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Primer informe de laboratorio de Bioqumica Trabajo prctico N1


Anlisis de hidratos de carbono: caracterizacin y cuantificacin de un azcar desconocido.

Objetivos:
Objetivo general:
Familiarizarse con algunas de las tcnicas mas usadas en el anlisis de los hidratos de carbono.

Objetivos especficos:
Determinar la cantidad de azcar presente en una muestra, mediante el mtodo del fenol-Sulfrico. Determinar la presencia de azucares reductores en dicha muestra utilizando dinitrosalicilato. Realizar una cromatografa en papel, que permita dilucidarla estructura de un azcar desconocido.

P r o c e d i m i e n t o s:
1) Cuantificacin de azucares:
Preparacin de la curva de calibracin:
Se tomaron 7 tubos, a los cuales se les agregaron los siguientes compuestos a los siguientes volmenes:
Compuesto 1 (blanco) Glucosa 0,1 mg/ml (mL) 0.0 Agua destilada (mL) 1.0 Fenol al 5% (mL) 1.0 Acido sulfrico (mL) 5.0 2 0.1 0.9 1.0 5.0 3 0.2 0.8 1.0 5.0 4 0.4 0.6 1.0 5.0 5 0.6 0.4 1.0 5.0 6 0.8 0.2 1.0 5.0 7 1.0 0.0 1.0 5.0

Se procedi a depositar la glucosa en los 7 tubos de ensayo, todos con volmenes diferentes, (especificados en la tabla), adems de un tubo sin glucosa, para ser utilizado como patrn para el Espectrofotometro. Luego de esto, a cada tubo, incluyendo el ultimo, se les agreg agua destilada a los tubos, luego Fenol al 5%, los cuales e agitaron. Luego 5 ml. de cido Sulfrico concentrado. Terminado este proceso, con su debida precaucin, se agitaron bien los tubos y se esper por 30 minutos. Pasado esto, se procedi a medir la Absorbancia en el Espectrofotometro a 490 nm. utilizando el tubo sin

glucosa como blanco para calibrar la maquina. Se pas el contenido de los tubos a los tubos especiales, calibrando cada dos tubos hasta haber terminado con los tubos.

Resultados:
Los resultados obtenidos de la absorbancia fueron:
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 Absorbancia 0 0.135 0.253 0.417 0.658 0.574 0.768

Discusin:
Los resultados obtenidos por el Espectrofotometro dieron como muestra lo indicado en la tabla anterior. El monosacrido reaccion con el cido sulfrico el cual causa la deshidratacin del monosacrido, formando as un furfural, y reaccionando con el Fenol al 5%, se transforma en un compuesto altamente conjugado. Luego, de esta reaccin, se pudo realizar la medicin de Absorbancia a 490 nm. Es notable que el tubo 2 posee menos absorbancia que el tubo 7, debido a que, a medida que la concentracin de glucosa aumenta hasta 1,0 ml aumenta la absorbancia. Con lo cual, existe una mayor superficie de contacto con los haces de luz de el espectrofotometro, y por ende una mayor absorbancia de la luz.

Anlisis de la muestra problema:


A 3 tubos, se les agreg la muestra problema de azcar, que nosotros ya sabamos que era glucosa, pero no sabamos la cantidad de azucar en la solucin.

Compuesto

tubo 1 tubo 2 tubo 3

Muestra problema (ml) Agua destilada (ml)

0.1 0.9

0.2 0.8

0.5 0.5

Luego, se le aplico a cada tubo1 ml. De Fenol al 5%. Se mezclo bien, y luego se les adicionaron 5 ml de Acido Sulfurico concentrado. Se agitaron y se espero durante 30 minutos.

