horas legales disponibles y las necesarias para desarrollar esta actividad arrojan un resultado descorazonador. Trate el lector de impartir ocho o nueve prcticas, en grupos de treinta alumnos a un curso de cien, para que compruebe la dificultad de encontrar, si quiera, fechas para llevarlas a cabo. Por otro lado, trate de calcular el nmero de animales necesarios y su costo econmico (y moral) adems del esfuerzo personal del profesorado para que se comprenda la razn por la cual el nmero de prcticas se ha reducido, cuando no ha desaparecido completamente, de los estudios de Farmacologa. Las demostraciones ofrecen una feliz alternativa a alguna de estas prcticas y permiten realizar otras en la que la carencia de equipo y de personal entrenado las haca impracticables. Pngase por ejemplo una preparacin en bao de rganos, algunas de las demostraciones que aqu exponemos permiten en unas pocas horas realizar curvas concentracin-respuesta, ensear cmo hemos hecho los farmaclogos a lo largo de los aos para caracterizar una sustancia con actividad biolgica. De la misma manera una demostracin como el estudio del efecto de frmacos sobre la presin arterial nos faculta para discutir efectos, normas de administracin i.v. y repasar conceptos de fisiologa difcilmente explicables de otro modo. No obstante, se crre el riesgo de que el alumno pueda permanecer pasivo y alejado de lo que est ocurriendo en la sala. La demostracin se convierte entonces en un "vdeo en vivo", algo que sencillamente pasa ante sus ojos. Son las prcticas algo que motiva mucho ms a los estudiantes. Incluimos aqu incluso una para 7
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realizarse en ellos mismos. Tambin incluimos dos habitualmente excluidas de los curricula prcticos: la accin de frmacos con actividad diurtica y el efecto de sustancias hipoglucemiantes que sitan al estudiante ante problemas que estarn muy presentes en su futura actividad profesional. La ltima fase de una prctica o de una demostracin ha de ser la de ordenar, resumir y discutir lo realizado. Este apartado se manifiesta de forma especialmente satisfactoria en la prctica sobre la accin de frmacos sobre el SNC; en ella el alumno se enfrenta a la necesidad de discurrir para descubrir tras unas siglas un frmaco determinado. Podramos concluir que la adecuada combinacin de clases tericas, seminarios, tutoras, trabajos en equipo, demostraciones y prcticas constituyen una slida base docente en la enseanza de la Farmacologa de este comienzo de siglo. Nosotros hemos ensayado la imparticin simultnea de las clases tericas con las prcticas o las demostraciones con aparentes buenos resultados.
III.-
Material necesario para demostraciones prcticas. Una buena parte de los docentes de Farmacologa no estn familiarizados
con el uso y la terminologa inherente a la aplicacin de los ordenadores para la adquisicin de seales biolgicas. Si el lector no pertenece a este grupo de personas puede saltarse este captulo. Si existe un campo del saber en vertiginosa evolucin ese es el de la informtica. Los equipos, programas y sistemas se convierten en obsoletos en el transcurso de pocos aos, incluso meses. Sera muy poco prctico incluir aqu instrucciones de uso para equipos que probablemente ya no estn en uso cuando este libro vea la luz. No obstante, describiremos someramente los conceptos bsicos a tener en cuenta a la hora de comprar un equipo o poner en marcha alguno con las cosas que tenemos en el laboratorio. Equipo bsico. Para una demostracin con bao de rganos o con animal entero precisamos (adems lgicamente, de la preparacin) de un transductor y una unidad de acondicionamiento. Esta ltima est presente en todos los polgrafos del mercado (Grass, Gould, Letica, Harvard, Cibertec, etc...) y tambin puede adquirirse por separado a cualquiera de estas casas comerciales o a otras. Nosotros nos las hemos construido en un taller local.
Esquema electrnico de un transductor. Una fuente de alimentacin (tpicamente 5V) "alimenta" un puente de Wheatstone, una de cuyas resistencias es variable por la aplicacin de fuerza o movimiento. Dos potencimetros (resistencias variables) permiten cambiar la sensibilidad (ganancia) y balancear el puente. El puente genera una corriente de intensidad variable dependiente de la magnitud de la resistencia variable. Esta corriente es "convertida" a voltaje y amplificada.
Bsicamente, estas unidades "alimentan" el puente de Wheatstone del transductor y permiten amplificar y filtrar la seal as como situar el cero. Estos 9
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equipos tienen una salida analgica generalmente de 5 V. Es importante conocer esta ltima caracterstica a la hora de acoplar el equipo a nuestra tarjeta de adquisicin. Aunque el ordenador dispone de salidas de 5V, estas no poseen intensidad suficiente para alimentar los transductores, es por ello necesario el uso de las unidades de acondicionamiento. El esquema de montaje quedara como sigue:
Esquema bsico de montaje de un equipo. El/los transductores son alimentados y su seal amplificada en el acondicionador. El acondicionador puede ser un polgrafo estndar. La seal de salida se introduce en una tarjeta de adquisicin de datos. Generalmente se utiliza una caja de conexin para unir salidas (habitualmente BNC) a la tarjeta (habitualmente mediante un cablecinta). Diversos dispositivos comerciales incorporan la tarjeta digitalizadora en un mdulo externo que se conecta al ordenador por sus puertos (paralelo, SCSI, USB).
Buena parte del material necesario para el montaje de una demostracin prctica puede ser "reciclado" a partir de viejo material existente. Tarjetas de adquisicin. Las seales emitidas por los polgrafos o por los acondicionadores de seales son generalmente analgicas, es decir, una seal elctrica continua. Los ordenadores trabajan con nmeros, por lo que es necesario convertir la corriente analgica en una seal digital. Para ello se utilizan las tarjetas conversoras AD (analgico-digitales). A la hora de escoger una tarjeta debemos conocer dos caractersticas de las mismas: el nmero de bits y la velocidad de captura que permite. Adems, est la caracterstica del "bus" que no es otra cosa que el tipo de "enchufe" para el que est preparada. Hoy en da casi todas las tarjetas son PCI y son compatibles con todas las plataformas (Macintosh y PC). Nmero de bits. Esta caracterstica nos indica el nmero de puntos en los 10
que una seal puede ser convertida y viene indicado en potencias de 2. As una tarjeta de 12 bits tendr una resolucin de 21 2 o lo que es lo mismo 4.096 puntos. Esto significa que nuestra seal puede ser descompuesta en un rango de nmeros igual o menor a 4.096. Pongamos un ejemplo: - Un acondicionador emite una seal de 1 V cuando al transductor le aplicamos una fuerza (peso) de 1 g. Suponiendo que est algo por encima de la fuerza mxima que esperamos registrar y que hemos "optimizado" la tarjeta (ver ms adelante), la mxima resolucin que podramos obtener es 1/4.096 = 0,24 mV, o lo que es lo mismo 0,24 mg de tensin mnima observable. Generalmente esta resolucin es ms que suficiente para la mayora de las aplicaciones que necesitamos en Farmacologa. No obstante, es necesario ajustar la amplificacin de la tarjeta a estos valores. Esta modificacin generalmente puede hacerse por "software", es decir la propia tarjeta dispone de un pequeo programa para acomodar sus rangos. La mayora de las tarjetas son bipolares (es decir admiten voltajes positivos y negativos) y se ajustan a rangos de voltaje que van desde 0,1 a 10 V. Velocidad de adquisicin. Este parmetro nos indica la cantidad mxima de muestras que es capaz de adquirir en un segundo. Las tarjetas admiten varios canales pero generalmente su capacidad de adquisicin se divide en virtud del nmero de canales de entrada utilizados. De cualquier forma, la velocidad de casi todas las tarjetas est muy por encima de nuestros requerimientos. Por ejemplo: Una tarjeta "lenta" de 1 KHz podra llegar a adquirir 1000 muestras por segundo. Si recordamos que la mxima frecuencia de latido cardiaco de un roedor est en 500 latidos / min ( 8 / s) vemos que este no es precisamente un factor limitante. Una tarjeta decente en nuestros das puede adquirir a 100 KHz. El problema viene determinado por el consumo de recursos de procesamiento y de espacio de disco duro que representa el "sobremuestreo" es decir el tomar ms muestras de las necesarias. La gran capacidad de los modernos discos duros han reducido la importancia del sobremuestreo. Algo similar ocurre con la "precisin" que demos a los nmeros que adquiramos (sencilla, doble, etc...). Pongamos un par de ejemplos: - Una preparacin de aurcula aislada (demostracin 5) "late" como mximo a 5 latidos por segundo. Para lograr una buena resolucin necesitamos unos 10 datos por latido, as bastara con adquirir a 50 Hz, aunque generalmente es prctico adquirir a 5 veces ms velocidad. 11
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- Las contracciones de un anillo de aorta inducidas por noradrenalina (demostracin 3) tienen lugar en decenas de segundos. Por ello una velocidad de adquisicin de 1 Hz ser suficiente. Un "archivo" procedente de la demostracin prctica 5 que durase 3 horas, adquirido con precisin sencilla (32 bits) ocupara un espacio de disco duro de: 32 bit x 50 Hz x 3.600 s x 3 horas = 17,28 megabits. Dado que un bite son 8 bits ello nos arroja 2,18 Mb, algo ridculo para la capacidad de un disco duro actual. En el apndice B se indican los valores de adquisicin y los rangos de calibracin de algunos de los aparatos ms populares. Una alternativa muy asequible a las tarjetas de adquisicin son los sistemas basados en USB (Universal Serial Bus) o en FireWire. Estos admiten altas frecuencias de adquisicin (12 a 800 Mb/s dependiendo de los tipos). La ventaja de estos dispositivos radica en que no precisamos un bus para enchufar las tarjetas de modo que se pueden utilizar ordenadores porttiles o sin CPU (tipo iMac de Apple). Estos dispositivos son baratos y fciles de programar. Programas de adquisicin. Si los ordenadores quedan obsoletos en poco tiempo, los programas de todo tipo, incluidos los de adquisicin y tratamiento de datos lo hacen en menos. Sera intil tratar de hacer un catlogo de ellos hoy. Existen en el mercado muchas opciones. Tambin podemos escribir nosotros mismos los programas, aunque resulta una inversin notable de tiempo o encargrselo a alguien de nuestro entorno. Una solucin puede ser la de utilizar un programa de captura de datos concebido, inicialmente, para otra funcin como HPLC, espectroscopa, etc..., con la condicin que admita nuestro rango de seales, nuestras velocidades de muestreo y la duracin que asignemos al experimento. Los lenguajes de programacin "orientada a objetos" Labview (National Instruments, USA) Visual Basic, etc permiten implementar con cierta rapidez programas de captacin. Productos comerciales como el PowerLab (Maclab ) ofrecen una excelente solucin ya que incorporan la tarjeta de adquisicin y el programa lo cual permite la conexin directa con cualquier ordenador. Tenemos algunos programas desarrollados por nosotros de fcil manejo que podemos enviarlos, gratuitamente, bajo pedido. Requieren tarjeta de adquisicin (o 12
dispositivos con salida USB) y LabView (National Instruments). Vamos a dar una serie de orientaciones a la hora de elegir un programa. Ya hemos mencionado que en muchas ocasiones programa y tarjeta van unidos. Un programa de adquisicin debe: Adquirir: a la velocidad adecuada. Permitir hacer cambios de escala en la manera que lo hacemos en un polgrafo. Representar: Tener una buena calidad y un tamao de grfico que permita sacar el mayor rendimiento al nmero de "pixeles" de resolucin de la pantalla. Almacenar: Es interesante que el programa permita almacenar los datos de forma continua, ello nos facultar a utilizarlos en das posteriores en los casos de que la demostracin falle (la preparacin no responda o se produzca la muerte del animal). Los datos almacenados deberan poder ser ledos por otros programas grficos o estadsticos. Existen diversos formatos de grabado de datos: binario, texto, etc... Proyeccin. La llegada de los caones de vdeo ha resuelto gran parte los problemas de amplificacin de los registros en pantallas. Ya no son necesarios epidiscopos, proyectores de acetato ni siquiera grandes televisores o las pantallas de cuarzo lquido. La gran luminosidad de estos equipos permiten operar incluso con las luces de la sala encendidas, lo cual ayuda a la hora de tomar notas. Su precio, por otra parte ha cado bastante en los ltimos aos. La posibilidad de grabar pelculas en formato CD y DVD permite a los alumnos contemplar cmo se prepara una aurcula de rata o cmo se canaliza una cartida. En los ficheros adjuntos pueden encontrarse algunos ejemplos.
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PRCTICAS
I.
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1.- ELIMINACIN DE SALICILATOS EN EL HOMBRE

