FAO INFLUENZA AVIAR

MANUAL

MANUAL DE TCNICAS PARA EL DIAGNSTICO DE LA INFLUENZA AVIAR DE ALTA PATOGENICIDAD

Proyectos de Cooperacin Tcnica Asistencia de emergencia para la deteccin temprana de la Influenza Aviar en el Caribe (TCP/RLA/3103) Centroamrica (TCP/RLA/3104) Regin Andina (TCP/RLA/3105) y Cono Sur (TCP/RLA/3106)

Centro de Emergencia para el Control de las Enfermedades Transfronterizas de los Animales (ECTAD) Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin (FAO) Oficina Regional para Amrica Latina y el Caribe (FAORLC)

Las denominaciones empleadas en esta publicacin y la forma en que aparecen presentados los datos que contiene no implican, de parte de la Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin, juicio alguno sobre la condicin jurdica de pases, territorios, ciudades o zonas, o de sus autoridades, ni respecto de la delimitacin de sus fronteras y lmites.

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(c) FAO 2007

NDICE

PRLOGO INTRODUCCIN OBJETIVOS Objetivo general Objetivos especficos 1. RECOLECCIN Y PRESERVACIN DE MUESTRAS PARA INFLUENZA AVIAR 1.1- Equipos e instrumentos 1.2. Coleccin de muestras 1.3. Conservacin de las Muestras 1.4. Pautas de Envo 2. USO SEGURO DE GABINETES DE BIOSEGURIDAD 2.1. Antes de Comenzar 2.2. Trabajando en la cabina 2.3. Despus del Procedimiento 3. PREPARACIN DE ANTIBITICOS PARA AISLAMIENTO VIRAL DEL INCULO EN HUEVOS EMBRIONADOS 3.1. Equipos e instrumentos 3.2. Preparacin de reactivos 4. PRUEBA DE INMUNODIFUSIN EN GEL DE AGAR PARA LA DETECCIN DE ANTICUERPOS SRICOS DE VIRUS INFLUENZA TIPO A 4.1 Definicin 4.2 Equipos e instrumentos 4.3 Materiales y Reactivos 4.4 Almacenamiento de Reactivos 4.5 Preparacin de Reactivos 4.6 Suspensin del antgeno de Influenza Aviar para la IDGA 4.7 Suspensin del antisuero de Influenza Aviar para la IDAG 4.8 Realizacin de Prueba de Inmunodifusin en gel de agar para la deteccin de anticuerpos sricos para virus Influenza Tipo A 4.9 Procedimiento alternativo para la identificacin de aislamientos del virus Influenza tipo A 4.10 Interpretacin de los resultados 4.11 Deteccin de anticuerpos sricos 4.12 Deteccin de antgeno (procedimiento alternativo) 4.13 Informe de los Resultados 5. PROTOCOLO PARA LA PRUEBA DE INHIBICIN DE LA HEMOAGLUTINACIN PARA IDENTIFICAR ANTICUERPOS CONTRA SUBTIPOS DE INFLUENZA A. 5.1. Abreviaturas 5.2. Reactivos 5.3. Materiales y Equipo Requeridos 5.4. Preparacin de los Reactivos/ Procedimientos de Control 5.5. Preparacin de las Muestras 5.6. Procedimientos de la Prueba

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6.1. 6.2. 6.3 6.4. 6.5. 6.6. 6.7. 6.8. 6.9 6.10 6.11 7. 7.1. 7.3. 7.4. 8. 8.1. 8.2. 8.3. 9. 9.1. 9.2. 10. 10.1. 10.2. 10.3. 10.4 10.5. 10.6. 10.7.

PROTOCOLO PARA EL PROCEDIMIENTO DE INHIBICIN DE LA NEUROAMINIDASA PARA IDENTIFICAR SUBTIPOS DE NEUROAMINIDASAS DE LOS VIRUS INFLUENZA TIPO A A TRAVES DE SUS ANTICUERPOS Materiales y Equipo Requeridos Reactivos Preparacin para la Prueba Preparacin de los Reactivos/ Procedimientos de Control Preparacin de las Muestras Procedimientos de la Prueba Interpretacin de los Resultados Referencias Apndice Prueba para asegurarse de la inactivacin del virus vivo con BPL Referencia rpida PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA AISLAMIENTO VIRAL EN HUEVOS EMBRIONADOS Definiciones y Abreviaturas Procedimiento para Procesar Trulas (hisopos) Procedimiento para Procesar Tejidos obtenidos de Aves Enfermas PRUEBA DE HEMOAGLUTINACIN PARA INFLUENZA AVIAR Definiciones y Abreviaturas Materiales y Reactivos Actividades AISLAMIENTO VIRAL EN HUEVOS EMBRIONADOS PARA EL DIAGNSTICO DE INFLUENZA AVIAR DE ALTA PATOGENICIDAD Aislamiento Viral Serologa PRUEBA DE INOCULACION ENDOVENOSA EN POLLOS PARA LA DETERMINACION DE PATOGENICIDAD DE CEPAS DE INFLUENZA AVIAR Definiciones y Abreviaturas Equipos e instrumentos Preparacin de Reactivos Preparacin de las Muestras Inoculacin de los pollos Procedimiento de salida de la Sala Animal Clculo del Indice de Patogenicidad Endovenoso (IPIV)

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28 28 28 29 29 29 32 32 33 33 34 35 35 35 36 37 37 37 37 39 39 41 42 42 42 42 42 43 44 44

PRLOGO

En la ltima dcada la produccin avcola en Amrica Latina y el Caribe, ha tenido un gran desarrollo debido principalmente a las condiciones agroecolgicas y socioeconmicas de la regin, tanto, que actualmente es junto con la subregin de Norteamrica, la principal productora mundial de carne y huevo de gallina, siendo adems, estos alimentos de origen animal, los ms consumidos por la poblacin en la regin, especialmente entre los sectores de escasos recursos, constituyndose en muchos pases en verdaderos pilares de la seguridad alimentaria. Esta situacin, se vera seriamente afectada por la introduccin de la Influenza Aviar de Alta Patogenicidad (IAAP) H5N1 (Asitica), que es una enfermedad transfronteriza de los animales, altamente contagiosa y que desde 2003 padecen en forma epizotica los continentes asitico, africano y europeo alcanzado a infectar ya ha 60 de sus pases. Por ello, la FAO a venido desarrollando diversas acciones a travs de la cooperacin tcnica internacional, con la finalidad de reforzar el conocimiento de las medidas para prevenir, controlar y eliminar a la enfermedad, mediante capacitaciones y entrega de materiales y equipos tanto a pases afectados, en otras regiones, as como de Amrica Latina y el Caribe, libre de la IAAP H5N1, pero con riesgo de padecerla, especialmente con acciones para mejorar la vigilancia epidemiolgica en aves de corral y silvestres, la armonizacin y la homologacin en las tcnicas de diagnstico de laboratorio y la aplicacin de estrategias de comunicacin e informacin en los pases. El presente Manual de Tcnicas para el Diagnostico de la IAAP, constituye una recapitulacin de las capacitaciones en tcnicas de diagnstico, realizados por la FAO en los 33 pases Amrica Latina y el Caribe, reuniendo detalladamente todas las tcnicas diagnsticas clsicas con las que deberan contar los laboratorios de los pases de la regin, a fin de homologar estos mtodos en el mbito continental. Es importante mencionar que estas metodologas, son basadas en los protocolos que se utilizan en el Laboratorio Regional de Referencia de la OIE/FAO para IAAP, del Laboratorio Nacional de Diagnostico Veterinario del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos de Norteamrica (USDA), ubicado en Ames, IOWA. Las cuales fueron traducidas al espaol, incluyndose las tcnicas serolgicas para la deteccin de anticuerpos, virolgicas como el aislamiento y pruebas de deteccin rpida de antgeno, tcnicas de subtipificacin y de estudios de patogenicidad, es decir toda la gama de pruebas que permiten identificar, clasificar y subtipificar cepas de la Influenza Aviar. Es necesario recalcar que las metodologas plasmadas en este Manual, producto de futuras investigaciones, modificaciones genticas de los virus y por el desarrollo de la biotecnologa, seguramente sufrirn modificaciones o se desarrollarn nuevas tcnicas, para lo cual, los usuarios del Manual, debern estar alerta y articulados en una red de laboratorios especializados, para poder actualizar permanentemente estos protocolos y homologarlos dentro de la regin. LA FAO espera que esta publicacin sea de utilidad para el personal de laboratorio de los pases de la regin y agradece al Dr. Christian Mathieu y al Dr. Juan Garca Garca por el esfuerzo y dedicacin demostrados en la preparacin y recopilacin de este material, as como su valioso aporte durante las capacitaciones. Moiss Vargas Tern
Oficial de Salud Animal, FAO/RLC

INTRODUCCIN

La Influenza Aviar de Alta Patogenicidad, especficamente la cepa del subtipo H5N1 asitica, que ha venido preocupando a la comunidad cientfica y los gobiernos en general debido a su componente zoontico, representa una amenaza frente a la cual, debemos estar preparados para poder reconocer su presencia en cualquier pas que llegase a introducirse al continente americano que actualmente se encuentra libre. Es as como la Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin (FAO) ha tomado la iniciativa de realizar cursos de capacitacin en tcnicas diagnsticas en la regin de Latinoamerica y el Caribe, en colaboracin con otros organismos comos el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), otras instituciones internacionales, terminando con la elaboracin de dos manuales, uno especfico para el diagnstico molecular y el presente que rene las tcnicas diagnsticas bsicas para la temprana deteccin ya sea serolgica o virolgica de la Influenza Aviar. El presente Manual fue preparado de acuerdo con los protocolos de diagnstico que utiliza el Laboratorio Nacional del Servicio veterinario de Ames, Iowa (Laboratorio de Referencia OIE/FAO para Influenza Aviar) dependiente del USDA. En el se incorporaron las tcnicas virolgicas y serolgicas bsicas y necesarias para obtener resultados de aislamiento viral, identificacin de virus Influenza tipo A, pruebas para determinar la patogenicidad de las cepas aisladas y tcnicas serolgicas para determinar anticuerpos contra virus de Influenza tipo A y su subtipificacin. Es indispensable que el usuario de este manual, tenga en cuenta que permanentemente estas tcnicas cambian por lo que en el futuro se pueden ir incorporndose nuevos procedimientos, por lo tanto siempre hay que tener presente las actualizaciones que van a ir apareciendo y poder as realizar las modificaciones necesarias cuando estas aparezcan y sean validadas por el citado laboratorio de referencia.

OBJETIVOS

Objetivo general: Reunir los procedimientos bsicos de los mtodos virolgicos y serolgicos utilizados para la deteccin temprana de la Influenza Aviar de Alta Patogenicidad. Objetivos especficos: 1. 2. 3. Contar con las bases tcnicas para una correcta toma, preservacin y transporte de muestras para el diagnstico de la Influenza Aviar. Contar con los pasos para el uso adecuado de gabinetes de bioseguridad. Contar con las frmulas y concentraciones de la mezcla de antibiticos y antimicticos utilizados para la inoculacin de muestras en huevos embrionados. Contar con las herramientas para una adecuada deteccin de anticuerpos antiInfluenza tipo A o virus de Influenza Tipo A, mediante la prueba de Inmunodifusin en gel de agar. Identificar el subtipo de hemoaglutinina presente en la cepa de Influenza aislada o de anticuerpos en el suero positivo mediante el mtodo de Inhibicin de la hemoaglutinacin. Identificar el subtipo de neuroaminidasa presente en la cepa de Influenza aislada o de anticuerpos en el suero positivo mediante el mtodo de Inhibicin de la neuroaminidasa. Conocer los pasos que se deben aplicar para el procesamiento de muestras para inocular embriones de pollo. Describir las etapas de la tcnica de hemoaglutinacin para reconocer lquidos alantodeos positivos a virus hemoaglutinantes. Establecer los pasos que se utilizan para realizar el aislamiento del virus de la Influenza Aviar, en embriones de pollo SPF (Libre de Patgenos Especficos).