Luego se procedio a medir la absorbancia a 490 nm. Los resultados fueron los siguientes: Muestra Absorban Problema cia
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 0.31 0.464 0.85

Adems, gracias al grafico adjunto, se pudieron calcular las concentraciones de los 3 tubos de muestras problemas, y asi, calcular la concentracin aproximada de la muestra problema: Muestra Concentraci problema n Tubo 1 0.028 Tubo 2 0.051 Tubo 3 0.123 Conc. Prom: 0.067

2) Cromatografia en papel:
Se procedi a tomar un papel especial para este experimento, al cual, en suparte inferior, se le traz una linea horizontal a una altura de 1 cm. aproximadamente. Luego, sobre esta linea, se deposito equitativamente 8 gotas bien gruesas de los siguientes compuestos:

Lactosa, Galactosa Sacarosa, Arabinosa, Ribosa, Manosa, y la Muestra Problema. El papel se coloc dentro de una camara con una solucin de Butanol: Ac. Acetico: Eter Etlico: Agua, en una proporcin de 9:6:3:1. Esta solucin de solentes, debera ir subiendopor la superficie del papel, desplazando los depositos de azucares proporcionalemente segun la afinidad, que tienen con la fase movil. Luego que casi ha llegado arriba la solucin, se sigue a sacar el papel de la camara, y esperar a que seque, para luego rociarlo con una solucin de Anisaldehido (0.5 ml.), Etanol (9 ml.), Acido sulfurico (0.5 ml) y Acido Acetico (0.1 ml), para luego, secarlo en una estufa especial, a aproximadamente a 100C. Luego se procedi a medir el desplazamiento de las manchas, sobre el papel, y sacar el RF de cada azucar. El RF, se calcula, con la razn entre la Distancia del azucar, por la Distancia total que avanz el solvente por el papel.

El resultado total de las migraciones y de los RF, fueron los siguientes: Mig. Migraci Solvent Dif. c/n Azucar n e RF Color MP Lactosa 1.6 7.7 0.21 Gris 0.19 Galacto sa 3.2 7.7 0.42 Plomo 0.02 Sacaros a 2.6 7.7 0.34 Gris 0.06 Arabino sa 3.3 7.7 0.43 Invisible 0.03 Ribosa 3.9 7.7 0.51 Verde 0.11 Glucosa 3.7 7.7 0.48 Gris 0.08 Maltosa 2.4 7.7 0.31 Gris 0.09 Mstra prb. 3.1 7.7 0.4 Gris

Cuestionario
Qu es el poder reductor de un azucar?
Es aquel capaz de reducir su carbono Anomrico, formando enlaces glucosidicos con otras moleculas de azcares.

Explique porque la sacarosa y el almidon no son reductores.


La Sacarosa y el Almidn no son reductores ya que no poseen un carbono anomrico libre, y esto tambin no les permite la oxidacin.

Porque las muestras de distintos azucares migran en forma distinta en una cromatografia en papel?
La migracin de los azucares se debe por la afinidad del azcar reductor con el solvente. Segn las polaridades, si la fase estacionaria (papel) es apolar, y la fase mvil (azcar) tambin es apolar, habr una mayor migracin que si la fase mvil fuese polar.

Dibuje la estructura de un compuesto formado por dos glucosas con un enlace 14 y otro que contenga un enlace 16.

Escriba la ecuaccion de la produccion de acidos aldonicos y aldaricos de la glucosa.

Nombre y explique (mediante ecuaciones) otros metodos para determinar la presencia de azucares reductores.

Qu funcin cumple el blanco en la medicin de absorbancia? Qu contiene este blanco?


Para el espectrofotometro, el blanco es el tubo con en el que se calibra. Este tubo, contiene no contiene glucosa, contiene Fenol 5% 1 mL, 1 mL de agua destilada y 5 mL de de cido Sulfrico concentrado.

Cmo se obtiene la concentracin de la muestra de azcar en este trabajo practico?


Por el mtodo de Fenol Sulfrico al pasar los tubos de la difusin por el espectrofotometro a una absorbancia de 490 nm, el nos entrega la concentracin del azcar.