INFLUENCIA DEL pH URINARIO EN LA ELIMINACION DE ALGUNOS FRMACOS.
Objetivos. - Conocer la importancia que el pH urinario tiene en el grado de ionizacin de los frmacos y, por consiguiente, en su aclaramiento renal. - Discutir las implicaciones farmacocinticas y su potencial teraputico. Introduccin. Dependiendo del pH del medio y del pKa del frmaco, ste estar ionizado en mayor o menor grado en sangre y orina. Tras la filtracin glomerular slo las formas menos polares (menos ionizadas) tienen mayores posibilidades de ser reabsorbidas. Dada la presencia de grandes cantidades de tampones fisiolgicos, la ingesta de lcalis o de cidos va a alterar muy ligeramente el pH plasmtico, pero el rin corregir esos pequeos cambios con grandes modificaciones en la concentracin de hidrogeniones en el flujo urinario, alterndose el pH urinario. Dichos cambios estn previstos en la ecuacin de Henderson-Hasselbach: pH=pKa+log([base]/[cido]) - Para frmacos de naturaleza cida (salicilatos). pH=pKa+log([ionizado]/[no ionizado]) [2] - Para frmacos bsicos se invertir el cociente a [no-ionizado]/[ionizado]. Desarrollo. Los alumnos se distribuirn en grupos. Tres alumnos de cada grupo sern voluntarios para la experiencia. No entrarn en el grupo personas con problemas gastrointestinales (ulcus gastroduodenal, gastritis), historia de alergia o intolerancia a salicilatos. Tampoco mujeres con problemas de hemorragias menstruales ni sujetos que hayan tomado salicilatos en las ltimas 12 horas. Tampoco tomarn parte alumnos con problemas en su funcin renal. Cualquiera de estas contingencias debe ser informada al profesor. Cada grupo de prcticas recibir una gradilla con tubos de ensayo de 10 ml, una garrafa con 5 litros de agua, tres vasos calibrados, una probeta de 1l y tres vasos de precipitados de 50 ml. La gradilla contendr doce tubos, cuatro por sujeto experimental. Los tubos correspondientes al alumno "control" estarn rotulados en negro con la inscripcin [1]
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0, 20', 40' y 60' . Los correspondientes al alumno "acidtico" se rotularn en rojo y los del "alcaltico" en azul. Se precisar, un peachmetro, pipetas de 5 ml, un bao de laboratorio con capacidad para llegar a 100 C y un espectofotmetro. Se requiere una sobrecarga acuosa a fin de forzar la diuresis. Para no confundir los vasos calibrados rotulen cada uno con su nombre. Anoten en la tabla adjunta la hora en la cual les toca realizar cada una de las tareas. Los dems alumnos de cada grupo se distribuirn las funciones de desarrollo: cronometrador, analista, etc... En la casilla "Hecho" se anotar una marca cuando se haya llevado a cabo. Tiempo 0 min 60 min 100 min Hora Labor a realizar Hecho Tomar 750 ml de agua Colectar la orina, medir su volumen Ingerir igual volumen de agua Colectar la orina, medir su volumen Poner unos 30 ml en un vaso de precipitados y medir pH. Ingerir: - Acidtico: Agua + 10 g de bicarbonato sdico - Alcaltico: Agua + 3 g de cloruro amnico - Control: Agua El volumen de agua ha de ser igual al orinado Colectar la orina, medir su volumen y medir pH Tomar una muestra para medir salicilato en condiciones basales (tubo rotulado como 0') Tomar dos aspirinas de 500 mg en un volumen de agua igual al orinado Colectar la orina, medir su volumen , medir pH Tomar una muestra para medir salicilato (tubo rotulado como 20') Colectar la orina, medir su volumen, medir pH Tomar una muestra para medir salicilato (tubo rotulado como 40') Colectar la orina, medir su volumen, medir pH Tomar una muestra para medir salicilato (tubo rotulado como 60')
120 min
140 min 160 min 180 min
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Anlisis de salicilato en orina. 1- Colocar 30 ml de orina en un vaso de precipitados. Bajo control del p H y agitacin, aadir una gota de amonaco. Ajustar el pH a 70,5 con ClH 0,1 N. 2- Pasar 1 ml al tubo de ensayo correspondiente de la gradilla. 3- Se pone en un bao en ebullicin a 100 C. 4- Se deja enfriando la gradilla en una batea de agua. 5- Se aaden al tubo 5 ml de reactivo para salicilatos. Este reactivo contiene: nitrato frrico 4,4%, cloruro de mercurio 4% todo ello disuelto en cido clorhdrico 0,1 N. 6- La reaccin da un color cuantificable por fotometra a 525 nm. 7- Los valores de absorbancia obtenidos se compararn con la recta de calibracin. 8- La recta de calibracin se realiza con 100, 200, 300, 400 y 500 g/ml de salicilato sdico disueltos en orina basal (asegurarse que la orina no contiene salicilatos).
Los valores obtenidos se irn anotando en la tabla adjunta. 17
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Muestra
Volumen
pH
Absorbancia
Concentracin (g/ml)
Total acumulado
0 min 20 min 40 min 60 min
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2. CONTROL FARMACOLGICO DE LA GLUCEMIA

ACCION DE LOS HIPOGLUCEMIANTES EN LA RATA.
Objetivo. - Analizar el efecto hipoglucemiante de la insulina en ratas sin y con sobrecarga de glucosa. Tratamiento de la hiperglucemia. - Aprender el uso correcto de un sistema de medicin de glucemia a travs de tiras reactivas. Desarrollo. Utilizaremos Insulina humana mono componente (Actrapid H M) y glucosa en ratas Sprague-Dawley. Para la cuantificacin se emplear un medidor comercial de glucemia (Reflolux, Glucocard Memory-2) y las tiras reactivas correspondientes (BM-test-glycemia 20-800R, Glucocard Memory Strips). Cada grupo dispondr de 2 ratas en ayunas de 18 horas. Tras pesar e identificar los animales, se procede a extraer una muestra de sangre (0,05 ml) por puncin cardaca. En dichas muestras se determinarn los valores de glucemia basal. A continuacin, a la rata 1 se le administra una sobrecarga de glucosa (3 g/Kg) por (3g/ml en agua destilada) va i.p. y, a la rata 2, 3 UI de insulina por va i.m.. Rata 1: Se procede a extraer sangre a los 15 y 60 min tras la administracin de glucosa. Antense los valores de glucemia en la tabla. A continuacin, se administra a este animal 3 UI de insulina por va i.m., repitiendo la extraccin de sangre y determinacin de glucemia a los 30' de la administracin de la insulina. Rata 2: Se extrae la sangre a los 60 minutos de la administracin de la insulina y tras valorar la hipoglucemia, se administran 3 g/kg de glucosa. A los 30 minutos de esta administracin se extrae sangre nuevamente y se valora la glucemia. La valoracin de la glucemia se realiza por medio de un sistema rpido y automtico de lectura de tiras reactivas. Las tiras se impregnan en una zona sensible (o se toman por capilaridad segn el modelo de medidor) y tras un contacto de 30-60 segundos (mirar las instrucciones del medidor). Tras un tiempo mximo de 30 segundos aparece en la pantalla la glucemia en mg/dl. Para la
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determinacin de la glucemia es importante no realizar la extraccin de sangre hasta disponer de un aparato libre. Resultados. Glucemia Rata 1 Glucemia Rata 2 0 I+60' G+ 30' 0 15' 60'
Adicionalmente, cada alumno podr determinar su propia glucemia. A tal fin, deber limpiarse bien las manos con agua y jabn y alcohol etlico y extraer, usando una lanceta esterilizada, una gota de sangre de la yema de un dedo, procediendo a continuacin de la forma anteriormente descrita.
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3. ACCIN DE LOS DIURTICOS EN LA RATA