4.

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7. 8. 9.

10. Describir la prueba para determinar el ndice de patogenicidad endovenosa en pollos a partir de cepas de Influenza Aviar.

1. RECOLECCIN Y PRESERVACIN DE MUESTRAS PARA INFLUENZA AVIAR

Las actividades descritas a continuacin detallan los pasos a seguir para realizar la coleccin y preservacin de muestras para influenza aviar. 1.1 Equipos e instrumentos: Trulas (hisopos) tubos bolsas plsticas cajas de transporte autorizadas formalina instrumentos de diseccin diluyente para las trulas (hisopos) refrigerador (4C y -20C) congelador (-70C) etiquetas adecuadas paquetes de gel congelado o hielo seco

1.2. Coleccin de muestras: 1.2.1.Coleccin de muestras de hisopado. Las muestras de hisopados se colectan pasando una trula sobre el epitelio cloacal o traqueo/farngeo de aves sospechosas. Se pueden mezclar estas muestras hasta 5 trulas por tubo. La otra forma de colectar muestras es obteniendo directamente tejido de pulmones o bazo de un ave muerta (no ms de 24 horas) o con signos clnicos. No se deben mezclar diferentes rganos en una misma bolsa. 1.2.2. Medio de transporte para las trulas (2 - 3,5 ml/tubo), se puede usar: caldo de infusin cerebro- corazn medio de transporte viral caldo de tris buffer triptosa caldo peptonado medio de cultivo celular c/1% BSA Nota: a todos ellos se les debe agregar antibiticos (ver captulo respectivo) 1.2.3. Nmero de Muestras: Se obtiene tomando al menos una prevalencia de un 10% de infeccin con un intervalo de confianza del 95% (unidad epidemiolgica con una poblacin infinita). Serologa: 30 muestras/ poblacin.

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Trulas: 30, reuniendo hasta 5 muestras de aves diferentes por tubo. Tejido (aves enfermas o muertas): 3 a 5 aves (pulmn, bazo, otros rganos afectados).

1.2.4. Tamao muestral en funcin del tamao poblacional y de la probabilidad de deteccin:

95% CI 1% 5% 10% 99% CI 1% 5% 10%

50 48 31 22 50 39 29

100 96 45 25 99 59 36

500 225 56 28 300 83 42

1000 258 59 29 368 86 43

10000 294 59 29 448 90 44

Por favor remita 0,5-1 ml de suero para subtipificar.

1.3. Conservacin de las Muestras: Sueros: a 4C o a 20C para almacenamientos por largo tiempo (ms de 48 horas) Tejidos/trulas/virus: a 4C por 72 horas y a 70C para almacenar por ms de 72 horas. No se recomienda congelar a 20C porque inactiva al virus sobretodo si se tratan de trulas, en donde el virus se puede encontrar en menor concentracin. 1.4. Pautas de Envo: Empaque por separado las muestras de tejido frescas. Especmenes frescos: Tejidos; en bolsa doble. Trulas/sueros; en bolsas de envo, con cada tubo etiquetado y ordenados Enviar refrigerados (con paquetes de gel congelados o con hielo seco).

Enviar juntas las muestras para cada protocolo de investigacin. Utilice solo cajas aprobadas para envos. Utilice etiquetas apropiadas por fuera de cada caja. Enliste el contenido como muestras diagnsticas de una poblacin (indicando los datos completos del origen de las muestras y la persona de contacto para entregar los resultados. Enviar muestras solo a laboratorios autorizados.

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2. USO SEGURO DE GABINETES DE BIOSEGURIDAD

2.1. Antes de Comenzar: Evite la presencia de aerosoles. Clase I.- no provee proteccin al personal ni al ambiente solo al producto. Clase II.- provee proteccin al personal, ambiente y al producto Verifique que est utilizando el gabinete (campana, cmara, cabina) adecuad para el trabajo que realice (Clase I vs. Clase II). Verifique que la cabina se encuentre con su certificacin de calibracin al da. Asegrese de que la luz UV est apagada cuando alguien entre a la sala, 15 minutos de luz ultravioleta bastan para esterilizar la superficie de la cmara. Cuando la luz UV este encendida, deje la ventana de la cmara cerrada o ponga un protector en la apertura de la ventana. Cuando recin encienda la cmara djela prendida por 2 a 3 minutos, para filtrar el aire y para establecer patrones de flujo y filtracin del aire. Asegrese de usar un desinfectante que sea capaz de inactivar cualquier microorganismo que posiblemente este en la cmara. Asegrese que la ventana de la cmara este en la posicin correcta y que la vlvula de drenaje este cerrada. Nunca deje papel, lpices u otros objetos que contaminan dentro de la cabina. Nunca bloquee las parrillas de flujo de aire. Separe los materiales limpios de las que sern contaminados.

2.2. Trabajando en la cabina: Gente caminando alrededor y puertas abrindose y cerrndose continuamente causan turbulencias y corrientes de aire dentro de la cmara. Programe las horas de trabajo sin interrumpir y ponga un cartel en la puerta que diga que la campana est en uso. Slo una persona debe trabajar en la cmara a la vez. El operador debe estar sentado. Siempre use una tcnica asptica. Ejecute movimientos limitados y lentos. Minimice la cantidad de entradas y salidas del espacio de trabajo. Entre o salga de la cmara en forma directa, luego permita que el aire se estabilice en el interior de la cabina. Minimice el movimiento de los materiales no estriles cerca de los materiales estriles. No use una llama abierta en la cmara.

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Ponga en el exterior una copia del protocolo de su institucin sobre el manejo de derrames... lalo y sgalo. Nunca coma o beba cerca de la cmara. Nunca guarde comida ni fume cerca de la cmara. Evite al mximo trabajar con muchos materiales dentro de la cmara, slo lo indispensable para el trabajo que est ejecutando.

2.3. Despus del Procedimiento El equipo que estuvo en contacto con el agente manipulado se debe separar. Todas las superficies se deben desinfectar. Saque todos los materiales e instrumentos de la cmara y desinfecte las superficies internas. No almacene equipos o materiales dentro o sobre la cmara. Deje la cmara funcionando por lo menos 15 minutos. Si debe apagar la cmara, depure por 2 a 3 minutos y luego cierre la ventana de la cmara completamente.

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3.

PREPARACIN DE ANTIBITICOS PARA AISLAMIENTO VIRAL DEL INCULO EN HUEVOS EMBRIONADOS

Los medios de transporte con antibiticos se usan para diluir y clarificar tejidos y trulas antes de inocularlos en huevos embrionados. 3.1. Equipos e instrumentos Probetas. Tubos de ensayo. Congelador a -20C. Refrigerador ( 4C).

3.2. Preparacin de reactivos: 3.2.1. Caldo Tris Tripotosa (CTT): Aada base de trizma (1.21grs), caldo de triptosa (26,0 grs) y agua destilada (cbp 1.000 ml). Esterilice por autoclave por 25 minutos con extraccin lenta y almacene a 4C. 3.2.2. Buffer fosfato salino (PBS): combine lo siguiente: Cloruro de sodio 8 grs. Cloruro de potasio 0,2 grs. Cloruro de Calcio 0,1 gr. Sodio fosfato dibsico* 1,03 grs. Potasio fosfato monobsico 0,2 grs. Cloruro de magnesio 0,1 gr.

Agregue cbp 1,000 ml de agua destilada. Esterilice por autoclave y Almacenar a 4C. *disolver separadamente con agua caliente.

3.2.3. Antibiticos: Penicilina G 1586 UI/mg. Estreptomicina sulfato 747 UI/mg. Gentamicina sulfato 50 mg/ml. Kanamicina sulfato 50 mg/ml. Nistatina 5000000 UI.

3.2.4. Almacenaje de Antibiticos de solucin 33T: Vierta 35 ml de PBS estril en 1 probeta de 250 ml y agregue lo siguiente: Penicilina G; 20,8 grs y Sulfato de estreptomicina 8,84 grs. mezcle hasta disolver. Agregue aspticamente el sulfato de kanamicina (42,9ml), el sulfato de Gentamicina (66,0 ml) y la Nistatina (0,13 ml).

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Ajuste el pH a 6,6 con hidrxido de sodio 1 N. Agregue PBS estril hasta completar 150 ml. Almacene el stock de antibiticos a 20C para su uso futuro.

3.2.5. Preparacin del CTT con antibiticos 33T: Vierta aspticamente 150 ml del stock de antibitico 33T en 850 ml de CTT,y mezcle. Vierta aspticamente 1,3 ml de CTT con antibiticos en un vial estril. Almacene a 20C. La concentracin aproximada de antibiticos despus de agregar 2 a 3 ml de muestra (promedio 2,5 ml) a 1,3 ml de CTT con antibiticos es la siguiente: Penicilina 11300 UI/ml, Estreptomicina 2300 UI/ml, Kanamicina 750 lg/ml, Gentamicina 1150 lg/ml y Nistatina 20 UI/ml.

3.2.6 Almacenaje de antibiticos 10T: Vierta 15 ml de PBS estril a una probeta estril de 250 ml. Aada 6,3 grs de Penicilina G y 2,68 grs de sulfato de Estreptomicina. Mezcle bien para disolver Aada aspticamente: 13 ml de Kanamicina, 20 ml de Gentamicina y 0,04 ml de Nistatina. Ajuste el pH a 6,6 con hidrxido de sodio 1N. Agrguele PBS hasta alcanzar 50 ml. Almacene a 20C (o a menor temperatura) para su uso futuro.

3.2.7. Preparacin de CTT con antibiticos 10T: Vierta aspticamente 50 ml de antibitico 10T previamente preparado en 950 ml de CTT (basal). Mezcle. Agregue aspticamente la cantidad deseada de la solucin de CTT con antibiticos (generalmente 1,8 ml) a un tubo estril de 12 x 75 mm con tapa. Guarde a 20C o menor temperatura. La concentracin final aproximada de antibiticos de 10T sera la siguiente: Penicilina 10000 UI/ml, Estreptomicina 2000 UI/ml, Kanamicina 650 lg/ml, Gentamicina 1000 lg/ml y Nistatina 20 UI/ml.

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PRUEBA DE INMUNODIFUSIN EN GEL DE AGAR PARA LA DETECCIN DE ANTICUERPOS SRICOS DE VIRUS INFLUENZA TIPO A.

4.1 Definicin: Prueba de Inmunodifusin en gel de agar (IDGA) para la Influenza Aviar tipo A. La prueba detecta anticuerpos circulantes dirigidos en contra de antgenos grupoespecficos de Influenza tipo A. Los antgenos se denominan Ribonucleoprotena (RNP) y protena de la matriz (M). Por lo tanto esta prueba detectar anticuerpos precipitantes para todos los subtipos de virus de Influenza tipo A. La prueba de IDGA tambin puede ser usada como una prueba de grupo-especfico para identificar aislados de virus de Influenza tipo A. IDGA: Prueba de Inmunodifusin en gel de agar IA: Influenza Aviar 4.2 Equipos e instrumentos: Incubadora o contenedor plstico cerrado (caja de aislapol-plumavit) Bomba de vaco Lupa Estufa a 25C Molde metlico de IDGA-IA especfico para cortar siete pocillos (uno central rodeado por 6 pocillos igualmente separados. Los pocillos tienen un dimetro de 5,3 mm y con una separacin de 2,4 mm entre cada uno de ellos). Micropipeta monocanales de 10-100 l. Puntas desechables Pipeta de 1-10 ml. Vortex

4.3 Materiales y Reactivos: Placas Petri con agar para IDGA para IA . Antgeno de Influenza Aviar para la IDGA. Antisuero de Influenza Aviar para la IDGA. Suero de referencia fuerte positivo, dbil positivo y negativo (opcional). Agua destilada o deionizada estril. Manguera de silicona o de goma flexible, Matraz de Kitasato (500 ml o ms grande) y una cnula de 12 a 14 gauge con punta roma.