Conclusin:

Despus de terminado el trabajo, la realizacin de este informe nos aclaro en su desarrollo, muchas facetas de lo que son los Hidratos de Carbono, sus solventes y las

reacciones que estos tiene frente a distintos solventes, respecto a sus distintas concentraciones y cantidades moleculares. Aprendimos a usar el Espectrofotometro, un aparato nuevo para nosotros y de gran utilidad, ya que descubrimos su uso, y su utilidad para el trabajo practico. Y en este aparato, tan practico para nosotros, sacamos como ultima conclusion, lo siguiente. A > cantidad de moleculas > concentracion y absorvancia. Tambien podemos decir, que la cromatografia en papel no es tan efectiva, como la silica gel, ya que degradacion de colores en el papel no es tan buena. La cromatografia en papel nos sirve para determinar con que tipo de azucar estamos trabajando ya que esta va a determinar, si el azucar es un monosacarido o polisacaridos.

Bibliografa: -Tratado de Bioqumica de Lehninger. -Guia de laboratorio de Bioqumica.

Segundo informe de laboratorio

Trabajo Practico n2

Lipidos

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Objetivos :
Objetivo general: Estudiar y conocer las caractieristicas generales de los lipidos. Objetivos especificos: Extraer lipidos de pescado por un metodo rpido y no oxidativo. Determinar la humedad de una muestra de pescado. Determinar el grado de insaturaciones de los lipidos de distintas muestras.

Porque es importantes estudiarlo? :


Ya que son los componentes de las estructuras de las membranas celulares biologicas, y su cualidad Anfipatica los hace aun mas interesantes en nuestro estudio de Bioquimica.

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Procedimiento
Determinacin de la humedad del pescado
Antes de comenzar a realizar el experimento pesamos una placa de Petri lo que nos dio 50.372 gr. la placa de Petri mas el pescado nos da un peso de 56.707 gr. (peso pescado 6.335 gr). Luego comenzamos calentado la placa con el pescado en una estufa durante 2 hrs. A una temperatura de 110C, hasta que se produzca una sequedad total en ala muestra de pescado (deshidratacin total de este). Dejamos enfriar la placa con la muestra y lo volvemos a pesar, el peso tuvo una variacin de 56.707gr. a 52.265gr. RESULTADOS: peso del pescado hmedo

1 El

56.707gr - 50.372gr = 6.335gr. 2 El peso del pescado seco 52.265gr - 50.372gr = 1.893gr. 3 peso de agua 56.707gr 52.265gr = 4.242gr. % humedad del pescado = H2Ogr * 100 / pescado hmedo. % humedad de pescado = 4.242gr * 100 / 6.335gr = 66.961%.

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DISCUSION: Luego de realizar este practico podemos decir que resulto todo un xito, ya que, pudimos calcular la humedad que contiene el pescado. El objetivo de este practico era este, el de calcular la humedad. Nosotros esperbamos que cuando calentramos el pescado ocurriera una perdida de agua de este (deshidratacin) y es lo que ocurri, de un peso de 6.335gr bajo a un 1.893 gr de pescado esto significa que perdio 4.442 gr de agua, por lo tanto, cumplimos el objetivo de calcular la humedad de pescado que fue de un 66.961%.