ESTUDIO DE LAS ACCIONES HIDROELECTROLTICAS DE LOS FRMACOS.
Objetivos. - Analizar el efecto de dos tipos diferentes de diurticos (de asa y ahorradores de K+ ) sobre la eliminacin urinaria de agua, Na+ y K+ . Material. Furosemida, diurtico de eficacia elevada cuya accin fundamental consiste en inhibir la reabsorcin de Na y Cl en la porcin ascendente del asa de Henle. (Seguril ampolla de 10 mg/ml). Triamtereno, diurtico de eficacia baja, cuya accin fundamental consiste en inhibir la reabsorcin de Na a nivel del tbulo contorneado distal y colectores. Como consecuencia, al no producirse el intercambio con K, disminuye la eliminacin de ste. (Salidur comprimidos; que deben desleirse y suspenderse en suero fisiolgico mediante agitacin enrgica. Lo administraremos a 5 mg/ml + 15 mg/ml de furosemida). Desarrollo. Cada grupo dispondr de 3 ratas, en ayunas de 24 horas. Tras pesar e identificar los animales se proceder como sigue: Rata 1: Administrar una sobrecarga hdrica, 40 ml/kg, de suero fisiolgico por va i.p.. Anotar la hora de administracin y colocar en una jaula de metabolismo. Rata 2: Administrar una sobrecarga hdrica similar y, a continuacin, por va i.p., 25 mg/kg de furosemida. Anotar la hora de administracin y colocar en una jaula de metabolismo. Rata 3: Administrar una sobrecarga hdrica similar y, a continuacin, por va i.p., 5 mg/kg de triamtereno + 15 mg/kg de furosemida. Anotar la hora de administracin y colocar en una jaula de metabolismo. Resultados. * EUP = Excrecin urinaria porcentual relativa a la sobrecarga hdrica administrada. EUP = (ml de orina recogida/ml de sobrecarga administrada) X 100. Al final de la experiencia, con la ayuda del papel de tornasol, se determinar el pH de la orina emitida y se guardar en envases debidamente identificados por 21
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grupo y tratamiento. Al da siguiente se determinar, por fotometra de llama, la concentracin de Na+ y K+ . Los resultados globales se entregarn en clase. Rata 1 Peso Sobrecarga (ml) Furosemida (h) Triamtereno + furosemida (h) 15' (ml y EUP) 30' (ml y EUP) 45' (ml y EUP) 60' (ml y EUP) 120' (ml y EUP) pH (orina final) Rata 2 Rata 3
En el apndice F, se presenta una tabla con los resultados tpicos de esta prctica. (h)= hora
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4. EVALUACIN DE UN NEUROFRMACO
REALIZACION DE UN MINI "SCREENING" FARMACOLGICO PARA CLASIFICAR FRMACOS CON ACTIVIDAD EN EL SNC.
Objetivos. - Conocer el uso y posibilidades de algunas tcnicas para la evaluacin de la actividad neurofarmacolgica. - Clasificar un frmaco en virtud de los resultados obtenidos tras analizar su efecto en roedores. Desarrollo. Se utilizarn ratas y ratones en unas sencillas pruebas de laboratorio. El alumno deber seguir las explicaciones del profesor acerca del funcionamiento de aparatos, entrenamiento de animales, mtodos de administracin de frmacos e interpretacin de los resultados. Cada grupo de alumnos recibir una pareja de tubos de ensayo (uno con las soluciones para inyectar ratones, otro para las ratas) conteniendo un slo frmaco a evaluar. Las soluciones a inyectar han sido preparadas para adaptarlas al muy diferente peso de ratas y de ratones. Dichos tubos estarn rotulados slo con unas siglas, tal y como habitualmente los envan para su caracterizacin farmacolgica los laboratorios de Qumica Farmacutica. Por lo tanto, el alumno va a desconocer qu es lo que est administrando (doble ciego). Se pesarn dos ratones y, tras identificarlos con una raya azul o roja en la base de la cola, se les inyectar, por va i.p., la cantidad correspondiente de frmaco segn cuadro adjunto. Pasados 10 minutos se proceder de igual forma con las ratas. Frmaco Dosis x peso (ml) Ratn 1,2 x p 3xp 1xp 5xp 1xp 1,5 x p 2xp 1,3 x p 1xp Rata 0,1 x p 0,2 x p 0,1 x p 0,4 x p 0,1 x p 0,15 x p 0,4 x p 1,2 x p 0,1 x p Posologa Ratn Inicio Inicio Inicio Inicio Inicio Inicio Inicio + 60' Inicio inicio Rata Inicio Inicio Inicio Inicio Inicio Inicio Inicio + 60' Inicio inicio
NO-21 PI-12B RAB-1 KJ-458 CO-13 K2-P QW-7 IF-2 YW-P
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Advertencia. estamos trabajando con neurofrmacos, cuya actividad va a variar enormemente con el estado emotivo del animal. Es preciso manejar los animales con exquisito cuidado, debe hablarse siempre en voz baja y slo lo imprescindible en el curso de la prctica. Si se ha fumado es preciso lavarse bien las manos con un jabn no oloroso antes de volver a la sala. A continuacin comenzarn a realizarse las siguientes pruebas:
TESTS DE PORSOLT (Actividad natatoria) -RatonesDesarrollado para evaluar efectos antidepresivos de frmacos, consiste en medir el tiempo de inmovilizacin de un ratn en situacin de "desesperanza". Para ello el da anterior se le introdujo en un bao de agua, a 21C, del cual no se puede salir, durante 15 minutos. Hoy el animal ya sabe que el nadar no le va a servir para nada. Se crea as una situacin de "desesperanza" que le lleva a dejar de luchar. Se sabe que los frmacos euforizantes y los antidepresivos incrementan el "tiempo de lucha". Desarrollo. Introducir el animal en el bao durante 6 minutos y cronometrar el tiempo de inmovilizacin. Se considera inmovilizacin al cese de actividad natatoria acompaado de arqueado del dorso. Anotar este tiempo en el cuadro adjunto. -El ratn no se va a ahogar-. Devolver el animal a su jaula y colocar sta en un lugar templado para que se seque rpidamente. Dejar el vaso limpio para el siguiente grupo. No pierdan tiempo, deben pasar rpidamente a las siguientes pruebas! Resultados. Ratn con raya roja Tiempo de inmovilizacin: Ratn con raya azul Tiempo de inmovilizacin:
MEDIDA DE ACTIVIDAD EN CAMPO ABIERTO -RataEn este sencillo test se evalan: la actividad espontnea y la exploratoria as como las defecaciones del animal en un recinto profusamente iluminado para que la presencia del observador modifique al mnimo la conducta del animal. El campo se halla dividido por tres crculos concntricos y sectores a la manera que se muestra en el dibujo. Se consideran deambulaciones externas, medias o internas a los pasos de un sector, o crculo a otro. 24
Deambulacin interna Deambulacin media Deambulacin externa Defecaciones
Desarrollo: colocar suavemente la rata en un borde del campo y contabilizar las deambulaciones y defecaciones sobre el mismo, a lo largo de 2 minutos. Analizar, simultneamente, las conductas de estereotipias segn la escala adjunta (leer antes de comenzar): ____________________________________________________________ A: Inactiva o dormida B: Actividad normal C: Actividad exploratoria (levantamiento, movimientos olfatorios) en un slo rea. D: Actividad exploratoria (levantamiento, movimientos olfatorios) en un rea amplia. E: Lamer el suelo o pared. F: Movimientos estereotipados de cabeza o extremidades. G: Como en F pero de forma exacerbada. ____________________________________________________________ Resultados: Rata con raya roja Rata con raya azul Deambulaciones externas: Deambulaciones medias: Deambulaciones internas: Defecaciones: Grados de estereotipias (puede haber ms de uno): Limpiar cuidadosamente la superficie del campo antes de introducir la segunda rata y dejar limpio el mismo para el siguiente grupo. Apagar la bombilla al terminar.
MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ESPONTANEA -RatasLos aparatos que miden la actividad espontnea se denominan actmetros. Existen actmetros de muchos tipos: rotatorios, por sensores de presin plantar, variaciones de resistencia elctrica, anlisis por vdeo, etc.. El que utilizaremos 25
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Varimex funciona contando las variaciones en el campo magntico que genera el animal al moverse. El aparato permite contar dos grupos de animales simultneamente. Para reducir los factores externos el aparato se halla ubicado en una habitacin insonorizada y con un ventilador funcionando para mantener un zumbido de fondo siempre presente. Desarrollo. Colocar los animales en las jaulas correspondientes, colocar los contadores en "0" y poner el mando de "counter" en posicin ON. Pasados 10 minutos, poner este mando en posicin OFF y anotar el nmero de cuentas. Resultados. Nmero de cuentas:
TEST DE LA PLACA CALIENTE -RatasEntre las pruebas para el estudio de la nocicepcin en animales, sta es una de las ms ampliamente utilizadas. El aparato consiste en un bao que enva agua caliente a una placa de metal mantenindola a 55 oC. La placa a esta temperatura en contacto con la piel produce dolor, se estimulan los nociceptores de las plantas de las patas del animal sin provocar quemaduras. (Pongan la mano sobre la placa para experimentarlo personalmente). Se valora el tiempo que transcurre hasta que el animal realiza conductas de evitacin o alivio (escape) tales como lamerse o agitar las patas o intentar saltar. Se considera que el lamido o la agitacin se corresponden con reflejos espinales, mientras que el salto es ya una conducta elaborada a nivel supraespinal. Desarrollo: Colocar al animal cuidadosamente sobre la placa y cronometrar, con precisin, el tiempo transcurrido hasta que el animal se lame o agita las patas y en su caso el tiempo que tarda en saltar. Independientemente de esto, y por motivos ticos, ningn animal debe permanecer ms de 60 segundos sobre la placa. Limpiar la placa antes de introducir el animal y dejarla limpia para el siguiente. grupo; la orina o heces puede provocar medidas errneas. Resultados. Rata con la raya roja Tiempo de lamido o agitacin: Tiempo al salto: Rata con la raya azul
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TEST DE LA RETIRADA DE LA COLA (Tail-flick) -RatasEste es otro de los test de analgesia ms frecuentemente empleado. Consiste en un foco calrico, generado por una lmpara de cierta potencia, que se aplica sobre el tercio distal de la cola del animal. El encendido de la lmpara pone en marcha un cronmetro que se detendr, de forma automtica por una clula fotoelctrica, cuando el animal mueva la cola para evitar el dolor. Es de vital importancia el tranquilizar al animal para evitar falsos positivos.
Desarrollo. Introducir al animal en el cilindro de inmovilizacin de medida ms adecuada y una vez tranquilo activar el aparato. Tomar el tiempo. Si por alguna razn el animal moviera la cola antes de tiempo, aplicar de nuevo el foco sobre otro punto del tercio distal de la cola. Resultados. Tiempo Rata con la raya roja: Rata con la raya azul:
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MEDIDA DE LA COORDINACION MOTORA (Rota-Rod) RatonesEsta es otra de las pruebas habituales en todo cribaje (screening) farmacolgico. Consiste en medir el tiempo en el que el animal es capaz de mantenerse sobre un cilindro que gira a velocidad constante. Un frmaco que afecte a la coordinacin motora reducir este tiempo. Estos ratones han sido previamente entrenados y en el curso del entrenamiento se desecharon los animales ms torpes. Desarrollo. Ajustar la velocidad a 10 rpm. Colocar los ratones, de espaldas al observador, sobre el cilindro girando. Poner en 0 el contador y levantar la plataforma para que el cronmetro comience a contar. Repetir la operacin con cada ratn 5-10 veces y tomar el tiempo ms largo. Si sobrepasa los 200 segundos retirar el animal y apuntar "200". Resultados. Ratn con raya roja Tiempo de cada Ratn con raya azul Tiempo de cada
ANTICONVULSIVANTES (Test del Cardiazol) -RatonesDos son las pruebas ms frecuentemente utilizadas para la evaluacin de sustancias con potencial anticonvulsivante: el electrochoque y la prueba del pentilnetetrazol (Cardiazol). El primero discrimina bastante bien la posible actividad teraputica sobre crisis generalizadas (gran mal) en tanto que el segundo lo hace sobre los frmacos capaces de proteger de las crisis de ausencia y mioclonas. Aunque se han desarrollado otras tcnicas ms complejas, estos test son sencillos, rpidos y bastante discriminatorios. El mecanismo de accin del Cardiazol no se conoce, pero parece afectar la estabilidad de las membranas. Desarrollo. Inyectar i.p. 80 mg/Kg de pentilnetetrazol a los ratones y registrar el tiempo de las primeras convulsiones y en su caso de muerte. No se consideran convulsiones pequeas sacudidas de duracin inferior a 5 segundos. Las convulsiones consisten en una serie de sacudidas con arqueamiento del dorso. Es posible que algunos animales mueran durante la prueba, deben recogerse en bolsas para llevarlos al incinerador. El resto de animales ya hayan terminado la prueba y pueden ser devueltos a sus jaulas. Colocarles biberones y comida.
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Resultados. Ratn con raya roja Nmero de convulsiones Ratn con raya azul Nmero de convulsiones En el apndice A: se indican los frmacos y dosis empleados
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DEMOSTRACIONES PRCTICAS
II.
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5. EVALUACIN DE LOS ANESTSICOS LOCALES EN EL COBAYO Objetivos: - Conocer el mecanismo de accin de algunos frmacos anestsicos locales y el efecto de su co-administracin con agentes vasoconstrictores. - En concreto, utilizaremos una amida: la bupivacana y un vasoconstrictor: la adrenalina (Svedocain 0,25 con y sin vasoconstrictor). - Se resaltar el uso de distintas vas de administracin y sus peligros. - Se har hincapi en la decisin o no de asociar vasoconstrictores. Desarrollo. Los nervios sensoriales son en general ms sensibles a los anestsicos locales que los motores. Una de las preparaciones ms sencillas para demostrar la profundidad de su efecto y el tiempo que tarda en perderse es el reflejo cutneo. Para ello se suele preferir un animal tranquilo como el conejo o el cobaya. Hoy utilizaremos ste ltimo. Aunque la sensibilidad no es igual en todas las regiones de la piel, por razones prcticas vamos a obviar este aspecto.
Disposicin del equipo para realizar la demostracin del efecto de los anestsicos locales. Con el fin de incrementar la visibilidad en la pantalla, mantenemos la sala en penumbra e iluminamos la espalda del cobaya con luz fra para no recalentar la piel del animal.
El da anterior afeitamos la regin de la espalda de dos cobayas para poder observar mejor el reflejo cutneo. La razn de esperar 24 horas se debe a la irritacin que cualquier sistema de depilado provoca en la piel. 31
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Se coloca la cmara de vdeo a una distancia de 45 cm de la espalda del animal a fin de tener una visin global de la misma. Seleccionar el modo de autoenfocado. Lo mejor es llevar a cabo una iluminacin local con una lmpara que d poco calor (luz fra, preferiblemente) a fin de mantener la sala ligeramente a oscuras para seguir la demostracin en la pantalla (ver esquema de preparacin). Con un rotulador indeleble dibujaremos tres crculos como se indica en la figura. Aunque el cobaya es, en general, un animal tranquilo, intentaremos en lo posible no hacer ruidos (hablar, golpes en las mesas, etc...) a fin de alterar lo menos posible los resultados. La inyeccin del frmaco se realiza con una jeringa de insulina penetrando apenas 3 mm en sentido prcticamente tangencial a la piel, de manera que inyectemos el frmaco entre la dermis y la epidermis. Es importante comprobar que no hemos pinchado un vaso sanguneo, tirando hacia atrs del mbolo previamente a la inyeccin. El volumen de inyeccin ser de 200 l procurando que la punta de la aguja alcance el punto medio del crculo. Ello va a producir un pequeo habn.
Frmacos a estudiar. - Vehculo: cloruro sdico al 9 (suero fisiolgico) - Bupivacana (Svedocain 0,25 sin vasoconstrictor) - Bupivacana + adrenalina (Svedocain 0,25 con vasoconstrictor (5 g/ml) A los cinco minutos del inicio de cada inyeccin haremos la prueba de anestesia. Para ello tomaremos una aguja de insulina (26 28G) y la pasaremos suavemente sobre el centro del crculo. Repetiremos la prueba seis veces sobre el crculo y la compararemos con otra zona a la misma altura del dorso. Las respuestas son todo-o-nada, es decir pondremos 6/3 para decir que de seis veces en tres hallamos respuesta. Se irn anotando en la tabla adjunta, considerando como 0 min el 32
momento en el cual comenzamos el registro. Es mejor que haya un alumno controlando los tiempos y los dems anotando los datos. Es importante consensuar lo que se entiende por reflejo y lo que no lo es. En general se aprecia una contraccin cutnea refleja similar a un temblor local pero es preciso objetivar lo ms posible estas respuestas. Suero Cobaya Zona no tratada 0 min 15 min 30 min 45 min 60 min 1h, 15 min 1h, 30 min 2h Ntese que existen diferencias entre ambos cobayas pese a hacer la prueba en las mismas condiciones. La variabilidad individual se valora por medio del anlisis estadstico. Si tras una hora de seguimiento se ha revertido el efecto puede interrumpirse la demostracin. Los resultados se comentarn con el profesor. 1 2 Bupivacana 1 2 Bupivacana + Adrenalina 1 2
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6. ACCIN DE FRMACOS SOBRE EL SISTEMA CARDIOVASCULAR DE LA RATA ANESTESIADA