4.4 Almacenamiento de Reactivos: Las placas Petri con agar para IDGA-IA, as como los antgenos y antisueros liofilizados deben ser almacenados en refrigeracin entre 2 a 8 C. 4.5 Preparacin de Reactivos: Precauciones: Manipular con guantes dado que estos reactivos (antgenos y antisueros) contiene azida de sodio la cual es mutagnica y cancergena, no exponer a altas temperaturas (300C).

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4.6 Suspensin del antgeno de Influenza Aviar para la IDGA: El antgeno de Influenza Aviar para la IDGA se encuentra liofilizado, para su uso se debe reconstituir con 2 ml. de agua destilada estril, se homogeniza en un vortex y se almacena entre -15 a -25 C (-20 +/- 5 C). 4.7 Suspensin del antisuero de Influenza Aviar para la IDAG: El antisuero de Influenza Aviar para la IDGA se encuentra liofilizado, para su uso se debe reconstituir con 6 ml. de agua destilada estril, se homogeneiza en un vortex y se almacena entre -15 a -25C (-20 +/- 5 C). 4.7.1 Preparacin del Agar Pesar 9.0 gm de agarosa y 80 gm de NaCl en 1.000 ml de PBS (0.01M, pH 7.2) en un matraz de Erlenmeyer de 2.0 L Nota: cantidades mayores o menores se pueden preparar multiplicando o dividiendo cada ingrediente por el mismo factor. El tamao del matraz debe ser al menos el doble del volumen que se va a preparar par evitar que se derrame durante el tiempo que hierva Disuelva la mezcla permitiendo que hierva en una platina caliente utilizando un agitador magntico. Esterilice por autoclave la mezcla de agar durante 10 minutos y despus agtelo para asegurar una mezcla homognea. Enfri a temperatura ambiente (25C), durante 10 a 15 min. Nota: el agar puede ser almacenado en el matraz a 4C por algunos meses Distribuya de 15 a 17 mL del gel lquido en cajas de petri de 100 x 15 mm o de 5 a 6 ml en cajas de Petri de 60 x 15 mm utilizando pipetas de vidrio de 25 ml. El grosor del agar debe ser de aproximadamente 2.8 mm. Deje las placas de Petri reposar en una superficie plana en un ambiente libre de polvo las tapas deben dejarse entreabiertas por un periodo de 15 min y no mayor a 30 min debido a que la concentracin de electrolitos puede cambiar debido a la evaporacin Nota: Las placas preparadas se deben utilizar el mismo da 4.8 Realizacin de Prueba de Inmunodifusin en gel de agar para la deteccin de anticuerpos sricos para virus Influenza Tipo A: El analista debe verificar que la informacin del Protocolo de toma de muestras y de resultados de laboratorio PTMRL (ANEXO N1) corresponda con las muestras ingresadas al laboratorio, segn el procedimiento del manejo de muestras. El analista ordena los tubos de muestras en gradillas de acuerdo al orden que se establezca para esto en cada laboratorio El analista debe llenar la Planilla IDGA-IA (ANEXO N2) con el nmero del PTMRL segn el orden en que fueron dispuestas las muestras en las gradillas. Con un marcador se realice una marca en un borde de la placa de Petri, tomando esta como referencia, con el molde metlico IDAG-IA corta el agar, de tal forma de que los pocillos siempre estn alineados verticalmente hacia

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la marca. Hasta 7 patrones de molde se pueden cortar en una placa Petri de 100 x 15 mm., dos superiores, tres centrales y dos inferiores (FIGURA 1). El agar dentro de cada pocillo formado por el molde debe ser removido por aspiracin con una cnula de 12 a 14 gauge conectada a un matraz de Kitasato con un tubo de silicona o de goma el cual est conectado a una bomba de vaco. La bomba debe generar la suficiente succin para que el agar que rodea el pocillo no sea removido ni se rompa cuando se remueva el agar de los pocillos. Marque la tapa de la placa Petri con el nmero correspondiente segn el orden de las muestras en la gradilla. Usando una micropipeta monocanal coloque 50 l. de cada muestra de suero en el pocillo correspondiente segn la disposicin asignada (2, 6 y 10 segn una cartula de reloj). Descarte la punta usada en el contenedor de puntas y utilice una punta limpia para cada muestra. Comenzar siempre de la roseta superior izquierda, desde el pocillo numero 1, en forma de U, dejando libres un pocillo por medio y el central (FIGURA 1) Nota: el pocillo debera ser llenado tan arriba como sea posible evitando su rebase. Coloque 50 l. del control de antisuero positivo de IA para IDGA en los pocillos restantes dejando el central libre por cada roseta. Agregue 50 l. del antgeno de IA para IDGA en el pocillo central. Esta disposicin va a proveer tres lneas de control positivas, facilitando as una determinacin exacta de las lneas de identidad. Nota: Se debera incluir un patrn de suero positivo, dbil positivo y negativo en los pocillos de prueba de los sueros para ayudar a la interpretacin de los resultados. Tapar cada placa despus del llenado de todos los pocillos y djelas sin mover por algunos minutos. Esto reducir la posibilidad de rebase. Incube las placas por al menos 24 horas a temperatura ambiente (25 C. +/- 2C.) en una cmara cerrada para evitar la evaporacin. Se puede proveer de humedad, si es necesario, colocando una toalla de papel humedecida en el fondo de la cmara de incubacin. Nota: Cambios de temperatura o humedad durante la migracin pueden provocar problemas en la interpretacin. 4.9 Procedimiento alternativo para la identificacin de aislamientos del virus Influenza tipo A: Se deben ordenar las muestras, llenar la Planilla IDAG-IA, cortar y remover el agar segn fue descrito anteriormente. Se coloca antgeno a probar consistente en fluido amnitico alantodeo o una suspensin cruda de membrana corio-alantodea en los pocillos perifricos alternados restantes segn el orden registrado en la Planilla IDAG-IA. Coloque 50 l. del control antisuero positivo de IA por IDGA en el pocillo del centro usando una micropipeta con su respectiva punta. Dispense antgeno para IA por IDGA en pocillos restantes alternadamente. Continuar segn lo descrito anteriormente.

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4.10 Interpretacin de los resultados La base de la prueba de IDGA es la concurrente migracin de antgeno y anticuerpo entre si a travs de una matriz de gel de agar. Cuando el antgeno y los anticuerpos especficos entran en contacto, se combinan para formar un precipitado el cual es atrapado en la matriz del gel y produce una lnea visible. La lnea de precipitacin se forma donde la concentracin del antgeno y del anticuerpo es ptima. Una variacin extrema en la concentracin del antgeno o de los anticuerpos alterar la localizacin de la lnea o causar que se disuelva. La concentracin electroltica, la solucin tampn, el pH y la temperatura tambin afectar la formacin del precipitado. 4.11 Deteccin de anticuerpos sricos. Remueva la tapa y lea las placas sobre un intenso haz de luz angosto en contra con un fondo oscuro. Un iluminador microscpico funciona bien y permite variar la intensidad y posiciones de la luz. El tipo de reaccin variar con la concentracin de anticuerpo que contenga la muestra a analizar. La lnea de suero del control positivo es la base para leer la prueba, y si la lnea no se distingue la prueba no es vlida y debe ser repetida. Se observan los siguientes tipos de reaccin: Reaccin negativa: las lneas de control continan a los pocillos con las muestras sin doblarse o con un leve doblez lejos del pocillo del antgeno y hacia el pocillo del suero control positivo. Reaccin positiva: Las lneas de control de reaccin positiva se juntan y forman una lnea continua (lnea de identidad) con la lnea entre el suero a probar y el antgeno. La localizacin de la lnea depender de la concentracin de los anticuerpos en la muestra desconocida. Muestras positivas dbiles pueden no producir una lnea completa entre el antgeno y el suero a probar pero pueden causar que la punta de la lnea del control se incline hacia el pocillo de la prueba. Lneas no especficas: Estas lneas ocasionalmente son observadas entre el antgeno y el pocillo del suero a probar. Las lneas control cruzarn las lneas no-especficas y continuarn hasta el pocillo del suero a probar. La lneas no especficas no forman una lnea continua (lnea de identidad) con las lneas de control positivo.

4.12 Deteccin de antgeno (procedimiento alternativo): Las placas son ledas como se describi anteriormente. El virus desconocido es identificado como virus Influenza Tipo A, si se forma una lnea de identidad con el control positivo del antgeno. 4.13 Informe de los Resultados: Los resultados sern informados segn lo descrito por cada laboratorio

Las placas son ledas como se describi anteriormente. El virus desconocido es identificado como virus Influenza Tipo A, si se forma una lnea de identidad con el control positivo del antgeno.

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4.13 Informe de los Resultados:

Los resultados sern informados segn lo descrito por cada laboratorio N 1: Esquema de placa de IDGA-IA.

Figura 1: Esquema de placa de IDGA-IA.

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5. PROTOCOLO PARA LA PRUEBA DE INHIBICIN DE LA HEMOAGLUTINACIN PARA IDENTIFICAR ANTICUERPOS CONTRA SUBTIPOS DE INFLUENZA A

5.1. Abreviaturas: IA: SPF: PBS: IH: HA: H: PBS: BSA: DSP: SA: BPL: Influenza Aviar Specific Pathogen Free o libre de patgenos especficos Solucin tampn salina. Inhibicin de la Hemoaglutinacin Hemoaglutinacin hemoaglutininas, subtipos H1 a H16 fosfato buffer salino Albmina srica bovina Solucin de fosfato disdico Azida de Sodio betapropiolactona

5.2. Reactivos PBS 0,01 M, pH 7,2 Albmina srica bovina, V fraccin Azida de sodio Solucin de Alsever Sangre de pollo Suero control positivo y negativo a anticuerpos contra cada subtipo de H usada en la prueba Antgeno viral inactivado para cada subtipo de H usada en la prueba Beta propiolactona Solucin de fosfato disdico (DSP) 0,5 M

5.3. Materiales y Equipo Requeridos: placas para microttulacin con fondo en U de 96 pocillos con sus respectivas tapas agitador de placas de microttulacin pipetas uni y multicanales congelador (-20 C, -70 C) refrigerador (4C) bomba de vaco conectada a un matraz de kitasato implementado para absorber el gel de agar portadores de microplacas para centrfuga para placas de 96 pocillos pipetas ( serolgicas, 1 ml, 5 ml, 10 ml) puntas para micropipetas (200 ul) cilindro (probeta) graduado ( 100 ml) tubos con tapn a presin de 17 x 100 mm tubos tapados de 15 x 150 mm matraz Erlenmeyer de 250 ml

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tubos cnicos de centrfuga de 50 ml cinta adhesiva para sellar las placas de microttulo

5.4. Preparacin de los Reactivos/ Procedimientos de Control: Lavado de los Eritrocitos: vierta de 10 20 ml de sangre de pollo, conservada en la solucin de Alsever, en un tubo de centrfuga de 50 ml y rellene el tubo con PBS. Invierta el tubo lentamente varias veces para lavar los eritrocitos. Centrifugue a 800 x g (1,800 rpm) por 10 minutos en una centrfuga refrigerada. Aspire el PBS y la costra flogstica del tubo. Rellene el tubo con PBS, Repita el ciclo de lavado y centrifugacin 2 veces ms. Los eritrocitos lavados se pueden almacenar a 4 C hasta por 1 semana. Preparacin de la suspensin de eritrocitos al 0,5 %: vierta 199 ml de PBS en un matraz de Erlenmeyer de 250 ml. Aada 1 ml de eritrocitos lavados al PBS, procurando lavar la pipeta en la solucin hasta que no queden eritrocitos en ella. Los eritrocitos se pueden almacenar a 4 C hasta por 1 semana. Si se observa hemlisis se deben descartar. Preparacin de la suspensin de eritrocitos al 10 %: vierta 9 ml de PBS en un recipiente apropiado. Aada 1 ml de eritrocitos lavados al PBS, procurando lavar la pipeta en la solucin hasta que no queden eritrocitos en ella. Los eritrocitos se pueden almacenar a 4C hasta por 1 semana. Si se observa hemlisis se deben descartar. Albmina Srica de Bovino-PBS-Azida de Sodio al 0,4%: aada 10 ml de BSA al 4% a 89 ml de PBS. Aada 1 ml de solucin de azida de sodio al 10 % al BSA-PBS. Preparacin de los Antgenos de Referencia de la HA: diluya los antgenos de HA con BSA-PBS-AS al 0,4% hasta una concentracin de 8 unidades de HA (UHA) por 50 l (4 UHA/25 l). Preparacin de los Sueros de Referencia: diluya los sueros de referencia a un ttulo entre 1:16 y 1: 64 con BSA-PBS-AS al 0,4%. El ttulo es determinado por la prueba de IH con 4 UHA de antgeno homlogo. Si es necesario remueva las aglutininas naturales del suero de referencia, tratando el suero diluido con 0,1 ml de eritrocitos lavados con 1 ml de suero. Incube a temperatura ambiente por 30 minutos, mezclando ocasionalmente para mantener los eritrocitos suspendidos. Centrifugue el suero tratado a 1,800 rpm por 10 minutos y retenga el suero. El suero diluido se puede conservar por varias semanas a 4 C. Para conservarlo por ms tiempo conglelo a 20 C.