DETERMINACION DE LOS LIPIDOS DEL PESCADO

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Este paso prctico tiene mucha relacin con el anterior para determinar los porcentajes de lpidos en base hmeda y base seca. Homogeneizamos una muestra de 20.009gr. de pescado en un baso de precipitado de 100 ml., lo traspasamos a un baso de 250 ml. y agregamos 20 ml. de cloroformo y 40 de metanol. Homogeneizamos por 5 minutos con una bagueta. Luego agregamos 20 ml. mas de cloroformo y volvimos a homogeneizar por 1 minuto. Finalmente agregamos 20 ml. de cloroformo y homogeneizamos por 2 minutos ms. Agregamos agua destilada y agitamos por 20 minutos. Filtramos la mezcla usando un embudo Bchner con un matraz kitazato y ayuda de vaco. Transferimos a un embudo de decantacin y esperamos que se separen las fases. El resultado fue 3 fases una cloroformica, una de metanol y una de agua. La fase cloroformica, es la que contiene los lpidos extrados, pasamos esta fase a una probeta de 100 ml y el volumen obtenido es de 21 ml. Tomamos una alcuota de 10 ml de la fase orgnica y la transferimos a una placa de petri que el peso total de la fase con la placa es de 47.962gr. Calentamos la placa en la estufa a 50 C, hasta eliminar el solvente, el residuo obtenido es el material lipdico extrado desde el pescado, el peso final (material lipdico) es de 47.679gr.

RESULTADOS:

Lpidos gr = 47.962gr 47.679gr = 0.283gr.

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Pescado hmedo = 6.335gr Pescado seco = 1.893gr. %lpidos en base de humedad = gr lpidos * 100 / gr pescado hmedo. %lpidos en base seca = gr lpido * 100 / gr pescado seco. %lpidos en base hmeda = 0.283gr. * 100 / 6.335gr. = 4.467%. %lpidos en base seca = 0.283 * 100 / 1.983 = 14.949% DISCUSION: Al igual que en el paso anterior se cumplieron los objetivos, se pudo determinar la extraccin de los lpidos de pescado por un mtodo rpido y no oxidativo, se pudo determinar l % de lpidos en una base hmeda y una seca. La obtencin de los resultados de este paso lo logramos gracias a un buen manejo de los procedimientos y materiales. Los resultados del % de lpidos en base hmeda, quieren decir, que de la extraccin de lpidos tenemos un 4.467% de lpidos pertenece a sta base. Los resultados del % de lpidos en base seca, nos da a conocer, que el 14.949% de lpidos pertenece a sta base.

Determinacion del indice de yodo:


Aceite de pescado: luego de obtener la fase cloroformica por la actividad anterior, se extrae de esta misma una alicuota de 10 ml para luego transferirlo a un matraz erlenmeyer con tapa.

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Mantequilla: se pesaron 0,1523 gr de mantequilla en un matraz erlenmeyer luego de esto se agregaron 10 ml de cloroformo para luego agitar hasta completar la disolucion de la mantequilla. A estas dos muestras de lipidos se agregaron 10 ml de reactivo de hanus para luego tapar los matraces, luego de agregar el reactivo se dejaron estos reposar en la oscuridad por 60 minutos. Mientras se realiza este proceso, es decir, desde la adicion del reactivo de hanus hasta dejar en la oscuridad los matraces se introducen 10 ml de reactivo de hanus dentro de un matraz blanco para tambien dejarlo en la oscuridad durante el mismo periodo de tiempo.

Luego de los 60 minutos a los tres matraces se agregaron 20 ml de agua destilada y 4 ml de yoduro de potasio al 15%, esto ultimo se hace para favorecer la formacion de yodo en la solucion.

Aspecto de los matraces: Aceite de pescado: solucion heterogenea en la cual la primera fase es rosacea y la segunda fase es de color rojo ladrillo. Mantequilla: solucin heterognea en loa cual la primera fase es anaranjada oscura y la segunda es rojo ladrillo. Blanco: solucin heterognea en la cual la primera fase es rojo ladrillo y la segunda es rojo oscura.

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Luego de determinar los aspectos de los matraces se procede a titular con tiosulfato lentamente.