EFECTO DE ALGUNOS FRMACOS SOBRE LA FRECUENCIA CARDIACA Y LA PRESIN ARTERIAL.
Objetivos. - Conocer el mecanismo de accin de algunos de los frmacos con actividad sobre la presin arterial. En concreto estudiaremos la accin de: 1- Agonistas y antagonistas colinrgicos. 2- Agonistas y antagonistas adrenrgicos. 3- Vasoconstrictores y vasodilatadores de accin directa. - Resaltar las precauciones de la administracin por vas i.p. e i.v. - Aprender algunos usos de la anticoagulacin y anestesia. - Discutir algunos problemas derivados de la experimentacin en Farmacologa. Material y mtodos. Se anestesia una rata con pentobarbital-sdico (50 mg/Kg, ip). Se canulan la vena femoral, la arteria cartida comn y se practica la traqueotoma. Utilizaremos la va venosa para infundir sustancias, la arteria cartida para medir la presin arterial y frecuencia cardiaca. Se utiliza heparina sdica (250 U/Kg) i.v. para mantener al animal anticoagulado. De la misma manera, las cnulas estn llenas de suero fisiolgico (ClNa al 0,9%) heparinizado (250 U/l). Se mantendr una bombilla encendida sobre el animal para evitar la hipotermia causada por los barbitricos. La cnula arterial se conecta a un transductor de presin y ste a un polgrafo. Por medio de una tarjeta de adquisicin de datos sita en un ordenador proyectaremos los registros en la pantalla. El trazo rojo corresponde a la presin arterial y el azul a la frecuencia cardiaca. Todos los frmacos estarn disueltos en suero fisiolgico. Las dosis, concentraciones y los cuidados para su preparacin se encuentran en el apndice B. Advertencia preliminar. El rendimiento que el alumno obtendr de esta demostracin se incrementar notablemente si previamente se han repasado los temas de 34
Farmacologa del sistema nervioso vegetativo correspondientes, y participa activamente en la demostracin. Desarrollo. En este guin se muestran una serie de grficas milimetradas para ir plasmando en ellas los resultados obtenidos. Se acompaar de todas las notas que estime procedentes. La escala est expresada en mm de Hg y calibrada de 0 a 250. La frecuencia cardiaca de 0 a 500 lpm. La escala temporal se ajusta a 1 cm (2 cuadros) por minuto. Ejemplo:
Abreviaturas. SF= Suero fisiolgico ACh= Acetilcolina Ad= Adrenalina Na= Noradrenalina Ip= Isoproterenol
Atr= Fen= Pro= AII=
Atropina Fentolamina Propranolol Angiotensina II
1- Accin de los excipientes y vehculos. SUERO FISIOLGICO. Se inyecta 0,05 ml de SF ni muy rpido ni muy lento (unos 2 segundos). Esta maniobra es el control volumtrico. Si se observasen cambios en la PA o en la FC habra que descontarlos cuando inyectemos frmacos.
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2- Acciones de frmacos con actividad colinrgica. ACETILCOLINA. Se inyectarn 0,1; 1 y 10 g/Kg en bolos de 0,05 ml separados al menos un minuto y siempre que el efecto del anterior haya concluido. Tras la inyeccin de cada dosis (y de aqu en adelante) se inyectarn 0,05 ml de suero fisiolgico a fin de "lavar" el contenido de la cnula.
ATROPINA. A lo largo de 5 minutos y de forma muy lenta se administrar atropina a una dosis muy grande (3 mg/Kg).
ACETILCOLINA EN PRESENCIA DE ATROPINA. Se repetir la administracin de acetilcolina comenzando con 1 g/Kg y siguiendo con 10, 100 y 1000 g/Kg.
En la grfica inferior iremos representando los valores de reduccin de presin en presencia y en ausencia de atropina. 36
3. Acciones de frmacos con actividad adrenrgica. ADRENALINA. Se inyectarn 0,05; 0,5 y 5 g/Kg en bolos de 0,05 ml separados al menos un minuto y siempre que el efecto del anterior haya concludo.
NORADRENALINA. Se inyectarn 0,05; 0,5 y 5 g/Kg en bolos de 0,05 ml separados al menos un minuto y siempre que el efecto del anterior haya concluido.
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ISOPROTERENOL. Se inyectar una nica dosis de 1 g/Kg. Este efecto va a durar considerablemente ms que los anteriores, por lo que habremos de esperar, al menos, 5 min antes de pasar al siguiente frmaco.
FENOXIBENZAMINA. Siguiendo las mismas precauciones observadas con la atropina (inyeccin muy lenta a lo largo de 5 min) se administrar 1 mg/Kg de fenoxibenzamina. Tras lo cual dejaremos otros 5 minutos de tiempo para la "impregnacin" con el frmaco.
ESTIMULACIN FENOXIBENZAMINA.
ADRENERGICA
EN
PRESENCIA
DE
Se administrarn en el siguiente rden: adrenalina (5 g/Kg); noradrenalina (5 g/Kg) e isoproterenol (1 g/Kg).
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PROPRANOLOL. Siguiendo las mismas precauciones observadas con la fenoxibenzamina y la atropina (inyeccin muy lenta a lo largo de 5 min) se administrar 1 mg/Kg de propranolol. Tras lo cual dejaremos otros 5 minutos de tiempo para la "impregnacin" con el frmaco.
ESTIMULACIN PROPRANOLOL.
ADRENERGICA
EN
PRESENCIA
DE
Se administrarn, como con la fenoxibenzamina, en el siguiente rden: adrenalina (5 g/Kg); noradrenalina (5 g/Kg) e isoproterenol (1 g/Kg). Es muy probable que la rata presente una presin arterial muy baja e incluso que muera en esta parte de la demostracin.
AGENTES VASOCONSTRICTORES DIRECTOS. Se administrar angiotensina II a la concentracin de 0,1 g/Kg endotelina I a la misma concentracin.
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7. ACCION DE LOS BRONCODILATADORES EN LA RATA ANESTESIADA.