5.5. Preparacin de las Muestras: La muestra que se prefiere para la prueba de IH es el suero. Tambin se puede usar plasma, pero bajo ciertas condiciones el plasma puede coagular y resultando inutilizable. Las muestras sanguneas deben ser de buena calidad, libres de contaminacin bacteriana y sin hemlisis. Las muestras obtenidas de vitelo o de sangre seca en tiritas de papel filtro, tambin se pueden usar para la prueba de IH. Si fuera necesario (cuando se observa autoaglutinacin en el suero control con suero y eritrocitos nicamente) trate el suero, plasma o vitelo para remover las aglutininas naturales antes de usar las muestras en la prueba de IH. El suero es tratado en la dilucin de 1: 4 (1 parte de muestra, 2 partes de PBS y 1 parte de eritrocitos al 10%. Cuando se combinan volmenes equivalentes de suero

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tratado y antgeno en la prueba de IH la dilucin inicial es de 1: 8. Se debe tratar una suficiente cantidad de suero para probar cada muestra de suero con los antgenos seleccionados para la prueba. Por ejemplo si la muestra ser probada contra los 16 subtipos de H, entonces aproximadamente 0,4 ml de suero tratado se requerir. Si una placa de microtitulacin de 96 pocillos es usada para el suero tratado, se requerirn varios pocillos para cada suero (coloque los sueros en la placa usando el mismo formato que para la IH, para que as se puedan transferir varios sueros simultneamente a las placas de IH). En una dilucin de 1: 4 del suero resulta el siguiente mtodo para tratar suero en placas de microtitulacin: - - vierta 100ul de PBS en 3 pocillos por cada suero a ser tratado aada 50 ul de suero/ plasma/ extracto de yema a cada pocillo aada 50 ul de suspensin de eritrocitos al 10 % a cada pocillo mezcle en el agitador de placas e incube a temperatura ambiente por 30 minutos, mezclando cada 10 minutos o lo suficiente para mantener los eritrocitos suspendidos. centrifugue las placas a 1000 rpm en una centrfuga Beckman J6-B o similar, hasta obtener la sedimentacin de los eritrocitos.

5.6. Procedimientos de la Prueba 5.6.1. Prueba de HA La prueba de HA se usa para estandarizar los subtipos de antgenos H para la prueba de IH. a. vierta 50 ul de PBS en una fila de 12 pocillos de la placa de microtitulacin para cada subtipo de antgeno H usado en la prueba. Una fila adicional de pocillos se debe incluir para un control positivo de HA. Aada 50 ul de antgeno sin diluir al primer pocillo correspondiente a cada fila. Diluya el antgeno en diluciones dobles (primero en el dcimo primer pocillo) con una micropipeta multicanales ajustada para depositar 50 ul. Las diluciones resultantes van de 1:2 en el primer pocillo, hasta 1:2048 en el dcimo primer pocillo; la dcimo segunda fila (que slo contiene PBS) ser el control de glbulos rojos.

b. c.

d. Aada 50 ul de eritrocitos en suspensin al 0,5% a cada pocillo y agite la placa hasta que se mezclen los reactivos. Nota: mantenga los eritrocitos suspendidos durante el proceso. e. Cubra la placa con cinta adhesiva e incube a temperatura ambiente hasta que se forme un botn en el pocillo de control de glbulos (generalmente esto toma de 20 a 30 minutos). Anote los resultados de la siguiente forma: los pocillos con una hemoaglutinacin completa sern anotados con un + (HA positivo); los pocillos con un botn sern anotados como - (HA negativo); los pocillos con una formacin parcial de botn (apariencia de donut o con mrgenes difusos) sern anotados con una I (HA incompleto). Cuando la interpretacin entre una HA completa e incompleta sea dudosa, incline la placa 45 por 20 a 30 segundos y mire si se forma una lgrima de eritrocitos en los pocillos con inhibicin completa; pocillos con HA parcial no presentarn lgrimas.

f.

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g.

La ltima titulacin (el punto final) es la dilucin ms alta de antgeno, que causa HA completa. La dilucin final es considerada 1 UHA; 8 UHA en 50 ul (4 UHA en 25 ul) son usadas en la prueba IHA. La dilucin que contiene 8 UHA se determina dividiendo el punto final por 8 (el nmero deseado de UHAs). Por ejemplo si el ltimo ttulo de HA era 1: 256, entonces la dilucin que contendr 8 UHA en 50 ul ser 1:32 (256/8). Haga cantidades apropiadas de antgeno de 8 UHA diluyendo el antgeno con BSA-PBS al 0,4%.

h.

5.6.2. Prueba de IH 5.6.2.- Prueba de IH Nota: el procedimiento descrito a continuacin sirve para analizar muestras de suero/ plasma/ extracto de yema de huevo contra cualquiera de los 16 subtipos de Nota: el procedimiento descrito a continuacin sirve para analizar muestras de suero/ H del virus de la Influenza A. Para ahorrar tiempo y de los 16 subtipos de seguidas plasma/ extracto de yema de huevo contra cualquiera recursos 3 diluciones H del virus de la InfluenzayA. Para ahorrar tiempo y sern probadas contra cada antgeno. y 1:32) de (1:8, 1:16 1:32) de cada muestra recursos 3 diluciones seguidas (1:8, 1:16 cada muestra sern probadas contra cada antgeno. a. Marque una placa de microtitulacin para analizar cada muestra. Incluya una fila adicional para cada subtipo que servir como control positivo. Las placas fila a. Marque una placa de microtitulacin para analizar cada muestra. Incluya una adicionales se deben marcar de que servir como control positivo. subtipos adicional para cada subtipo manera similar para los restantes Las placas de H. Tambin se debe incluir un suero control (25 ul de suero prueba + 25 ul H. adicionales se deben marcar de manera similar para los restantes subtipos de Tambin se debe incluir un control de eritrocitos suero prueba + 25 ul de PBS) de PBS) para cada suero y un suero control (25 ul de(50 ul PBS). Nota: slo se para cada suero control positivo por subtipo. requiere por pruebay1un control de eritrocitos (50 ul PBS). Nota: slo se requiere por prueba 1 control positivo por subtipo.

H1

H2

H3

H4

FIGURA 1: Ejemplo de patrn de microtitulacin para la identificacin de subtipos de H de los anticuerpos Figura de suero/ de patrn de en muestras 2: Ejemploplasma/ vitelo. microtitulacin para la identificacin de subtipos de H de los anticuerpos en muestras de suero/ plasma/ vitelo.

b. Vierta 25 !l de antgeno H estandarizado (8 UHA/ 50 ul) en la serie correspondiente de 3 pocillos para cada subtipo de H. Adicionalmente, una titulacin reversa (IH hecha con la titulacin usada en la prueba) se hace para todos los subtipos de antgenos H, lo que sirve para asegurarse de que las UHAs correctas estn presentes. Las titulaciones reversas se hacen como se describi anteriormente el proceso de la IH, excepto que se usan 6 diluciones en pocillos, en vez de 11. Nota: se le debe dar especial atencin a la seleccin de los antgenos usados en la prueba de HA para evitar que se homologuen neuroaminidasas con las muestras. Cuando la muestra que se somete a la prueba contiene el mismo

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b.

Vierta 25 l de antgeno H estandarizado (8 UHA/ 50 ul) en la serie correspondiente de 3 pocillos para cada subtipo de H. Adicionalmente, una titulacin reversa (IH hecha con la titulacin usada en la prueba) se hace para todos los subtipos de antgenos H, lo que sirve para asegurarse de que las UHAs correctas estn presentes. Las titulaciones reversas se hacen como se describi anteriormente el proceso de la IH, excepto que se usan 6 diluciones en pocillos, en vez de 11. Nota: se le debe dar especial atencin a la seleccin de los antgenos usados en la prueba de HA para evitar que se homologuen neuroaminidasas con las muestras. Cuando la muestra que se somete a la prueba contiene el mismo subtipo de neuroaminidasa que el antgeno se pueden generar falsos positivos, causados por una inhibicin estrica (inhibicin causada por la interaccin de antgenos y anticuerpos homlogos de neuroaminidasas).

c. d.

Aada 25 l del o de los sueros tratados con eritrocitos con una micropipeta multicanales al primer pocillo. Diluya seriadamente el los sueros, comenzando por el primer pocillo (dilucin del suero de 1: 8), hasta el tercer pocillo (dilucin de suero de 1: 32) con una pipeta multicanales que dispense 25 ul. Nota: las diluciones seriadas para cada subtipo de H se deben realizar lo antes posible, tras adicionar las muestras de eritrocitos tratados al antgeno. Repita los dos pasos anteriores para cada subtipo de H. Cubra la placa e incube por 30 minutos a temperatura ambiente. Aada 50 l de suspensin de eritrocitos al 0,5% a cada pocillo y agite la placa hasta que se mezcle bien. Cubra la placa con su cinta adhesiva e incube a temperatura ambiente hasta que se forme el botn en el pocillo del control positivo (de 20 a 30 minutos). Anote los resultados: pocillos con una completa hemoaglutinacin sern anotados como + (HA positivo); los pocillos con un botn sern anotados como - (HA negativo); los pocillos con una formacin parcial de botn (apariencia de donut o con mrgenes difusos) sern anotados con una I (HA incompleto). Cuando la interpretacin entre una HA completa e incompleta sea dudosa, incline la placa 45 por 20 a 30 segundos y mire si aparece una lgrima de eritrocitos en los pocillos con inhibicin completa; pocillos con HA parcial no presentarn lgrimas. Nota: los pocillos con una inhibicin completa deben formar una lgrima al igual que el pocillo del control positivo. Los pocillos con inhibicin completa o incompleta, que muestren una formacin tarda de la lgrima en comparacin con el control positivo no deben interpretarse como IHA.

e. f. g. h. i.

5.6.3 Interpretacin de los Resultados a. las muestras de extractos de yema/ suero /plasma se considerarn positivas (indican exposicin) si la IHA se observa a una dilucin de 1: 8 o mayor. Los ltimos pocillos con IHA sern anotados como la mayor dilucin del suero, causando una IHA completa. La prueba se considerar valida si: si el nmero correcto de UHAs (8/ 50 ul) para cada subtipo H del antgeno est presente, lo que es determinado por la titulacin reversa. las muestras para IH de sueros/ plasma/ extracto de yema tienen diferentes subtipos de neuroaminidasas que el antgeno usado en la prueba.

b.