PROCEDIMIENTO: En un soporte universal con pinzas se coloca una bureta hasta el tope de su capacidad con tiosulfato, debajo de la bureta se coloca cada uno de los matraces (uno a la vez), para comenzar la titulacin, cuando la solucin de los matraces se torne amarilla, se agregan 4 gotas de almidn y se continua la titulacin hasta el cambio de color. RESULTADOS DE LA TITULACIN: Luego del cambio de color, se mide el volumen utilizado en la titulacin Mantequilla: 41 ml Aceite de pescado: 11.20 ml. Blanco: 51 ml. Aspecto del matraces: contenido del contenido de los

Aceite de pescado: solucin heterognea, primera fase amarilla, segunda fase fucsia. Mantequilla: solucin heterognea, primera fase blanco, segunda fase amarilla. Blanco: solucin heterognea, primera fase amarilla, segunda fase roja. Determinacion del indice de yodo:

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Cr2+12 O

-12 7

2Cr6+

6+

3+

Cr2O7

2Cr3+ + 6e

Determinacion de PE: 294,2/6 = 49,03 Determinacion de neqg: O,24/49.03 = 4.89*10-3 Determinacion de N tiosulfato: 4.89*10-3/40.2 = 12.21*10-4 ACEITE DE PESCADO: Ind de I = (51 ml - 11,20 ml) * 12,21*104*12,69/0,17 = 3,6275 100 = 0.17 = 21.33 gr.de X 3.6275 Yodo en 100 Gr. De aceite MANTEQUILLA: Ind de I = 51 ml - 41 ml) * 12,21*104*12,69/0,17 = 0,9114 100= 3.17 = 28.75 gr.de X 0.9114 Yodo en 100 gr. de grasa. Mientras ms ndice de I, ms grado de insaturacin presenta el lpido en cuestin, por lo tanto el aceite de pescado es el que

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posee mayor grado de insaturaciones en su estructura, ya que el indice de I de aceite de pescado es: 21,33 gr. De Yodo en 100 gr. de Aceite, y el de la mantequilla es de 28.75 gr. De Yodo en 100 gr de grasa.

Cuestionario
1.a) Qu es una grasa y un aceite?
Las Grasas y aceites son un grupo de compuestos orgnicos existentes en la naturaleza que consisten en steres formados por tres molculas de cidos grasos y una molcula del alcohol glicerina. Son sustancias aceitosas, grasientas o cerosas, que en estado puro son normalmente incoloras, inodoras e inspidas. Las grasas y aceites son ms ligeros que el agua e insolubles en ella; son poco solubles en alcohol y se disuelven fcilmente en ter y otros disolventes orgnicos. Las grasas son blandas y untuosas a temperaturas ordinarias, mientras que los aceites fijos (para distinguirlos de los aceites esenciales y el petrleo) son lquidos.

b) Que es un Jabn?
El Jabn, es la sal de sodio o potasio de un cido graso que se forma por la reaccin de grasas y aceites con lcali. Sus ingredientes son compuestos de glicerina y un cido graso, como el cido palmtico o el esterico. Cuando estos compuestos se tratan con una solucin acuosa de un lcali, como el hidrxido de sodio, en un proceso denominado saponificacin, se descomponen formando la

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glicerina y la sal de sodio de los cidos grasos.

c) Que es el colesterol?
El Colesterol es un alcohol complejo que forma parte de todas las grasas y aceites animales. Se puede activar para formar la vitamina D. El colesterol pertenece a un grupo de compuestos conocidos como esteroides, y est relacionado con las hormonas sexuales producidas en las gnadas y las hormonas de la corteza suprarrenal.

2.- Qu caracteristicas poseen lipidos provenientes del pescado?

los

Las clulas vivas contienen grasas simples, como las descritas anteriormente, y otros materiales similares a las grasas. Entre estos ltimos, que son sustancias ms complejas, se encuentran los lpidos y los esteroles.

3.- Que diferencias existen entre los fosfolipidos y los trigliceridos?


Los trigliceridos son por ejemplo las grasas y aceites nombrados anteriormente( steres formados por tres molculas de cidos grasos y una molcula del alcohol glicerina), en cambio los fosfolipidos son derivados de cidos grasos, glicerina, cido fosfrico y bases que contienen nitrgeno.

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4.- Qu son las ceras?