ANALISIS DE LA RESPUESTA BRONQUIAL ANTE ESTMULOS BRONCOCONSTRICTORES Y SUS ANTAGONISMOS.
Objetivos. Se pretende que el alumno conozca el mecanismo de accin de algunos de los frmacos broncodilatadores utilizados comnmente en la clnica. De forma razonada, se demostrar como se alteran la presin de insuflacin y la arterial en respuesta a broncoconstrictores y broncodilatadores, utilizando como modelo experimental la rata anestesiada. Discutiremos igualmente: - La administracin por vas ip, iv e inhalatoria. - La anticoagulacin, anestesia, bloqueo neuromuscular. - Los problemas derivados de la experimentacin en Farmacologa. Material y mtodos. Se anestesia una rata con pentobarbital-sdico (50 mg/Kg, ip). Se canula la vena femoral y se practica la traqueotoma. Utilizaremos la va venosa para infundir sustancias y la cnula de traqueotoma para conectar un respirador. Se administran 100 g/Kg de d-tubocurarina a fin de causar la parlisis muscular y se conecta al animal a un respirador volumtrico para roedores. Se ajusta el volumen de insuflacin al 0,8% del peso del animal y se ajusta la frecuencia del respirador a 70 ppm. En el circuito de entrada de gases se ha intercalado un reservorio cuyo volumen ser 9 veces mayor del flujo (en ml/min) de mezcla anestsica administrada. Utilizaremos este reservorio para administrar los inhaladores, segn el dibujo. En el tubo de entrada (insuflante) del circuito se intercala un transductor para registrar la presin que oponen los pulmones a la entrada de gases. Opcionalmente, podemos registrar, igualmente, la presin arterial y la frecuencia cardiaca mediante una cnula insertada en la cartida comn y conectada a un transductor de presin (ver prctica de presin arterial).
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Esquema de un respirador para roedores. Al animal anestesiado se le practica traqueotoma. A la cnula traqueal se le conectan las mangueras del respirador. Para reducir espacio muerto los tubos de llegada y de retirada del aire se conectan en Y justo al extremo de cnula. Un reservorio de agua se intercala en el circuito a fin de actuar como vlvula y evitar sobrepresin. No se muestra la cmara-reservorio donde se administran los aerosoles.
la el la la
El registro debe mostrar las seales correspondientes a la presin de insuflacin, la aparicin de artefactos indicaran la presencia de "lucha contra el respirador" que debe ser tratada con ms anestesia y/o tubocurarina. Todos los frmacos estarn disueltos en suero fisiolgico. Las dosis, concentraciones y los cuidados para su preparacin se encuentran en el Apndice D. Advertencia preliminar. El rendimiento que el alumno obtendr de esta demostracin se incrementar notablemente si previamente se han repasado los temas de Farmacologa correspondientes, y se participa activamente en la demostracin. Desarrollo. En este guin se muestra una serie de grficas milimetradas para ir plasmando en ellas los resultados obtenidos. La escala temporal se ajusta a 1 cm (2 cuadros) por minuto. 1- Accin de los excipientes y vehculos. SUERO FISIOLGICO. Se inyecta 0,05 ml de SF ni muy rpido ni muy lento (unos 2 segundos). Esta maniobra es el control volumtrico. Si se observasen cambios en la PA o en la FC habra que descontarlos cuando inyectemos frmacos.
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Presin de insuflacin (cm H2O)

.
20
10
2- Accin broncoconstrictora colinrgica. METACOLINA. Se inyecta 0,05 ml de una solucin de metacolina 1, 3 y 10 g/mL.
20
10
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METACOLINA TRAS NEBULIZAR CON SALBUTAMOL. Se administran dos breves dispensaciones con un aerosol dosificador de salbutamol (Ventoln), separadas 30 segundos, en el reservorio de la bomba de respiracin. A continuacin se inyecta 0,05 ml de una solucin de metacolina 1, 3 y 10 g/mL. Comparamos el efecto con los registros anteriores. Estamos evaluando dos frmacos con efectores diferentes (antagonismo fisiolgico). Estdiese con especial cuidado el efecto del salbutamol sobre la frecuencia cardiaca, especialmente tras la segunda aplicacin.
20
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METACOLINA IPRATROPIO.
TRAS
NEBULIZAR
CON
BROMURO
DE
Se administran dos breves dispensaciones con un aerosol dosificador de bromuro de ipratropio (Atrovent), separadas 5 segundos, en el reservorio de la bomba de respiracin. A continuacin se inyecta 0,05 ml de una solucin de metacolina 1, 3 y 10 g/mL. Comparamos el efecto con los registros anteriores. Ntese que el efecto del ipratropio se restringe al rbol respiratorio, mientras los efectos de la metacolina siguen siendo similares sobre la presin arterial y la frecuencia cardiaca.
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10 20 0
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8. CURVAS CONCENTRACION-RESPUESTA EN LA AORTA DE RATA

ANALISIS DE LA RESPUESTA CONTRACTIL DE LOS AGONISTAS 1 SOBRE UNA PREPARACION DE AORTA DE RATA AISLADA.
Objetivos. -Conocer el uso y posibilidades de las tcnicas de rgano aislado. Bao de rganos, transductores. Contraccin isomtrica, isotnica y auxotnica. -Aprender cmo se construyen las curvas concentracin-respuesta para agonistas y para antagonistas. -Recordar los mecanismos de accin de los agonistas 1 sobre el tono vasomotor.
O2 + CO2
Esquema de un bao de rganos "clsico"
Bao de rganos. Consiste en una copa de vidrio en la cual se aloja un tejido (en nuestro caso contrctil) en condiciones de temperatura, pH, oxigenacin y contracciones del tejido. A lo largo de la Historia de la Farmacologa se han ido desarrollando y caracterizando diversas preparaciones para el estudio de receptores para frmacos y sistemas de transduccin intracelular. Las preparaciones se encuentran "baadas" en un lquido fisiolgico isotnico cuya composicin intenta remedar al fluido intersticial y que vara de una preparacin (o autor) a otra. As se han ido desarrollando las soluciones de Ringer, Locke, Krebs, Jaln, etc... Nosotros emplearemos la solucin de Krebsbicarbonato: 45 nutrientes controladas. Permite el cambio rpido de solucin nutricia y el registro de las
Borges y Feria
NaCl KCl MgSO4 KPO4 H2 CaCl2 NaCO3H Glucosa
[en mM] 119 4,7 1,2 1,2 2,5 25 11
La solucin se burbujea continuamente con carbgeno (95% O2 + 5% CO2 ), ello asegura la oxigenacin y el mantenimiento del pH. Con frecuencia aadimos rojo de fenol como indicador de pH. La preparacin se mantiene a 37C. Antiguamente se registraban las contracciones sobre tambores giratorios de papel ahumado o con tinterillos como los mostrados en el dibujo. Hoy se recurre a transductores y a equipos informticos. Los transductores son aparatos que transforman la respuesta (contrctil en nuestro caso) en corriente elctrica. De esta forma permiten amplificar y registrar la contraccin. Existen tres tipos fundamentales: isomtricos, isotnicos y transductor es isomtrico o isotnico puro. auxotnicos o mixtos. Ningn
Transductores. Los transductores se denominan isotnicos cuando operan contra una fuerza constante: registran movimiento; auxotnicos cuando operan contra una fuerza gradualmente mayor: registran fuerza y movimiento. Los transductores isomtricos trabajan sin desplazamiento: registran fuerza. Generalmente estos ltimos transductores requieren de un sistema piezoelctrico para mantener las condiciones isomtricas.
Preparacin del tejido. Se sacrifica una rata. Se desangra y se extrae la aorta torcica. En una placa de Petri, llena de solucin de Krebs, se limpia el tejido cuidadosamente y se cortan segmentos de unos 2-3 mm de largo. Los segmentos se 46
montan en la copa de bao como se indica en la figura y se le conecta a un transductor isomtrico aplicndole una pretensin de 2 g.
Al transductor
4 ml Llave de paso Anillo de aorta