25

c. d.

si el suero control (suero + PBS) no muestra HA. si los ttulos esperados de IH se observan en el antgeno homlogo y en el antisuero. Si estas condiciones no se cumplen, la prueba se debe repetir. Si los eritrocitos en el pocillo de control de glbulos no forman un botn bien definido, puede deberse a: Incorrecta formulacin del PBS Excesiva evaporacin de las placas durante la prueba Eritrocitos viejos Incorrecta concentracin de eritrocitos Los resultados obtenidos se deben registrar debidamente y ser reportados al organismo pertinente.

5.6.4. Apndice a PBS, 0,01 M y pH 7,2: combine los siguientes reactivos: 8,5 grs de cloruro de sodio, 1,33 grs de fosfato dibsico de sodio, 0,22 grs de fosfato monobsico de sodio, agua destilada hasta alcanzar 1 lt. Almacene a temperatura ambiente. Albmina Srica Bovina (ASB) al 4%, fraccin V: disuelva 4 grs de ASB, fraccin V, en 100 ml de agua destilada, esterilice por filtracin (filtro de 0,22um). Guarde a 4C. Solucin de Alsever: combine los siguientes reactivos: 8 grs de citrato de sodio, 0,55 grs de cido ctrico, 4,2 grs de cloruro de sodio, 20,5 grs de dextrosa y agregue agua destilada hasta alcanzar 1 lt. Autoclave o esterilice con filtro. Guarde a 4C. Azida de Sodio al 10%: pese 10 grs de azida de sodio, agregue agua destilada hasta alcanzar los 100 ml. Guarde a temperatura ambiente. Recoleccin de Sangre de Ave: dispense 10 ml de solucin estril de Alsever en un frasco limpio. Anestesie al ave donante con 1 ml de ketamina/ Xilacina (10 ml de ketamina + 0,1 ml de xilacina). Cuando el ave est lo suficientemente anestesiada, recolecte 10 ml de sangre va puncin cardaca, con una jeringa de 20 ml y con una aguja de 20 G. Remueva la aguja y vierta la sangre con cuidado en el frasco con solucin Alsever. Mezcle despacio, pero profundamente. Eritrocitos de pollo en solucin de Alsever se pueden almacenar por 1 a 2 semanas a 4 C.

b.

c.

d. e.

5.6.5. Preparacin del Antgeno de HA inactivado: a. Inocule en el saco alantoideo de embriones de pollo de 9 a 11 das de edad con 0,1 ml de una dilucin de virus de 10-3. Nota: la dilucin del virus puede variar, dependiendo de la cepa de virus usada. Incube los huevos inoculados a 35-37 C por 3 a 4 das. Revise los huevos diariamente con un ovoscopio; descarte los huevos que mueran el primer da tras la inoculacin. Deje enfriar toda una noche los huevos, a 4 C y coseche el lquido alantoideo/ amnitico (LAA), que contendr el virus, de todos los huevos inoculados (huevos con embriones vivos y muertos).

b.

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c.

Purifique el lquido con antgeno obtenido al centrifugar a 2500 rpm en una centrfuga de Beckman J6-B o similar por 20 minutos. Retire el sobrenadante y gurdelo en un matraz de Erlenmeyer con tapa de vidrio a 4C. Nota: antes del siguiente paso se debe evaluar la capacidad hemoaglutinante del antgeno. Inactive el virus con betapropiolactona (BPL) en una concentracin final de 0,1 % por 2 horas a temperatura ambiente., luego que pase la noche a 4C. La suspensin viral debe ser constantemente mezclada durante el proceso de inactivacin. Nota: la BPL es cancergena y debe tratarse como tal. BPL se transforma en segura en una solucin de PBS al 1%. Aada 10 ml de BPL al 1% a 90 ml de LAA. La BPL diluida se debe usar dentro de 1 hora despus de diluida.

d.

e. Ajuste el pH del antgeno a 7.0 con bicarbonato de sodio al 10% (1 gr de bicarbonato de sodio ms agua hasta llegar a los 100 ml). Generalmente se requiere 1 a 2 ml por 100 ml de antgeno. f. Purifique el antgeno al centrifugarlo a 2500 rpm en una centrfuga Beckman J6-B o similar durante 20 minutos, este proceso se hace para remover el precipitado que se pudo haber formado durante el proceso de inactivacin. Verifique si el antgeno tiene virus viables inoculando virus inactivado en una dilucin de 1:10 en embriones de pollo. El antgeno se puede almacenar a 70C hasta que se complete la verificacin de la inactivacin. Descongele el antgeno (si se congel) y centrifguelo nuevamente. Aada Azida de Sodio al 10% como conservador, para lograr una concentracin final de 0,1% (1ml en 99 ml de antgeno). Guarde en un frasco debidamente rotulado el antgeno inactivado y almacnelo a 70C. Tras descongelarlo el antgeno se puede guardar a 4C por meses hasta un ao. Nota: el antgeno debe reevaluarse con la prueba de HA antes de guardarlo en el frasco, para asegurarse que la actividad HA del antgeno permanece estable.

g.

h.

i.

5.6.6. Prueba para asegurarse de la inactivacin del virus vivo con BPL a. Diluya el antgeno inactivado a 1:10 con medio de antibitico 10T, inocule 0,1 ml en cada uno de los 4 o 5 huevos embrionados SPF de 9 a 11 das de edad, va saco alantodeo.

b. Incube los embriones a 35-37C por 3 a 4 das. Revselos diariamente con el ovoscopio; descarte los muertos el primer da. c. Coseche el LAA de los huevos con embriones muertos y vivos (enfre los vivos a 4C la noche anterior).

d. Centrifugue el LAA obtenido a 1500 x g durante 10 minutos y pruebe la actividad de HA. e. Si se detecta actividad HA repita la inactivacin con BPL, si no se detecta accin HA haga un segundo pasaje en huevos embrionados. El antgeno se considerar libre de virus viable si no existe actividad HA despus del segundo pasaje en embriones de pollo.

f.

5.6.7. Referencia Rpida a. Prueba HA: Seleccione antgenos y antisueros

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Vierta PBS en las placas Aada antgenos desconocidos y control positivo Diluya los antgenos en forma seriada Aada los eritrocitos Incube durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente Lea y anote los resultados Seleccione los antgenos y antisueros Marque las placas Dispense 4 UHAs/ 25 ul de antgeno desconocido y positivo Aada antisuero estandarizado Diluya los antisueros en forma seriada Incube durante 30 minutos Aada los eritrocitos Incube durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente Lea y anote los resultados

b. Prueba IHA:

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6.

PROTOCOLO PARA EL PROCEDIMIENTO DE INHIBICIN DE LA NEUROAMINIDASA PARA IDENTIFICAR SUBTIPOS DE NEUROAMINIDASAS DE LOS VIRUS INFLUENZA TIPO A, A TRAVES DE SUS ANTICUERPOS

6.1. Materiales y Equipo Requeridos Bao mara (56C) Agitador de placas de microttulo Pipetas uni y multicanales Congelador (-20 C, -70 C) Refrigerador (4C) Centrfuga refrigerada

6.2. Reactivos Placas para microtitulacin blancas y de poliestireno, de 96 pocillos (laboratorios Flow 76-916-05, 50IS-MRC o su equivalente) Micropipetas de diversos calibres. Pipetas (serolgicas, 1 ml, 5 ml y 10 ml) Puntas para micropipetas (200 ul) Probeta graduada ( 100 ml) Tubos de 12 x 75 mm Frascos tapa rosca. Fetuina de suero fetal bovino (Sigma, F-2379) Periodato de sodio (meta) (Fisher, S398-100) m-arsenito de sodio (Sigma S-1631) Acido 2-tiobarbitrico (Eastman Kodak, 660) PBS 0,01 M, pH 7,2 (ver apndice 8.1) PBS 0,4 M, pH 5,9 (ver apndice 8.2) Albmina srica bovina, fraccin V Azida de sodio cido sulfrico cido fosfrico al 85% Sellantes para placas de microtitulacin Antisuero para cada uno de los 9 subtipos de neuroaminidasa y un suero negativo de referencia Portadores de microplacas para centrfuga para placas de 96 pocillos Antgeno viral inactivado para cada uno de los subtipos de neuroaminidasa y un antgeno negativo

6.3 Preparacin para la Prueba El personal debe estar familiarizado con el manejo apropiado, dilucin, pipeteo, almacenamiento y desecho de reactivos y materiales biolgicos de la prueba. Nota: algunos reactivos en este protocolo son peligrosos/ txicos. El personal debe estar familiarizado con la calibracin, el mantenimiento y el uso de los instrumentos incluidos en este protocolo.

29

El equipo/instrumentos de la prueba deben estar debidamente calibrados y certificados.

6.4. Preparacin de los Reactivos/ Procedimientos de Control Preparacin de la Fetuina (12,5 mg/ ml): disuelva 250 mg de Fetuina en 10 ml de agua destilada estril. Aada 10 ml de PBS 0,4M - pH 5,9, estril. Almacene la Fetuina a 20C. Periodato de Sodio: disuelva 4,28 grs de m-periodato de sodio en 38 ml de agua destilada. Aada cuidadosamente 62 ml de cido fosfrico concentrado y mezcle. Almacene a temperatura ambiente en una botella mbar o cubierta en un lugar oscuro y fro. Reactivo de Arsenito al 50 %: disuelva 50 grs de arsenito de sodio en 100 ml de agua destilada. Aada 1,5 ml de cido sulfrico concentrado (precaucin: adalo lentamente) y mezcle. Gurdelo a temperatura ambiente. cido tiobarbitrico al 0,6%: disuelva 0,6 grs de cido tiobarbitrico en 100 ml de agua destilada, calentndolo en bao mara, revolvindolo frecuentemente, en una placa caliente con un agitador magntico. Gurdelo a temperatura ambiente. Albmina Srica de Bovino (BSA)-PBS (0,01M, pH 7,2)-Azida de Sodio al 0,4%: aada 10 ml de BSA al 4% a 89 ml de PBS en un frasco. Aada 1 ml de solucin de azida de sodio al 10 % al BSA-PBS. Preparacin de los Sueros de Referencia y del Control Negativo: determine la dilucin ptima para cada antisuero de referencia al titular el suero y seleccionando la mayor dilucin que provea buena inhibicin (comparado con un control positivo estndar); las diluciones ptimas del suero usualmente van de 1:4 a 1:10. La dilucin del suero negativo debera ser la misma que la menor dilucin usada por cualquiera de los antisueros. Diluya el suero con BSA-PBS-AS al 0,4% y luego inactvelo a 56C por 30 minutos. Los sueros diluidos se pueden almacenar por varias semanas a 4C congelarse a 20C para almacenamientos de larga tiempo. Preparacin de los Antgenos de Referencia: antgenos de referencia para cada uno de los 9 subtipos de N se propagan en huevos embrionados de pollo y titulados para determinar la dilucin ptima para la prueba. En caso de que no se puedan replicar en el laboratorio, stos pueden ser adquiridos en los centros de referencia (NVSL, etc.).

6.5. Preparacin de las Muestras Suero, plasma y yema de huevo son muestras aptas para la prueba. Las muestras de huevo deben ser procesadas como esta estipulado en el protocolo de procedimientos para extraccin de yema. Diluya 0.2 ml de suero/plasma/yema con 0.25 ml PBS. El calor inactiva el suero diluido a 56 C durante 30 minutos.