Las Ceras son los steres naturales de cidos grasos y alcoholes monohidroxlicos, pero que actualmente se aplica a los productos naturales y fabricados semejantes a esos steres. Las ceras tienen un brillo opaco y una textura jabonosa o grasienta. Se ablandan gradualmente con el calor, pasando por un estado blando y maleable hasta llegar al estado lquido. Los aceites y las grasas parecen steres cerosos, pero difieren de estos en que estn formados por glicerina, un alcohol trihidroxlico (o triol).

5.- Cul es el significado del indice de Yodo en el analisis de un aceite?


El significado del indice grado de insaturacin del como, el peso en gr de I2 adicin de doble enlaces) de yodo muestra el aceite, que se define que reacciona (por con 100gr de lpidos.

6.- Por qu se debe agregar almidon como indicador en la titulacion con tiosulfato de sodio?
Se debe agregar almidn como indicador en la titulacin con tiosulfato de sodio porque, el almidon es un polisacarido que reacciona con el tiosulfato de sodio por la presencia de OH, cuando este reacciona se pone de un color negro, y cuando ya no existe la precencia de tiosulfato de sodio este no reacciona y deja de mostrar el color negro.

7.- Por qu para la extraccion lipidos se utiliza Cloroformo?


El cloroformo necesita menor cantidad de caloras por gramo para su evaporacin, en

de

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comparacin con el agua, que necesita 540 cal/g, mientras que el cloroformo necesita solo 59 cal/gramo a 1 atm, por lo tanto, para la extraccin de lpidos mediante el uso de cloroformo es menor la cantidad de caloras que se debe aplicar a la grasa para su extraccin.

8.- Qu efecto tiene una base (por ejemplo: NaOH) sobre un triglicerido?
Tratando las grasa con bases o lcalis se logra su hidrlisis, esto es, la separacin de sus componentes, cidos grasos y glicerol, por introduccin de una molcula de agua en cada enlace, en este caso, el procedimiento se llama saponificacin, con lo que se forman jabones, que son las sales alcalinas de los acidos grasos. Los jabones de sodio y potasio son solubles en agua, pero pierden su solubilidad en presencia de un exceso de iones alcalinos. La presencia de de sales de calcio o de magnesio hace que se formen jabones alcalino insolubles.

Conclusin
Concluido el trabajo, hemos encontrado formas de determinacion del grado de instauracion de diversas materias grasas. Por ejemplo, el metodo de Hanus, o a traves del indice de Yodo. Hemos observado las formas en que se pueden almacenar los lipidos y grasa en el

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organismo, mas bien, en experimento, en el pescado.

este

tipo

de

Hemos trabajado con un metodo suave y rapido para evitar la descomposicion oxidativa de los acidos grasos principalmente los insaturados, esto con los metodos anteriormente nombrados. Tambien las cantidad de grasas, almacenadas en otras muestras de lipidos, como mantecas o aceites.

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Informe de Bioquimica laboratorio n 3 " Proteinas"

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Objetivos:
-Estudiar y conocer las caracteristicas generales de las proteinas.

Objetivos especificos:
- Realizar una curva de calibracin utilizando una medida estandar. - Purificar caseina a partir de leche, por su punto isoelectrico. - Estudiar las caracteristicas acido-base de las proteinas.

SEPARACION DE LA CASEINA

Tomamos 20 ml. de la leche descremada y la diluimos en 100ml de agua destilada, le agregamos lentamente 0.5ml de HCl al 2%, hasta lograr un PH de 4.26 (comprobamos con un PHmetro), donde observamos la precipitacin de la casena. Esto se produce cuando hay una alteracin de la estructura de la protena (qumicas y fsicas) que las hace que pierdan sus