Bao de rganos, detalle.
Aplicacin de frmacos. Se utilizan habitualmente dos mtodos para la aplicacin de frmacos, dosis repetidas y dosis acumulativas. En la primera es necesario "lavar" la preparacin tras cada dosis y esperar hasta que la arteria se relaje. En la segunda, el mtodo que utilizaremos hoy, las concentraciones se aplican de forma creciente y acumulativa. Para lograr una nueva concentracin es necesario tener en cuenta la concentracin de frmaco presente en el bao. Para una copa de bao con un volumen de 4 mL. Vamos a comenzar con concentraciones muy bajas de fenilefrina, un agonista 1 , 10-9 (1 nM). Disponemos de una batera de tubos de ensayo de fenilefrina concentrada. Para alcanzar 1 nM en 4 ml de volumen de bao, aadimos 40 l de solucin 10-7, es decir diluimos 100 veces una solucin 100 veces ms concentrada. Ahora hay 10-9 M de fenilefrina en el bao. Para incrementar la concentracin a 10-8, aadiremos 36 l de la solucin 10-6 y as sucesivamente. Cuando la aorta haya alcanzado una contraccin estable incrementaremos la concentracin diez veces y as hasta alcanzar una contraccin que ya no se incrementar por ms que aadamos ms frmaco. Se pueden administrar concentraciones intermedias. En estos casos debe recordarse que el punto equidistante entre 10-7 y 10-6 M no es 5x10-7 sino 3,33x10-7, ya que 5x10-7 es 5 veces 10-7 y slo 2 veces 10-6. Una vez alcanzado el efecto mximo lavaremos generosamente las preparaciones y repetiremos la curva transcurridos unos 30 40 minutos. 47
Borges y Feria
Estudio del antagonismo competitivo por prazosina de la contraccin inducida por fenilefrina. La prazosina es un antagonista competitivo selectivo 1. Para analizar este antagonismo incubaremos una de las preparaciones con 10-6 M de prazosina durante 15 minutos antes de repetir la curva con fenilefrina. En la grfica en papel milimetrado adjunto se irn anotando los resultados de las primeras y segundas curvas en ausencia (control) y en presencia de prazosina.
Estudio del antagonismo no-competitivo por fenoxibenzamina de la contraccin inducida por fenilefrina. La fenoxibenzamina comienza a comportarse como un antagonista competitivo no selectivo . Sin embargo su bloqueo se torna irreversible si dejamos suficiente tiempo de incubacin. Para analizar este antagonismo incubaremos una de las preparaciones con 10-6 M de fenoxibenzamina durante 15 minutos antes de repetir la curva con fenilefrina. En la grfica en papel milimetrado adjunto se irn anotando los resultados de las primeras y segundas curvas en ausencia (control) y en presencia de fenoxibenzamina. Con la ayuda del profesor analizaremos los resultados. 48
9. BLOQUEANTES NEUROMUSCULARES.
ANALISIS DE LA ACCIN DE LOS FRMACOS BLOQUEANTES NODESPOLARIZANTES Y DESPOLARIZANTES, AS COMO SU REVERSIN POR AGENTES INHIBIDORES DE LA ACETIL-COLINESTERASA EN LA PREPARACIN NERVIO FRNICO-DIAFRAGMA.
Objetivos: Hoy estudiaremos algunos frmacos que ejercen su accin bloqueando los receptores nicotnicos de la placa motora. Utilizaremos una preparacin clsica: nervio frnico-diafragma de rata. Esta preparacin reproduce in vitro lo esperable tras la infusin in vivo. Como se explicar en su momento en clase, existen dos grandes familias de bloqueantes: No despolarizantes (tambin llamados curares, paquicurares o competitivos) el prototipo es la d-Tubocurarina.
Despolarizantes (tambin llamados leptocurares o no competitivos) el prototipo es la Succinilcolina.
La demostracin incluir tambin un
agente antagonista
de
la
acetilcolinesterasa. La lista de estos agentes es larga y los clasificamos en reversibles (fisostigmina, neostigmina, edrofonio) y los irreversibles (paratin, malatin, DFP). Los primeros tienen usos clnicos, los segundos inters toxicolgico por su uso como insecticida y como gases de guerra. Hoy utilizaremos la neostigmina:
49
Borges y Feria
Desarrollo: Como dijimos utilizaremos la preparacin nervio frnicodiafragma mantenida en bao de rganos de manera similar a lo explicado para el tero de rata en la ltima sesin. Utilizaremos un transductor isomtrico y una tensin basal de 1 g. El hemidiafragma izquierdo se inserta en una varilla de soporte y aireacin, el nervio se pasa por unos electrodos de platino para realizar su estimulacin elctrica. La porcin dorsal del msculo se ata al transductor. La solucin se baa en una solucin de Krebs (una solucin salina tamponada con bicarbonato) cuya composicin es [mM]: ClNa, [119]; ClK, [4,7]: SO4Mg, [1,2]: PO4H2K, [1,2]; Cl2Ca, [2,5]; CO3HNa, [25]; Glucosa [11] y se burbujea con carbgeno (95% O2 + 5% CO2) para que se estabilice el pH en 7,4. La estimulacin la realizaremos con un voltaje supramaximal 50% y pulsos cuadrados de 1 ms de duracin siguiendo el patrn siguiente:
Esquema del montaje de la preparacin nervio frnico-diafragma de rata. El nervio es pasado por un electrodo bipolar conectado a un estimulador. La costilla que define el ngulo inferior se inserta en la varilla soporte. La solucin se burbujea con carbgeno.
50
- Contracciones simples. 0,1 Hz - Tren de cuatro (t/4): cuatro estmulos a 0,5 Hz - Ttano: 5s a 50 Hz
Esquema de la aplicacin de los estmulos elctricos a la preparacin. Para evaluar el tren de cuatro (t/4) se haya la razn entre el primero y el cuarto de los pulsos. En el ttano se haya, igualmente, el decaimiento observable en la onda tetnica tpico del bloqueo por curares. La potenciacin postetnica, observada en el primer pulso tras el ttano es tambin caracterstica del bloqueo por curares. En la parte inferior se muestran las frecuencias de aplicacin.
Estudiaremos el efecto sobre estos parmetros y antagonistas.
valoraremos la
sensibilidad de los mismos, la potenciacin post-tetnica y la reversin o no por Los registros se proyectarn en la pantalla. Para dejar suficiente espacio en el registro, los trazos de las contracciones simples aparecern muy unidos unos a otros. Las concentraciones a utilizar son: d-Tubocurarina: 0,1; 0,3;1; 3, 10 y 30 M (de forma acumulativa). Suxametonio: 1; 3; 10; 30 y 100 M (de forma acumulativa). Neostigmina: 10 M (en presencia de 3 M de d-Tubocurarina). El alumno deber ir rellenando las grficas que se muestran a continuacin.
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Preparacin 2
Preparacin 1
Preparacin 2
Preparacin 1
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10. CRONO- E INOTROPISMO EN LA AURCULA DE RATA

ACCIONES DE DIVERSOS FRMACOS EN UNA PREPARACIN DE MSCULO CARDIACO AISLADO.
Objetivos. - Conocer el uso y las posibilidades de las tcnicas de rgano aislado en bao de rganos para cuantificar las acciones cardiacas de los frmacos. -Estudiar los efectos sobre el crono y el inotropismo de agonistas y antagonistas adrenrgicos y colinrgicos. Tambin utilizaremos un glucsido: la ouabana. Desarrollo. Se sacrifica la rata, se abre el trax cortando las costillas al lado izquierdo del esternn. Se toma el pex cardiaco con unas pinzas y se cortan los grandes vasos. Se extrae el corazn lo ms rpidamente posible y se introduce en un vaso de precipitados, de unos 20ml, conteniendo solucin de Ringer atemperada y recin oxigenada con carbgeno (95% O2 + 5% CO2): [mM] NaCl KCl CaCl2 MgCl2 NaCO3H Glucosa 125 5,6 1.1 1.2 25 11
El corazn continua latiendo bombeando la sangre y reemplazndola por la solucin de Ringer. Despus se pasa a una placa de Petri llena de Ringer y se procede a retirar todo el tejido excepto las dos orejuelas que quedan unidas, por su parte central, por un pequeo fragmento de tejido. Con rapidez las atamos y las colocamos en la copa del bao de rganos, atemperada a 30C. El montaje se explica en la figura inferior. Se tensa la preparacin hasta alcanzar 1 g. La preparacin late de forma espontnea. Aunque tambin se aprecian cambios en la fuerza de contraccin, esta preparacin se utiliza bsicamente para evaluar el efecto cronotrpico de los frmacos. Recordemos que el corazn es particularmente rico en receptores adrenrgicos 1, muscarnicos M 2 e histamnicos H2.
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Borges y Feria
Los frmacos se aplicarn con una micropipeta. Dado que el volumen de Ringer en la copa es de 4 mL, para obtener la concentracin deseada pipetearemos 40 l de una solucin 100 veces ms concentrada. La aplicacin de frmacos ha de hacerse procurando no tocar la preparacin para no estropear el registro.
Ligadura de las orejuelas para su colocacin en el bao (reproducido de ref #1).
Los resultados se irn anotando en la grfica. Utilcese la superior para registrar la tensin y valorar el inotropismo y la inferior para la frecuencia y valorar el cronotropismo.
Disposicin de la aurcula de rata en el bao de rganos. El extremo correspondiente a la aurcula derecha se ata a la varilla soporte (que tambin conduce la oxigenacin) y el izquierdo al transductor isomtrico bajo una tensin basal de 1 g. El volumen de la copa queda fijado en 4 ml por el rebosamiento de la misma. La copa est atemperada a 30C.
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PRIMERA COPA DEL BAO
SEGUNDA COPA DEL BAO
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PRIMERA COPA DEL BAO
SEGUNDA COPA DEL BAO
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En la tabla inferior iremos recogiendo los resultados, primero en trminos absolutos y en la segunda tabla en porcentajes del control sin frmacos: PRIMERA COPA Fuerza Frecuencia
Control Metacolina 1M Atropina 0,1 M + Metacolina 1M Isoproterenol 0,1 M Isoproterenol 0,1 M Fentolamina 0,1 M + Isoproterenol 0,1 M + Isoproterenol 1 M Atenolol 0,1 M + Isoproterenol 0,1 M + Isoproterenol 1 M Ouabana 100 nM
SEGUNDA COPA Fuerza Frecuencia
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Control Metacolina 1M Atropina 0,1 M + Metacolina 1M Isoproterenol 0,1 M Isoproterenol 0,1 M Fentolamina 0,1 M + Isoproterenol 0,1 M + Isoproterenol 1 M Atenolol 0,1 M + Isoproterenol 0,1 M + Isoproterenol 1 M Ouabana 100 nM
PRIMERA COPA Fuerza Frecuencia 100 100
SEGUNDA COPA Fuerza Frecuencia 100 100
Con la ayuda del profesor se analizarn los datos.
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11. MODIFICACIN FARMACOLGICA DE LA MOTILIDAD UTERINA