6.6. Procedimientos de la Prueba 6.6.1 Titulacin del antgeno Neuroaminidasa

30

La prueba de titulacin de N se debe realizar para todos los antgenos controles positivos usados en la prueba de IN. El procedimiento es como sigue: a. Dibuje una lnea divisoria en la placa de microtitulacin de 96 pozos con fondo en U, procurando que divida la placa por la mitad (entre el 6 y 7 pocillo). Seis pocillos se requieren para cada antgeno. Usando esta configuracin, 16 u 8 antgenos se pueden titular por cada placa, dependiendo si se hace una titulacin simple o duplicada.

b. agregue 25 l de PBS del 2 al 6 pocillo en cada fila por usarse. c. Aada 50 l de antgeno al primer pocillo de la fila correspondiente o de las filas de 6 pocillos. d. Haga diluciones dobles seriadas (25 l de volumen) de antgeno, empezando por el primer pocillo (no diluido) hasta el sexto pocillo (1: 32). Las diluciones se hacen con una pipeta multicanales. e. Aada 25 l de PBS (0,01 M, pH 7,2) a todos los pocillos. f. Mezcle en un agitador de placas de microttulo por 10 a 15 segundos e incube a T ambiente por 1 hora (+/-15 minutos). Cubra la placa para prevenir evaporacin. Mezcle en un agitador de placas de microtitulacin por 10 a 15 segundos. Cubra la placa e incube a 37C por 3 horas. Aada 25 l de reactivo periodato a cada pocillo. Mezcle en un agitador de placas de microtitulacin por 10 a 15 segundos. Cubra la placa e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos (+/- 2).

g. Aada 25 l de Fetuina a cada pocillo h.

i. j.

k. Aada 25 l de reactivo de arsenito de sodio a cada pocillo. Nota: la adicin del reactivo de arsenito de sodio causar la formacin de un precipitado caf oscuro. l. Mezcle en un agitador de placas de microtitulacin hasta que se decolore el color caf oscuro (esto puede requerir varios minutos).

m. Aada 100 l del reactivo de cido tiobarbitrico al 0.6 % a todos los pocillos. n. Use papel absorbente en la placa para quitar la humedad. Cubra la placa con cinta adhesiva. Haga pequeos agujeros del porte de un alfiler en la cinta adhesiva, sobre cada pocillo para permitir la expansin en el siguiente paso. Lea los resultados al invertir la placa para ver el color a travs de la cinta adhesiva. La dilucin ptima de antgeno se determina seleccionando la mayor dilucin que de un color rosado medio. Se debe seleccionar un color uniforme para todos los aislamientos, los que se compararn de cerca con los controles previamente estandarizados.

o. Deje la placa sellada flotar a bao mara a 56C durante 30 minutos. p. q.

6.6.2 Identificacin de Anticuerpos anti Neuroaminidasa a. Marque una placa de microtitulacin como se indica en la figura 1, que muestra el patrn para la identificacin de anticuerpos para la neuroaminidasa en suero. Nota: solo un set de controles se necesitan por prueba..

31 a. Marque una placa de microtitulacin como se indica en la figura 1, que muestra el patrn para la identificacin de anticuerpos para la neuroaminidasa en suero. Nota: solo un set de controles se necesitan por prueba.

N1

N2

N3 N4

N5

N6

N7

N8

N9

Neg

pocillos vacos

b. las filas se enumeran del 1 al 6, siendo la penltima (fila 7 o G) Antisuero positivo/ Antgeno positivo y la ltima (fila 8) Suero negativo/ Antgeno positivo.

b. c. filas se enumeran del 1 inactivado en los primeros 10 pocillos de la fila horizontal las Aada 25 !l del suero al 6, siendo la penltima (fila 7 o G) Antisuero positivo/ correspondiente. Tambin aada 25 !l de cada antisuero control positivo en el Antgeno positivo y la ltima (fila 8) Suero negativo/ Antgeno positivo. pocillo correspondiente in la fila G. Dispense suero negativo en las primeras 10 pocillos de la fila H. c. Aada 25 l del suero inactivado en los primeros 10 pocillos de la fila horizontal correspondiente. Tambin aada 25 l de cada antisuero control positivo en el d. Aada 25 !l del antgeno de Neuroaminidasa previamente estandarizado en las pocillo correspondiente in la fila G. Dispense suero negativo en las primeras columnas verticales 10 pocillos de la fila H. correspondientes e identificadas desde la N1 a la N9 para cada suero a probar (pocillos A-F) y en los pocillos controles G y H. Dispense d. Aada 25 l del antgeno de Neuroaminidasa previamente estandarizado en antgeno negativo (FAA normal) en la columna marcada Negativa (pocillos A-H). las columnas verticales correspondientes e identificadas desde la N1 a la e. Mezcle en suero a probar (pocillos A-F) y en los pocillos controles G y H. e N9 para cada un agitador de placas de microtitulacin por 10 a 15 segundos incube a temperatura ambiente normal) en la (+/-15 minutos). Cubra la placa Dispense antgeno negativo (FAA durante 1 hora columna marcada Negativa para A-H). (pocillosprevenir evaporacin. e. f. Aada 25 !lagitador de cada pocillo.microtitulacin por 10 a 15 segundos Mezcle en un de fetuina a placas de e incube a temperatura ambiente durante 1 hora (+/-15 minutos). Cubra la g. Mezcle en un agitador de placas de microtitulacin durante 10 a 15 segundos. placa para prevenir evaporacin. Cubra la placa e incube a 37C (+/-2) durante 3 horas. f. Aada 25 l de fetuina a cada pocillo. g. h. Aada 25 !l de reactivoplacas de microtitulacin durante 10 a 15 segundos. Mezcle en un agitador de periodato a cada pocillo. Cubra la placa e incube a 37C (+/-2) durante 3 horas. Mezcle en un agitador de placas de microtitulacin durante 10 a 15 segundos. Cubra la placa e incube a temperatura ambiente h. Aada 25 l de reactivo periodato a cada pocillo. durante 20 minutos (+/- 2).
i.

i. j.

Mezcle en un agitador de placas de microtitulacin durante 10 a 15 segundos. Cubra la placa e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos (+/- 2). Aada 25 l de reactivo de arsenito de sodio al 50% a cada pocillo, usando 28 una pipeta multicanales. Nota: la adicin del reactivo de arsenito de sodio causar la formacin de un precipitado caf oscuro.

32

k.

Mezcle vigorosamente en un agitador de placas de microtitulacin, hasta que en todos los pocillos hayan cambiado del color caf oscuro a un color mbar claro o mbar un poco amarillento (esto puede requerir varios minutos). Aada 100 l del reactivo de cido tiobarbitrico al 0.6 % a todos los pocillos.

l.

m. Use papel absorbente en la placa para quitar la humedad. Cubra la placa con cinta adhesiva. Haga pequeos agujeros del porte de un alfiler en la cinta adhesiva, sobre cada pocillo para permitir la expansin en el siguiente paso. n. Deje la placa sellada flotar a bao mara a 56C por 30 minutos. Nota: las placas pueden llegar a requerir un perodo ms largo (5 a 30 minutos ms) si el desarrollo del color es lento. o. Lea los resultados al invertir la placa para ver el color a travs de la cinta adhesiva.

6.7. Interpretacin de los Resultados. La interpretacin de los resultados est basada en la diferencia de intensidad del color observada entre el suero problema y el correspondiente antgeno control N positivo. Los resultados se anotan para cada pocillo as: color rosado = negativo (no hubo inhibicin), El anticuerpo no es de ese subtipo de neuroaminidadsa; si no es color rosado o es un color muy dbil (comparado con el mismo antgeno contra suero negativo) = positivo (inhibicin), el anticuerpo es del subtipo de neuroaminidadsa que se analiza. El Control antgeno N positivo contra el suero negativo debe tener un color rosado medio uniforme. Control antgeno N positivo contra un antisuero homlogo debera mostrar una ausencia de color rosado o una reduccin significativa del color rosado, cuando se compara con el suero negativo. Si el antgeno N positivo no es apropiadamente estandarizado (antgeno muy fuerte o dbil la interpretacin puede ser difcil o se pueden dar resultados falsos negativos). Los resultados obtenidos se deben registrar debidamente como positivos (+, inhibicin), negativos (-) o no analizados.

6.8. Referencias Aminoff, D. 1959. The Determination of free sialic acid in the presence of the bound compound. Virology 7: 355-357. Warren, l. 1959. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. Journal of Biological Chemistry 234 (8): 1971-1975. Aminoff, D. 1961. Methods for the quantitative estimation of N-acetyl neuraminic acid and their application to hydrolysates of sialomucoids. Biochem. J. 81: 384. Palmer, D.F., M.T. Coleman, W.R. Dowdle, y G.C. Schild; Advanced Laboratory Techniques for Influenza Diagnosis, Procedural Guid, Inmunology series No 6 U.S. Department of Health, Education and Welfare, Atlanta, Georgia. Van Deusen, R. A., V. S. Hinshaw, D. A. Senne, and D. Pellacani. 1983. Micro-neuraminidase- inhibitions assay for classification of Influenza A virus neuraminidases. Avian Diseases 27 (3): 745- 750.

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6.9. Apndice a. PBS, 0,01 M y pH 7,2: combine los siguientes reactivos: 8,5 grs de cloruro de sodio, 1,33 grs de fosfato dibsico de sodio, 0,22 grs de fosfato monobsico de sodio, agua destilada hasta alcanzar 1 lt. Almacene a temperatura ambiente. PBS, 0,4 M y pH 5,9: combine las siguientes soluciones: 190 ml de la solucin a y 810 ml de la solucin b y ajuste el pH a 5,9 usando solucin a b. Solucin 1: Na2HPO4 56,78 gr/lt Solucin 2: Na2HPO4 55,2 gr/lt c. Albmina Srica Bovina al 4%, fraccin V: disuelva 4 grs de ASB, fraccin V, en 100 ml de agua destilada, esterilice por filtracin (filtro de 0,22-um). Guarde a 4C. Preparacin del Antgeno N: Inocule en el saco alantoideo de huevos embrionados de 9 a 11 das de edad con 0,1 ml de una dilucin de virus de 10-3. Incube los huevos inoculados a 35-36 C por 3 a 4 das. Revise los huevos diariamente con un ovoscopio; descarte los huevos que mueran el primer da tras la inoculacin. Deje enfriar toda una noche los huevos, a 4 C y coseche el lquido alantoideo/amnitico (LAA), que contendr el virus. De todos los huevos inoculados (huevos con embriones vivos y muertos). Inactive el virus con betapropiolactona (BPL) en una concentracin final de 0,1 % por 2 horas a temperatura ambiente, luego que pase la noche a 4 C. La suspensin viral debe ser constantemente revuelta durante el proceso de inactivacin. Nota: la BPL es cancergena y debe tratarse como tal. BPL se transforma en segura como una solucin de PBS al 1%. Aada 10 ml de BPL al 1% a 90 ml de LAA. La BPL diluida se debe usar dentro de 1 hora despus de diluida. Ajuste el pH del LAA a 7.0 con bicarbonato de sodio al 10% (1 gr de bicarbonato de sodio ms agua hasta llegar a los 100 ml). Generalmente se requiere 1 a 2 ml por 100 ml de LAA. Verifique si el LAA tiene virus viables inoculando virus inactivado en una dilucin de 1: 10 en huevos embrionados. Centrifugue el antgeno a 2500 rpm en una centrfuga Beckman J-6B o similar para remover el precipitado que se puede formar durante el proceso de inactivacin. Adale Azida de Sodio al 10% como preservante, para lograr una concentracin final de 0,1% (1ml en 99 ml de FAA). Guarde en un frasco debidamente rotulado y almacnelo a 70C. Tras descongelarlo, el antgeno se puede guardar a 4 C por meses a un ao.

b.

d.

6.10. Prueba para asegurarse de la inactivacin del virus vivo con BPL Diluya el antgeno inactivado a 1:10 con medio de antibiticos 10T) e inocule 0,1 ml en cada uno de los 4 o 5 huevos embrionados SPF de 9 a 11 das de edad, va saco alantodeo. Incube los huevos a 35-37C por 3 a 4 das. Revselos diariamente con el ovoscopio; descarte los muertos el primer da.

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Coseche el LAA de los huevos con embriones muertos y vivos (enfre los vivos a 4C la noche antes). Centrifugue el LAA obtenido a 1500 x g por 10 minutos y verifique la actividad de HA. Si se detecta actividad HA repita la inactivacin con BPL, si no se detecta HA haga un segundo pasaje en huevos embrionados. El antgeno se considerar libre de virus viable si no existe actividad HA despus del segundo pasaje por los huevos embrionados.