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propiedades funcionales, fsicas y qumicas que las caracterizan. Agitamos durante 5 min. Luego dejamos reposar por 15 min. Luego de los 15 min. observamos un precipitado.
Centrifugamos la dilucin durante 10 min. , Se observa un sobrenadante (se elimina) y el residuo restante lo lavamos con agua destilada 2 veces. Lavamos finalmente dos veces con etanol y luego con agua destilada hasta que desaparezca el olor a etanol. Al residuo totalmente limpio, se le agrego 0.5ml de NaOH 0.01 N y luego agregamos 0,01 ml de NaOH 0.1 N intentando de disolver la mayor parte del residuo, la solucin que nos da es diluida en: 1 ml de solucin mas 9 ml de agua destilada. La solucin que nos da con la disolucin anterior es nuevamente diluida, tomando: Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Solucin 0.1mg/ml 0.5mg/ml 1.0mg/ml Agua 0.9ml 0.5ml 0.0ml Biuret 4ml 4ml 4ml

Al agregar el reactivo Biuret los tubos toma un color prpura, es aparentemente causado por el complejo de coordinacin formado el tomo de Cu y cuatro tomos de N del enlace peptdico. Mezclamos suavemente por agitacin. Calentamos a 50 C por 10 min. en un bao termorregulado, enfriamos por 5 min. y luego liemos los resultados al espectrofotmetro (spectronis 20) a 540 nm empleando como blanco el mismo tubo que se utilizo para la determinacin de protenas por el mtodo Biuret.

Los resultados de la absorbancia fueron:

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Tubo absorbancia (nm) 0.014 0.086 0.289


Concentracin mg/ml 0,1 0,5 1,0 Absorvancia 0,014 0,086 0,289

Curva de calibracin de la casena


absorvancia nm 0,4 0,2 0 0 0,5 1 1,5 conce ntracin (m g/m l) Serie1

DISCUSION

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Luego de terminar esta experiencia podramos concluir y discutir que la casena es una protena capas de reaccionar con el sulfato de cobre alcalino, ya que cuando agregamos el reactivo Biuret reacciono formando un color prpura. Que se formo aparentemente por el complejo de coordinacin formado entre el tomo de Cu y cuatro tomos de N, dos de cada enlace peptdico. El resultado de la curva de calibracin de la casena puede determinar que a mayor concentracin de casena la absorvancia es mayor. La curva de calibracin debera observarce un pto. de saturacin en una absorvancia de El mtodo Biuret tiene varias ventajas incluyendo velocidad, similar color con distintas protenas, y existen pocas sustancias interferentes. Aunque no es demasiada, una desventaja es la sensibilidad.

Determinacin de Proteina por metodo de Biuret


Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 Ml. De sol. Estndar 0 0,5 1 1,5 2 3 4 5 Ml. De Agua 5 4,5 4 3,5 3 2 1 0

Luego de preparar segn la tabla los 8 tubos ensayo con la solucion estandar de Albumina y agua, a cada tubo se le agrego 4 ml. De reactivo de Biuret; cuidadosamente se agito y luego calento a 50 C por 10 minutos en un bao termoregulado, luego de esto se espero a que enfrien los tubos y se procedio a medir la absorbancia, la cual arrojo los siguientes resultados, dejando el tubo n 1 como blanco.
Tubo 1 2 3 4 5 Concentracion albumina Absorbancia 0 tubo blanco 0,5 0,012 1 0,019 1,5 0,038 2 0,045

28 6 7 8 3 4 5 0,03 0,046 0,078

Curva de calibracion
6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 Serie2 Serie1

Caracteristicas acido-base de las proteinas De una muestra de proteina disuelta en NaOH de 0.1 M, esta proteina es caseina, de esta solucion se extraen 10 ml. De la caseina disuelta en NaOH, luego de esto se mide el PH inicial de la muestra, despues se procede a titular la caseina agregando determinados volumenes de HCl 0.1 M, cada vez que se agrega HCl, se mide el PH hasta alcanzar 1.83.
Ml de HCl 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Ph 7,45 6,01 4,52 3,52 3,15 2,48 2,71 2,65 2,53 2,49 2,44 2,36 2,3 2,24 2,2 2,17 2,13 2,11 2,09 2,07