ACCIONES DE DIVERSOS FRMACOS EN UNA PREPARACIN DE TERO DE RATA.
Objetivos. - Conocer el uso y las posibilidades de las tcnicas del rgano aislado y la forma de cuantificar sus respuestas contrctiles. - Diferenciar las contracciones isomtricas, isotnicas y auxotnicas. - Recordar las acciones farmacolgicas de los agonistas y antagonistas muscarnicos y simpticos sobre la motilidad uterina. - Estudiar las acciones fisiolgicas y farmacolgicas de la oxitocina sobre el tero y su mecanismo ntimo de accin. - Estudiar la accin de otros agentes sobre la motilidad uterina (alcaloides del cornezuelo y prostaglandinas). Bao de rganos.
(ver demostracin prctica nmero 8)
Preparacin del animal A una rata joven de 120-150 g se le inyecta i.p. en el da anterior al experimento 0,1 mg/Kg de estilbestrol (diluido en aceite vegetal) para inducirle el estro. Recordar que el ciclo de la rata es de cinco das. Un farmaclogo espaol, Garca de Jaln, descubri en los aos cuarenta que, reduciendo el calcio extracelular diez veces se abolan las contracciones espontneas. Hoy emplearemos una solucin de Krebs con bajo contenido de calcio y cuya composicin, por otro lado, intenta remedar al fluido intersticial. - Solucin salina (en mM): [mM] NaCl KCl CaCl2 MgCl2 NaCO3H Glucosa 119 5 0,25 2 25 11
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Borges y Feria
Situacin de los cuernos uterinos en la rata.
- Se sacrifica al animal, se abre el abdomen y se extraen ambos cuernos uterinos. En una placa de Petri con solucin salina se limpian de grasa y se cortan segmentos de 2 cm. - La piezas se montan en una copa de bao de rganos. Uno de los extremos se ata a la varilla de soporte y otro al transductor. Los tejidos, inmersos en solucin salina, se burbujean con carbgeno (95% O2+5% CO2) y se les aplica una tensin de 0,5 g. El carbgeno, adems de oxigenar, mantiene el pH en 7,4 al equilibrar el bicarbonato. La temperatura se ajusta a 31C y la preparacin se deja estabilizando durante media hora. Aplicacin de frmacos. La concentracin de frmaco a alcanzar en el lquido que baa a la preparacin se logra aadiendo una solucin concentrada del mismo, generalmente unas 100-1000 veces con una micropipeta. El burbujeo contribuye a la adecuada dilucin del frmaco. Si se va a aplicar un antagonista este se deja impregnando la preparacin durante unos minutos. Si se trata de un agonista suele retirarse lavarse tras ser alcanzado el efecto mximo. En algunas preparaciones, no es el caso del tero, la contraccin es tnica y pueden administrase dosis crecientes de frmaco de forma acumulativa.
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Tipo de registro ante dos estmulos sucesivos con oxitocina
Desarrollo de la prctica. El alumno deber ir rellenando los grficos que se encuentran al final del guin en la manera que se ilustra en la figura anterior. Para ello se irn plasmando los registros que aparecen en la pantalla. Se anotarn las concentraciones junto a la abreviatura. Cuando se lave la preparacin dibuje una flecha con una L. Frmacos a estudiar Metacolina Atropina
Se incubar 5 min y se repetir la administracin de metacolina hasta llegar a 10 M
Concentracin 100 nM y 1 M 1 M 0,0001 u.i. 1 M 100 nM 100 nM
Abreviatura Meta Atrop Oxit PGF BAY Nitr nif
Oxitocina Prostaglandina F2 BAY-K-8644

Si no se observa efecto per se puede aadirse oxitocina a la dosis anterior
Nitrendipina Nifedipina
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12. TONO VASOMOTOR

ACCIONES DE DIVERSOS FRMACOS PERFUNDIDO DE RATA. EN UNA PREPARACIN DE RIN
Objetivos. - Conocer el uso y las posibilidades de las tcnicas de perfusin de rganos aislados. - Estudiar las especiales caractersticas farmacolgicas vasculares de la perfusin renal. Desarrollo. Se sacrifica el animal y se abre la cavidad abdominal por la lnea media (alba). Se expone el rin izquierdo (pueden extraerse ambos riones). Se localiza la arteria renal (es mucho ms fina y dura que la vena) y se canaliza con un catter de plstico de 0,5 mm de dimetro interno. Se fija el catter con dos ligaduras para evitar que se suelte. A continuacin el rin se extrae y se perfunde en el sistema descrito en la figura a 4 ml/min con una solucin de Krebs atemperada a 35C. El rin se coloca sobre una cmara de perfusin tambin atemperada. En la figura no se muestra, pero las mangueras de perfusin estn dentro de otro tubo atemperado. El sistema produce una presin retrgrada de aproximadamente 80 mm de Hg, que se monitoriza continuamente con el transductor. En el sistema se ha intercalado una conexin en T provista de una membrana de goma para infundir los frmacos. Los frmacos se aplican en bolos de 10 l por medio de una jeringa de precisin (Hamilton). El alumno ir completando las grficas adjuntas.
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Perfusin renal para el estudio de la presin de infusin.
Frmacos a estudiar en este orden. Fenilefrina 10 M Dopamina 1, 10 y 100 M Angiotensina II 100 nM
A continuacin aplicar BAY-K-8644 100 nM (disuelto en el Krebs de perfusin) Y de nuevo: Fenilefrina 10 M Dopamina 1, 10 y 100 M 64
Angiotensina II 100 nM Cambiar de nuevo la perfusin a Krebs normal
Concluir con: Endotelina I 10 nM Nitroprusiato Na+ 10 M
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13. CUANTIFICACIN DE ANTIHISTAMNICOS

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD FARMACOLGICA EN ILEON DE COBAYA.
Objetivos. - Aprender a evaluar la actividad farmacolgica analizando un efecto biolgico y cuantificar dicho efecto comparndolo con un frmaco conocido. Desarrollo. En primer lugar, vamos a construir una curva concentracin-respuesta con histamina. Luego, observando la curva, escogeremos la concentracin a la que se alcanza el 90% de la contraccin. Lavamos la preparacin y administraremos repetidamente esa concentracin hasta encontrar respuestas estables. Luego en uno de los tejidos administraremos concentraciones crecientes del antagonista H1 difenhidramina comenzando con 10-11, 3x10-11 , etc hasta llegar a inhibir completamente la contraccin. El ileon de cobaya es una preparacin muy rica en receptores muscarnicos e histamnicos. Por esta razn se ha utilizado clsicamente para evaluar frmacos con actividad antagonista H1. Para ello, utilizaremos un bao de rganos con una solucin de Tyrode: g/l NaCl KCl MgCl2 CaCl2 KPO4H2 NaCO3H* Glucosa 8 0,2 0,1 0,2 0,05 1 1,98 mM 143 2,3 2,1 2,5 0,4 0,084 11
Esta solucin est preparada para burbujearse con aire, si se utiliza carbgeno (95% 02 + 5% CO2) es necesario reducir el ClNa a 119 e incrementar el NaCO3H a 25 mM. Se sacrifica al cobaya y se abre el abdomen por la lnea alba exponiendo el paquete intestinal.
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Aspecto del paquete intestinal. Se levanta el ciego y se localiza la unin leo-cecal.
Se corta en ese punto y se transfiere desde ah hacia atrs a una placa de Petri conteniendo solucin atemperada de Tyrode recientemente oxigenada (Reproducido de ref. 1).
Se cortan porciones de 2 cm de largo y se limpian con cuidado pasndoles suavemente un poco de Tyrode limpio con una pipeta de Pasteur de plstico. Se monta en el bao sin cerrar los extremos aplicando una tensin de 0,5 g. Aunque se describi esta preparacin con transductores isotnicos, puede utilizarse cualquier tipo de transductor (ver demostracin nmero 8).
Copa de bao con leon. Ntese que los extremos estn abiertos
La temperatura ser de 37C y para la oxigenacin puede usarse tanto aire como carbgeno (ver tabla anterior). Clculo de la EC50 y EC90. El frmaco se aplica y se mantiene presente hasta alcanzarse la contraccin mxima, entonces lavamos la preparacin. Cuando
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Borges y Feria
la preparacin se ha relajado completamente dejamos transcurrir un minuto antes de aplicar la dosis siguiente. Nuestra copa tiene un volumen de 4 ml. Con una micropipeta (0-100 l) aadiremos 40 l del frmaco disuelto 1:100 en Tyrode con cuidado de no tocar la preparacin. Para ello ser necesario que las concentraciones iniciales estn, lgicamente, 100 veces ms concentradas de la que esperamos alcanzar. Prepararemos las siguientes concentraciones de histamina (en concentraciones molares): 3x10-6; 10-5 ; 3x10-5; 10-4 ; 3x10-4; 10-3 ; 3x10-3; 10-2 ; 3x10-2. En la grfica inferior recogeremos los datos de la administracin
Curva concentracin-respuesta de histamina. Ntese que el punto medio entre los valores corresponde a 3x 10-n, dado que nos movemos en una escala logartmica decimal.
De esta grfica obtendremos la EC50, o la concentracin a la cual se produce el 50% del efecto mximo. Para ello trazaremos una lnea vertical desde el punto que represente el 50% de la curva para buscar la dosis correspondiente. En el caso de que no caiga en una dosis fijada se calcular sta por interpolacin. Tambin calcularemos la concentracin ms cercana a la EC90 que utilizaremos en la segunda parte de la prctica. 68
Curva concentracin-respuesta de antagonistas histamnicos
Clculo de la IC50. Prepararemos las siguientes concentraciones de difenhidramina y del frmaco problema: 10-9 ; 3x10-9; 10-8 ; 3x10-8; 10-7 ; 3x10-7; 10-6 ; 3x10-6; 10-5 ; 3x10-5; 10-4 ; 3x10-4; 10-3 ; 3x10-3. A continuacin aadiremos la histamina a la concentracin correspondiente a la EC90 varias veces, lavando entre ellas, hasta encontrar una respuesta estable y reproducible. Para valorar a los antagonistas se aadir la difenhidramina a una de las copas y el frmaco problema a la otra. Esta adicin se realizar un minuto antes que la histamina a fin de permitir que la preparacin se impregne bien. Lavaremos la preparacin despus de cada dosis. Dejaremos de aadir nuevas dosis cuando las contracciones se hayan inhibido completamente. Los resultados se normalizarn al efecto mximo y se dibujarn en la grfica inferior.
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Borges y Feria
De estos datos vamos a calcular la IC50 o la concentracin a la cual la respuesta cae a la mitad del efecto inicial. Procederemos a trazar las lneas hasta el eje de las abscisas, como hicimos antes para calcular la EC50. Esta vez obtendremos la concentracin terica a la cual se inhibe el 50% de la contraccin. De aqu podemos afirmar que el frmaco problema es tantas veces ms o menos potente que la difenhidramina. Discutiremos los resultados con la ayuda del profesor.
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Apndices
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APENDICE A Frmacos y dosis empleadas en la prctica n 4. "Evaluacin de un neurofrmaco"

Frmaco NO-21 PI-12B RAB-1 KJ-458 CO-13 K2-P QW-7 IF-2 YW-P Dosis x peso Ratn Rata 1,2 x p 0,1 x p 3xp 0,2 x p 1xp 0,1 x p 5xp 0,4 x p 1xp 0,1 x p 1,5 x p 0,15 x p 2xp 0,4 x p 1,3 x p 1,2 x p 1xp 0,1 x p Posologa Inicio Inicio Inicio Inicio Inicio Inicio Inicio + 60' Inicio inicio Frmaco Diacepam Anfetamina Clonacepam Etanol Control Clorimipramina Fentanilo Haloperidol Control
APENDICE B Frmacos y concentraciones empleadas en la prctica n 13. "Cuantificacin de antihistamnicos Antagonistas H1 d-Clorfeniramina Mepiramina Triprolidina Prometacina Astemizol Rango de concentraciones 1-3000 nM 1-1000 nM 30-10000 nM 10-3000 nM 30- 30000 nM
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APENDICE C Velocidades de adquisicin recomendadas para las demostraciones.