6.11 Referencia Rpida Marque las placas blancas con fondo U Dispense suero negativo y positivo Aada LAA para desconocidos y controles Mezcle e incube por una hora a temperatura ambiente Aada Fetuina, mezcle e incube durante 3 horas a 37C Aada el reactivo de periodato Mezcle e incube durante 20 minutos Aada el reactivo de arsenito de sodio Mezcle hasta que desaparezca el color caf Aada el cido tiobarbitrico Selle las placas, incube a bao mara a 56C durante 30 minutos Lea y anote los resultados

35

7.

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA AISLAMIENTO VIRAL EN HUEVOS EMBRIONADOS

7.1. Definiciones y Abreviaturas: IA: Influenza Aviar SPF: Specific Pathogen Free o libre de patgenos especficos PBS: fosfato buffer salino. IH: Inhibicin de la Hemoaglutinacin HA: Hemoaglutinacin IN: inhibicin de la neuraminidasa FAA o LAF: fluido alantoideo/ amnitico TBT: caldo de triptosa tris buffer

7.2. Materiales y Equipo Requeridos: a. Caldo de triptosa trisbuffer (TBT) que contenga 10T y 33T de antibiticos, u otro medio de transporte (vea procedimiento de Preparacin de Antibiticos para tratar Inculos para Aislamiento Viral en Huevos Embrionados.) Materiales para preparar una suspensin de tejidos estriles (mortero, homogenizador de tejidos, etc). Tijeras y pinzas estriles. Desinfectantes apropiados para el virus. Pipetas (2, 5 y 10 ml). Gabinete de bioseguridad clase II. Guantes de ltex estriles. Trulas (hisopos) estriles. Bolsas de plstico (para congelar tejidos). Recipiente de 250 600 ml, con desinfectante apropiado (para desinfectar tijeras y pinzas). Recipiente cubierto, situado fuera de la cmara (para poner material de vidrio y morteros contaminados). Propipetas. Centrfuga con fuerza de 2000 x g. Recipiente pequeo para desechar envoltorios, puntas, etc. en la campana. Frascos estriles con tapa. Vrtex.

b.

7.3. Procedimiento para Procesar Trulas (hisopos): a. Prepare e identifique con el nmero del protocolo correspondiente y el nmero de muestras en el tubo de cada trula y ponga un duplicado en un frasco estril que contenga 1,3 ml de TBT con antibiticos al 33T.

b. agite el tubo con la muestra en el vrtex y centrifugue a 1500 x g (2500 rpm en una centrfuga Beckman J-6B con un rotor de 4.2 JS) o similar durante 20 a 30 minutos a 4C.

36

c.

Remueva aspticamente 2,5 ml de sobrenadante con una pipeta de 2 ml y agrguelo a su correspondiente frasco con antibiticos. Nota: si hay menos de 2 ml de sobrenadante en el tubo de la muestra, se le debe agregar TBT basal (sin antibiticos) para obtener los 2,5 ml necesarios, si no cambiara la concentracin final de antibiticos.

d. Incube la mezcla de la muestra con antibiticos por aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente antes de inocularlo en embriones de pollo.

7.4. Procedimiento para Procesar Tejidos obtenidos de Aves Enfermas: a. Sacrifique y coloque el ave, los tubos con antibiticos, el homogenizador, los hisopos (trulas), las tijeras, las pinzas, etc. en una cmara de bioseguridad limpia. Nota: encienda la cmara al menos durante 5 minutos antes de usarla. Pngase los guantes estriles y deje su envoltorio estril hacia arriba, dentro del gabinete, para proveer un campo de trabajo estril. Recolecte las trulas traqueales y cloacales antes de abrir el ave. Coloque las trulas en un tubo conteniendo 3,5 ml de medio de transporte (TBT) conteniendo antibiticos 10T (las trulas de una misma ave se separan las traqueales de las cloacales). Nota: agite los hisopos en el medio de transporte para que libere el contenido de las fibras y luego deseche las trulas. Proceda a abrir el ave, separe los diferentes fragmentos de rgano y triturelos en un homogenizador o con un mortero. Nota: Arena estril se puede usar con el mortero para facilitar el proceso de molienda. coloque el tejido triturado en el tubo etiquetado y cirrelo. Al terminar ponga los tejidos sobrantes en una bolsa plstica limpia e identifquelos (nmero del protocolo de acceso y fecha en que se recibi en una tarjeta de notas) para su almacenamiento. Transfiera el mortero contaminado a un recipiente cubierto para esterilizar por autoclave. Limpie la cmara con desinfectante y lvese las manos y los brazos con jabn antisptico. Agite cuidadosamente el tubo, bien cerrado, de las muestras obtenidas de las trulas y los tejidos en el vrtex. Centrifugue las suspensiones durante 20 a 30 minutos a 2500 rpm a 4C. Remueva aspticamente el sobrenadante de cada tubo y pngalo en un tubo estril tapado. Incube la mezcla de la muestra con antibiticos cerca de 1 hora a temperatura ambiente antes de inocularlo en los embriones de pollo.

b. c.

d.

e. f.

g. h. i.

j. k.

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8. PRUEBA DE HEMOAGLUTINACIN PARA INFLUENZA AVIAR

La prueba de Inhibicin de la Hemoaglutinacin (HA) se hace con antisuero monoespecfico/ subtipo-especfico de referencia. Si la prueba de HA es positiva, entonces el virus aislado es de la familia Paramyxovirus o Orthomyxovirus. Hemoaglutinacin Una protena viral de superficie se une a los receptores que se encuentran en la superficie de los eritrocitos de pollo: Virus de Influenza Aviar (IA)- hemoaglutinina Paramixovirus aviar (APMA)- hemoaglutinina/ neuroaminidasa

La unin causa aglutinacin de los glbulos rojos (hemoaglutinacin). La hemoaglutinacin viral evita la formacin del botn al fondo del pozo de pruebas. Ambos virus: APMV e IA son hemoaglutinantes. Para la prueba de HA de IA se requiere una suspensin de glbulos rojos al 0,5%, virus HA y controles 8.1. Definiciones y Abreviaturas: Hemoaglutinacin (HA) Inhibicin de la Hemoaglutinacin (IH)

8.2. Materiales y Reactivos Placas de microtitulacin con fondo en U 4 muestras a analizar Pipetas con puntas [con filtro y estriles previenen la formacin de aerosoles (ART)]: monocanal y multicanales (calibradas) - 25 a 200 l PBS (0,01M, pH 7,2) Eritrocitos de pollo lavados (0,5%)

8.3. Actividades Marque la placa Adicione 50 l de PBS a cada pocillo Adicione 50 l de lquido alantoideo/ amnitico (LAA) al primer pozo de pruebas solamente Mezcle y diluya (50 l) del primero al ltimo pozo de pruebas Mezcle suavemente la solucin de glbulos rojos para asegurar que la mezcla es homognea Adicione 50 l de suspensin de glbulos rojos al 0,5% a cada pocillo Cubra la placa con una lmina autoadhesiva

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Incube durante 20 a 30 minutos o hasta que se forme el botn del control de clulas. Lea y anote los resultados Nota: no se hace segundo pasaje si los huevos estn vivos, slo se hace un segundo pasaje si mueren y la aglutinacin es negativa. El segundo pasaje se hace en tres huevos SPF, con una dilucin 1:10.

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9.

AISLAMIENTO VIRAL EN HUEVOS EMBRIONADOS PARA EL DIAGNSTICO DE INFLUENZA AVIAR DE ALTA PATOGENICIDAD

El diagnstico y la confirmacin de la Influenza Aviar de alta patogenicidad (IAAP), requiere del aislamiento e identificacin del virus infectante y la determinacin de su patogenicidad. Al trabajar con virus IAAP, que podran tener importancia en la Salud Pblica, el virus del subtipo H5N1 de linaje asitico, se deben seguir procedimientos especiales de seguridad, para prevenir o minimizar la exposicin humana a virus infecciosos al realizar anlisis en los laboratorios. Se deben seguir los protocolos recomendados. 9.1. Aislamiento Viral: a. Las muestras para el aislamiento del virus de IA deben venir en caldo infusin cerebro-corazn como medio de transporte. Las muestras deben ser trulas (hisopos) cloacales y traqueales, en grupos (pools) de cinco por tubo (5 aves diferentes) pequeos trozos (5 mm3) de trquea, intestino, bazo y pulmn en un tubo con caldo infusin cerebro-corazn. Las trulas deben sumergirse en el medio, mezclarse y ser desechadas antes del envo. Para aislar virus a partir de tejidos, se prepara una suspensin al 10% del tejido en medio de transporte adicionado con antibiticos, y se preparan en un gabinete de bioseguridad clase II. Las muestras para aislamiento de virus de IA deben enviarse al laboratorio de referencia en cajas conteniendo geles congelados. Se debe tener especial cuidado en cerrar firmemente los tubos y sellarlos, para prevenir derrames durante el transporte. Los envases enviados se deben abrir de a uno en uno, en una cmara de bioseguridad clase II, por personal calificado. El analista debe verificar que la informacin del protocolo de toma de muestras y resultados de laboratorio corresponda con las muestras ingresadas. El nmero del protocolo de acceso, fecha de llegada, condicin de las muestras, distribucin e iniciales de la persona que los abri se deben anotar en una planilla de admisin adecuada. Una hoja de trabajo se llena con el nmero de acceso, y los datos de origen comos son: el nombre del dueo, direccin, fecha de llegada, los datos de la persona de contacto para notificar el resultado y con la identificacin de cada muestra Cada tubo es marcado el nmero de protocolo correspondiente. Los tubos marcados se deben agitar vigorosamente en un vrtex para mezclar su contenido. Los tubos se deben centrifugar a 2500 rpm durante 30 minutos a 4C. Un frasco estril que contenga que contenga 1,3 ml de una mezcla de medio de transporte adicionado con antibiticos, debe ser utilizado por muestra y debe ser marcado con la identificacin. Aproximadamente 2.0 ml del sobrenadante del medio se debe transferir con una pipeta al frasco con los antibiticos. La mezcla de los antibiticos con la muestra se debe incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora antes de ser inoculada en los huevos embrionados de pollo. La concentracin final por ml de antibiticos debe ser: 10000 UI de penicilina G; 2000 g de sulfato de estreptomicina;

b.

c.

d.

e.

f. g.