Demostracin prctica Accin de frmacos sobre el sistema cardiovascular de la rata anestesiada Accin de los broncodilatadores en la rata anestesiada Curvas concentracinrespuesta en la aorta de rata Bloqueantes neuromusculares Crono- e inotropismo de la aurcula de rata Modificacin farmacolgica de la motilidad uterina Tono vasomotor Cuantificacin de antihistamnicos Hz 20 20 5 50-100 50 10 20 10
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APENDICE D Disolucin y estabilidad de los frmacos mencionados en este libro.

Frmaco Acetilcolina (P6) Solvente Suero salino Notas Muy inestable, pesar y diluir hasta 2, 20, 200 g/ml., 2 y 20 mg/ml. Corregir ACh base/ sal. Utilizar en el da Conservar la solucin madre en congelador diluida en cido perclrico al 0,05 N. Las diluciones posteriores en salino no son estables Pueden desleirse los comprimidos Bastante estable en congelador. Dado que es muy cara la hemos utilizado sin problemas de un ao para otro. Lo mejor es hacer pequeas alcuotas de 20 Relativamente estable en nevera. Las diluciones posteriores se harn en Tyrode. Relativamente estable en congelador. Las diluciones posteriores se harn en Ringer. O directamente de la ampolla (Sulfato de atropina). Las diluciones posteriores se harn en la solucin correspondiente (Krebs, Tyrode, etc) Fotosensible, mantener en un envase completamente opaco. De la solucin madre 1 mM, diluir hasta 0,1 mM y aplicar 1:1000 para obtener 100 nM Directamente de la ampolla (Svedocain) Puede desleirse el contenido de la cpsula Bastante estable en nevera Relativamente estable en nevera. Las diluciones posteriores se harn en Tyrode O directamente de la ampolla Bastante estable. Las diluciones posteriores se harn en Tyrode
Adrenalina (P6)
Suero salino
Anfetamina (P4) Angiotensina II (P6, P12)
Suero salino Suero salino
Aspirina (P1) Astemizol (P13) Atenolol (P10)
Agua Agua Agua
Atropina (P6, P10, P11)
Suero salino
BAY-K-8644 (P11)
Alcohol
Bicarbonato Na+ (P1) Bupivacana Clonacepam (P4) Clorimipramina (P4) Cloruro amnico (P1) d-Clorfeniramina (P13) Diacepam (P4) Difenhidramina (P13)
Agua
Suero salino Suero salino Agua Agua Suero salino Agua
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Frmaco Dopamina (P12)
Solvente cido perclrico 0,05 N Suero salino
d-Tubocurarina (P7, P9)
Endotelina 1 (P6)
Suero salino
Etanol (P4) Fenilefrina (P8, P12)
Suero salino Agua
Notas Conservar la solucin madre en congelador diluida en cido perclrico al 0,05 N. Las diluciones posteriores en salino no son estables y se harn Krebs Puede diluirse tambin desde las ampollas (Tubocurarina Wellcome). Las diluciones posteriores se harn en la solucin correspondiente (Krebs, Tyrode, etc). Estable por muchos aos Bastante estable en congelador. Dado que es muy cara la hemos utilizado sin problemas de un ao para otro Guardar en envase bien cerrado Las diluciones posteriores se harn en la solucin correspondiente (Krebs, Tyrode, etc) Bastante estable en congelador. Las diluciones posteriores se harn en la solucin correspondiente (Krebs, Tyrode, etc) Directamente de la ampolla (Fentanest) Muy estable. Las diluciones posteriores se harn en la solucin correspondiente (Krebs, Tyrode, etc) Directamente de la ampolla comercial
Fenoxibenzamina (P6, P8)
Suero salino
Fentanilo (P4) Fentolamina (P10)
Suero salino Agua
Furosemida (P3) Glucosa (P2) Haloperidol (P4) Histamina (P13) Insulina (P2) Ipratropio (P7) Isoproterenol (P6, P10) Suero salino
Agua Suero salino Guardar en nevera Agua acidulada Se conserva en congelador varias con ClH semanas. Las diluciones posteriores se harn en Tyrode Directamente de la ampolla comercial Directamente del nebulizador (Atrovent) Conservar la solucin madre en congelador diluida en cido perclrico al 0,05 N. Las diluciones posteriores en salino no son estables y se harn en la solucin correspondiente (salino, Krebs, Tyrode, etc)
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Borges y Feria
Frmaco Mepiramina (P13) Metacolina (P7, P10, P11)
Solvente Agua Suero salino
Neostigmina (P9) Nitrendipina (P11)
Krebs Alcohol
Noradrenalina (P6)
Suero salino
Notas Relativamente estable en nevera. Las diluciones posteriores se harn en Tyrode Estable en congelador durante 2-4 semanas. Diluir la solucin madre en agua acidulada (ClH 0,05 N) Las diluciones posteriores se harn en la solucin correspondiente (Krebs, Tyrode, etc) Puede diluirse directamente de la ampolla (Prostigmine) Fotosensible, mantener en envases completamente opaco. De la solucin madre 1 mM, diluir hasta 0,1 mM y aplicar 1:1000 para obtener 100 nM Conservar la solucin madre en congelador diluida en cido perclrico al 0,05 N. Las diluciones posteriores en salino no son estables Relativamente estable en congelador. Las diluciones posteriores se harn en Ringer. Diluir desde la ampolla (Syntocinon)Guardar en nevera 80 mg/ml 50 mg/ml en dial 1:4 etanol/agua. Puede incrementarse su estabilidad aadiendo 0,5 ml de propilnglicol Las diluciones posteriores se harn en la solucin correspondiente (Krebs, Tyrode, etc) Relativamente estable en nevera. Las diluciones posteriores se harn en Tyrode Bastante estable, puede utilizarse la forma racmica para esta prctica. Poco estable, guardar en nevera. Directamente del nebulizador (Ventoln) 9 (9 g/l) Puede diluirse directamente de la ampolla (Anectine) Disolver el comprimido de Salidur en salino Relativamente estable en nevera. Las diluciones posteriores se harn en Tyrode
Ouabana (P10) Oxitocina (P11) Pentilnetetrazol Pentobarbital (P6, P7) Prazosina (P8) Prometacina (P13) Propranolol (P6) Prostaglandina F2 (P11) Salbutamol (P7) Suero salino ( fisiolgico) Suxametonio (P9) Triamtereno (P3) Triprolina (P13)
Agua Jaln Suero salino
Agua Agua Suero salino Jaln
Agua Krebs
Agua
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APENDICE E Algunos registros obtenidos en las prcticas mencionadas en este libro.

Los archivos estn tambin disponibles en las direcciones web que aparecen escritas en azul. Para abrir estos archivos se necesita un programa compatible (Igor Pro, IDI, etc).
Anillos de aorta (Prctica 8)
Nervio frnico-diafragma (Prctica 9)
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Borges y Feria
Nervio frnico-diafragma (Prctica 9)
Nervio frnico-diafragma. Trenes de 4 con 1M d-Tubocurarina (Prctica 9)
78
tero de rata en estro (Prctica 11)
tero de rata en estro (Prctica 11)
79
Borges y Feria
APENDICE F Ejemplo de resultados obtenidos de la prctica nmero 3 (Accin de los diurticos en la rata). Control
EUP Media 31,5 n 15 Est 3,9 n 15
Furosemida
pH Na+ K+ EUP pH Na+ K+ EUP pH Na+ K+ 6,9 0,42 0,06 153 6,4 2,9 0,12 97 6,8 2,1 0,04 0,9 0,2 0,03 202 0,5 0,4 0,02 22,2 0,8 0,47 0,01 0,2 0,05 0,01 4,5 0,1 0,1 0,00 5 0,2 0,11 0,00 15 15 15 20 20 20 20 20 20 20 20
Furosemida + Triamtereno
EUP= Porcentaje de orina emitida con respecto a la sobrecarga administrada. Los valores de Na+ y K+ se expresan como mEq en la orina emitida en 2 horas. n= Desviacin estndar; Est= Error estndar; n= Nmero de datos.
80
Bibliografa.
1- Staff of the Department of Pharmacology, University of Edinburgh. Pharmacological Experiments on Isolated preparations. 2nd Ed. E&S Livingstone. Edinburgh. 1971. 2- Staff of the Department of Pharmacology, University of Edinburgh. Pharmacological Experiments on Intact preparations. 2nd Ed. E&S Livingstone. Edinburgh. 1970. 3- Borges, R.; Grafenstein, HV. and Knight, DE. (1989).Tissue selectivity of endothelin. Eur. J. Pharm. 165, 223-230.
81

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Prcticas de laboratorio para alumnos universitarios

Objetivos actuales de las prcticas de Farmacologa

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1.- ELIMINACIN DE SALICILATOS EN EL HOMBRE

140 min 160 min 180 min

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Los valores obtenidos se irn anotando en la tabla adjunta. 17

0 min 20 min 40 min 60 min

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2. CONTROL FARMACOLGICO DE LA GLUCEMIA

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3. ACCIN DE LOS DIURTICOS EN LA RATA

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NO-21 PI-12B RAB-1 KJ-458 CO-13 K2-P QW-7 IF-2 YW-P

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Deambulacin interna Deambulacin media Deambulacin externa Defecaciones

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6. ACCIN DE FRMACOS SOBRE EL SISTEMA CARDIOVASCULAR DE LA RATA ANESTESIADA

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Atr= Fen= Pro= AII=

Atropina Fentolamina Propranolol Angiotensina II

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Se administrarn en el siguiente rden: adrenalina (5 g/Kg); noradrenalina (5 g/Kg) e isoproterenol (1 g/Kg).

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7. ACCION DE LOS BRONCODILATADORES EN LA RATA ANESTESIADA.

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Presin de insuflacin (cm H2O)

Presin de insuflacin (cm H2O)

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Presin de insuflacin (cm H2O)

Presin de insuflacin (cm H2O)

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8. CURVAS CONCENTRACION-RESPUESTA EN LA AORTA DE RATA

Esquema de un bao de rganos "clsico"

NaCl KCl MgSO4 KPO4 H2 CaCl2 NaCO3H Glucosa

[en mM] 119 4,7 1,2 1,2 2,5 25 11

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4 ml Llave de paso Anillo de aorta

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Despolarizantes (tambin llamados leptocurares o no competitivos) el prototipo es la Succinilcolina.

La demostracin incluir tambin un

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Estudiaremos el efecto sobre estos parmetros y antagonistas.

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10. CRONO- E INOTROPISMO EN LA AURCULA DE RATA

Ligadura de las orejuelas para su colocacin en el bao (reproducido de ref #1).

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PRIMERA COPA DEL BAO

SEGUNDA COPA DEL BAO

PRIMERA COPA DEL BAO

SEGUNDA COPA DEL BAO

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SEGUNDA COPA Fuerza Frecuencia

PRIMERA COPA Fuerza Frecuencia 100 100

SEGUNDA COPA Fuerza Frecuencia 100 100