40

1000 g de sulfato de gentamicina; 650 g de sulfato de kanamicina; y 20 g de anfoterisina B. h. Se utilizan 4 huevos embrionados libres de patgenos especficos (SPF) de 9 a 11 das de edad los cuales se deben colocar en una fila sobre una bandeja de huevos. La bandeja se debe marcar con el nmero del protocolo de acceso y con la fecha de inoculacin. Cada huevo debe ser identificado con el nmero del protocolo de acceso, el nmero de muestras y con la fecha de inoculacin. Los huevos deben quedar en los mismos espacios de la bandeja durante todo el perodo de incubacin. Los huevos se ovoscopian y se desinfectan, se les hace un orificio con un taladro elctrico en la cmara de aire en el lugar opuesto a la ubicacin del embrin. Cada huevo se inocula con 0,3 ml de la mezcla de la muestra con antibiticos va saco alantodeo, usando una jeringa con aguja estril. El orificio se sella con pegamento. El resto de la mezcla de muestra con antibiticos se debe congelar a 70C hasta que el resultado del aislamiento viral este completo. Los embriones inoculados se incuban a 35-37C durante 4 das. La viabilidad de los embriones se debe revisar diariamente con un ovoscopio porttil y liviano, para evitar la manipulacin excesiva de los huevos. Los huevos con embriones muertos se deben remover y la fecha de muerte se debe ingresar al computador y anotarse en la hoja de trabajo. Los embriones que mueran dentro de las primeras 24 horas post inoculacin deben ser descartados. La muerte ser atribuida a dao durante la inoculacin o a otras causas no especficas.

i.

j.

k. l.

m. El fluido amnitico/ alantodeo (LAA) se debe cosechar de los embriones muertos desde el 2 al 4 da post inoculacin y de todos los huevos sobrevivientes. Los huevos sobrevivientes deben ser enfriados a 4C la noche anterior a la cosecha de LAA. El LAA se poner en un tubo de plstico con tapa y estril de 12 x 75 mm, se identifica con el nmero del protocolo de acceso, fecha de muerte y nmero de pasaje. Todas las actividades relacionadas con la extraccin del LAA de los embriones se deben realizar en una cmara de bioseguridad clase II y slo se pueden abrir al mismo tiempo los huevos inoculados con la misma muestra. n. Una porcin del LAA se debe sembrar en una placa con agar sangre para detectar contaminantes bacterianos y luego este fluido debe ser centrifugado para aclararlo a 2500 rpm durante 10 minutos. Si se detecta la presencia de bacterias, el resto de la mezcla de muestra con antibiticos se debe reprocesar como se describi anteriormente. El LAA se debe diluir en una placa de microtitulacin para hacer la prueba de hemoaglutinacin. Las muestras que hemoaglutinen se someten a la prueba de Inhibicin de la hemoaglutinacin (IH) para Newcastle (NC) con antisuero anti NC. Las muestras que no sean inhibidas con el antisuero anti NC deben probarse con la prueba de IH y la de Inhibicin de la Neuroaminidasa (IN) para influenza aviar, para determinar el subtipo de virus de IA. Los resultados de los aislamientos del virus de la IA deben ser reportados a los servicios de emergencia como est estipulado. Las muestras que hayan matado embriones, pero que resultaron negativos a la aglutinacin de eritrocitos de pollo, se deben diluir en un caldo adicionado de antibiticos en la relacin 1:10 y ser nuevamente inoculados en tres

o.

p. q.

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huevos adicionales con la misma tcnica que se describi anteriormente. Si no se detecta actividad hemoaglutinante en el LAA de los embriones, ya sea muertos o sobrevivientes, en el segundo pasaje, el aislamiento ser considerado negativo a virus de IA. Los informes negativos se deben imprimir y deben ser reportados a los veterinarios del rea correspondiente. r. Para evaluar la patogenicidad de los virus de IA aislados, se deben usar 8 pollos susceptibles (SPF libres de anticueros contra Influenza Aviar) de 4 a 6 semanas de edad. Estos deben ser inoculados va endovenosa con 0,2 ml de una dilucin 1:10 de LAA libre de bacterias. Los pollos deben observarse diariamente, durante un periodo de 10 das, en busca de signos clnicos o muerte. Los pollos se deben mantener en jaulas de aislamiento, bajo presin negativa, y las puertas de la jaula no se deben abrir a menos que uno o ms de los pollos mueran. Los pollos muertos o moribundos deben ser llevados a necropsia en busca de lesiones compatibles con las de la IA. Los tejidos deben ser guardados para reinoculacin si se autoriza. El aislamiento ser calificado como altamente patgeno si 6, 7 u 8 pollos mueren con lesiones compatibles a la IA altamente patgena. Si mueren de 1 a 5 pollos y/o el virus pertenece a los subtipos de hemoaglutinina H5 o H7, entonces las muestras deben ser secuenciados para determinar si en el sitio de rompimiento de la hemaglutinina (H) se hallan presentes mltiples aminocidos bsicos. Si la secuencia de aminocidos es compatible con cepas de alta patogenicidad, se considerar que se trata de virus de influenza aviar de declaracin obligatoria de alta patogenicidad. El primer aislamiento de virus de IA de alta patogenicidad se debe confirmar con una reinoculacin del virus, a parir de la muestra original.

s.

9.2. Serologa a. La deteccin de anticuerpos anti IA en suero, plasma o yema de huevo de lotes sospechosos indica exposicin al virus o a vacuna. Hoy existen 2 pruebas serolgicos utilizadas para el monitoreo de sueros que permiten identificar la presencia de anticuerpos para todos los subtipos de virus Influenza Aviar: la prueba de Inmunodifusin en Gel Agar (IDGA) y la prueba de ELISA. Los sueros que den positivo a estas pruebas deben someterse a una confirmacin y a la determinacin del subtipo. La identificacin del subtipo se hace mediante las prueba de IH e IN.

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10. PRUEBA DE INOCULACIN ENDOVENOSA EN POLLOS PARA LA DETERMINACIN DE PATOGENICIDAD DE CEPAS DE INFLUENZA AVIAR

10.1. Definiciones y Abreviaturas: Infecciones con IA en aves de corral domsticas se ha asociado a una variedad de enfermedades, desde subclnicas, hasta agudas o generalizadas causando una enfermedad fatal. Debido a la variacin en la patogenicidad es necesario evaluar sta con un virus recientemente aislado en pollos libres de patgenos especficos (SPF; por sus siglas en ingls) para identificar a los que requieren una accin regulatoria. Existen dos formas para determinar esta patogenicidad, una es calculando el ndice de patogenicidad intravenosa (IPIV) y la otra es determinando la relacin del nmero de pollos que mueren de los 10 inoculados tambin endovenosamente. IA: Influenza Aviar SPF: Specific Pathogen Free o libre de patgenos especficos

10.2. Equipos e instrumentos: 10 pollos SPF de 4 a 8 semanas de edad. Adecuado espacio en una cabina de bioseguridad nivel 3 para facilidad animal Jeringas de 3ml con agujas de 21 g Guantes de ltex desechables estriles Tarjetas por jaula y de identificacin de 3 x 5 Bolsas de plstico medianas y pequeas Tubos estriles con tapa hermtica de 12 x 75 mm, que contengan 1.8 ml de medio de transporte con antibiticos 10T.

10.3. Preparacin de Reactivos Precaucin: Siempre debe usa lentes de proteccin, ropa y guantes cuando maneje tejidos potencialmente infectados o virus vivo. Realice todos los procedimientos con el agente potencialmente vivo en una cabina de bioseguridad aprobada con filtros HEPA. Trabaje slo un caso a la vez. Las muestras para diagnstico incluyen cerebro, tejido respiratorio y gastrointestinal y trulas. Un nivel de bioseguridad apropiado se debe mantener al trabajar con estos virus. Todas las superficies y equipos que tengan contacto con materiales infectantes se deben lavar con detergente y desinfectar con soluciones yodadas, alcohol al 70% o soluciones fenlicas, preparado segn las recomendaciones de cada fabricante. Note que no se pueden usar desinfectantes corrosivos en cabinas de bioseguridad. Todos los instrumentos contaminados, contenedores y fluidos, se deben esterilizar en autoclave antes de reutilizar o desechar. 10.4 Preparacin de las Muestras a. b. Seleccione el o los aislamientos de IA a ser inoculados en las aves Descongele la suspensin que contiene el virus aislado/s y centrifugue a 1,500 x gr (2,500 rpm en una centrfuga Beckman J-6B con un rotor de 4.2 JS o similar) durante 5 minutos.

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c.

Diluya la muestra aislada en TBT 1:10 con 10T de antibiticos Nota: cuando se obtienen muchos aislamientos de un solo envo, se pueden reunir las muestras, lo que permite que por lo menos se determine la patogenicidad de 1 muestra aislada. Utilice 0,2 ml de cada aislamiento al reunir muestras. Nota: la manipulacin de el/los virus aislados se debe hacer en una cabina de bioseguridad clase II.

10.5. Inoculacin de los pollos a. Llene 2 tarjetas de jaula con el nmero de acceso, dueo, fecha de inoculacin, datos de la persona de contacto, iniciales del encargado de la inoculacin, el nmero de das que se tendrn las aves y el subtipo del virus a inocular. Tambin marque en la tarjeta de identificacin el nmero de acceso de cada aislamiento, cuidando de dejar un espacio para anotar el nmero de ave y de jaula para llevarlos de regreso al laboratorio. Enumere las tarjetas de las jaulas secuencialmente, segn el orden de inoculacin. Ponga las tarjetas de las jaulas y la dilucin de 1:10 de la muestra aislada en bolsas de plstico pequeas y cirrela; asegrela con cinta adhesiva. Para cada muestra aislada que est en la bolsa pequea (4.5) ponga en una bolsa mediana: un par de guantes desechables estriles de ltex, una jeringa con su aguja y la/s tarjeta/s de identificacin marcadas de 3 x 5, para su trasporte hacia el lugar de inoculacin (BL-3). Guarde la siguiente informacin en el libro de registros de inoculacin en pollos: Fecha de inoculacin Nombre del dueo de la granja y de la persona de contacto Nmero de acceso Subtipo del virus de IA Nmero de muestras y fecha de cosecha Deje espacio para guardar los nmeros de los pollos y de las jaulas entre ingresos e. Abra la bolsa de plstico preparada en el paso anterior y ubique las bolsas de muestras individuales, guantes, jeringas y las tarjetas de identificacin de 3 x 5 sobre una mesa limpia. Coloque los aislados en el orden de inoculacin. Slo una bolsa de aislado debe abrirse a la vez. Registre el nmero de las aves (en una cinta en la parte exterior de la puerta) en las tarjetas de identificacin de 3 x 5. Abra el paquete que contiene los guantes y utilice la parte interior del paquete como una superficie estril de trabajo. Coloque las tarjetas, jeringas y el tubo con el aislamiento en esta superficie estril. Anote el nmero de las aves en una tarjeta de jaula individual y pngala en la parte frontal de la puerta de la jaula. Pngase los guantes estriles y llene la jeringa con el inculo, con cuidado de no generar aerosoles Abra la puerta de la jaula y ponga la jeringa en un rea limpia del piso de la jaula

b. c.

d.

f. g.

h. i. j.

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k. l.

Inocule las aves va intravenosa con 0,2 ml del inculo Qutese los guantes contaminados y cierre la puerta. Asegure todos los cierres fuertemente para sellar la puerta de la jaula Nota: Es de mucha ayuda asegurar las alas de las aves para evitar que forcejeen y produzcan aerosoles durante el proceso de inoculacin. Esto reducir la exposicin de los operarios y la contaminacin del aire de la sala.

m. Ponga el material contaminado en un recipiente en el rea de preparacin.

10.6. Procedimiento de salida de la Sala Animal a. b. c. Ponga la tarjeta maestra de jaulas en una bolsa plstica y cirrela. sumerja la bolsa en desinfectante y pngala en la sala exterior de la sala animal. Lave y desinfecte todas las superficies potencialmente contaminadas y botas en la sala animal y en el rea de preparacin. Lave las botas con detergente y sumrjalas en desinfectante, pngalas en el ordenador de botas. Qutese la bata y culguela en la perilla de la parte interior de la puerta de la ducha, para que despus la retiren los cuidadores de los animales. Bese y lvese el pelo, despus squese con una toalla, pngase ropa limpia antes de salir. Desinfecte la bolsa que contiene la tarjeta maestra y pngala en la ventanilla o lvela antes de sacarla.

d. e.

10.7. Clculo del ndice de Patogenicidad Endovenoso (IPIV) Anote cada da y por un perodo de 10 das, el estado de los pollos de 6 semanas, dando puntaje 0 a los normales, 1 a los enfermos, 2 a los moribundos y 3 a los muertos, multiplique el nmero de aves por cada uno de estos puntajes y divida por 100 para sacar el IPIV, IPIV mayores o iguales a 1,2 se consideran de alta patogenicidad, IPIV menores a esta cifra, de baja patogenicidad. El otro mtodo es determinar a los 10 das si han muerto sobre un 75% de pollos de 4 a 8 semanas inoculados endovenosamente. Estas pruebas ms la inoculacin de la cepa en cultivos de fibroblastos de pollo, la cual en el caso de cepas de alta patogenicidad debera destruir la monocapa en ausencia de tripsina y la secuenciacin del sitio de rompimiento de la hemoaglutinina, con la presencia de mltiples aminocidos bsicos, son las condiciones para clasificar la cepa como de alta patogenicidad.

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REFERENCIAS

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