29 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2,05 2,03 2,02 2,01 2 1,99 1,99 1,98 1,96 1,95 1,95 1,94 1,93 1,92 1,92 1,91 1,91 1,91 1,9 1,9 1,89 1,89 1,88 1,88 1,88 1,87 1,87 1,87 1,86 1,86 1,86 1,85 1,85 1,84 1,84 1,84 1,83

Curva de calibracion
3 Ph 2 1 0 15 43 ML de HCl 50 1 8 36 22 29 8 6 4 2 0 Ml de HCl Ph

Cuestionario

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1.- Que es el enlace peptidico? El enlace peptidico es el puente de unin entre aminoacidos para as, poder formar estructuras proteinicas, como por ejemplo la estructura primaria de una protena, la cual es su secuencia de aminocidos, formada cuando un enlace peptdico une el grupo carboxilo un tomo de carbono (C), dos tomos de oxgeno (O), y un tomo de hidrgeno (H) de un aminocido al grupo amino un tomo de nitrgeno (N) y dos tomos de hidrgeno (H) de otro. As se forma una cadena larga de varios aminocidos, desprendindose una molcula de agua en la formacin de cada enlace peptdico.

2.- Cmo afecta el acido clorhidrico (Hcl) a la proteina ? El acido Clorhidrico, por su capacidad acida, desnaturaliza a la proteina, osea, rompe sus enlaces pepetidicos, y cambiando las propiedad estructurales y fisiologicas de la proteina. 3.- Cmo podria obtener lactoalbumina en una muestra de leche? Si a la muestra de leche le aplicamos un acido fuerte, lograremos que la lactoalbumina decante, en un precipitado, distinto al de la caseina. Cabe sealar, que los puntos isoelectricos entre la caseina y la lactoalbumina son diferentes, ya que tienen un precipitado distinto entre ellos. Todo esto es seal, de que la lactoalbumina y la caseina decantan a un distinto PH.

4.- Se podra utilizar otra protena para construir la curva de calibracin con el mtodo de Biuret y el mtodo de Bradford?.

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Si se podra, ya que, si un compuesto o protena tiene dos o ms enlaces peptdicos pueden reaccionar con sulfato de cobre alcalino en el mtodo de Biuret. En el mtodo de Bradford la unin de Azul brillante de coomasie a una solucin cida de protena. En este practico utilizamos como protena la casena. 5.-En qu consiste una curva de calibracin de protena y para que sirve?. Mtodo de anlisis basado en las relaciones lineales entre la propiedad medida y la variable a determinar. Este mtodo permite determinarla concentracin (de protena)que se desconoce, a partir de la absorvancia y que se encuentra dentro del limite de la recta. 6.- A que corresponden la estructura primaria, secundaria y terciaria de una protena?. La estructura primaria de la proteina es la formada por aminoacidos enlazados por enlaces peptidicos; la estructura secundaria son los enlaces entre estructuras ya formadas de aminoacidos, y una estructura terciaria son las estructuras globulares de preteinas, o fibrilares, con caracteristicas fisiologicas propias de cada estrucura terciaria. 7.- Qu es la capacidad Tamponante? Cuando existe variacion de PH en un sistema determinado por agregacion de H o OH, el par conjugado acido-base actua como tampon, que posee una capacidad tamponante especifica, es decir, la capacidad tamponante es un sistema que tiende a impedir el cambio de PH cuando se aaden iones H o OH. 8.- Por qu las proteinas presentan esta capacidad tamponante? El comportamiento tamponante de los peptidos esta determinados por los grupos alfa amino libres de los restos NH2 terminales, por los alfa-carbonilos, libres de los restos de COOH terminales y por los grupos R que son capaces de ionisarse. Puesto que los grupos alfa amino libres y alfa carbonilo libres estan muy separados entre si, sus interacciones electroestaticas entre ellos estan disminuidas, lo que lo hace estable en forma de tampon, ademas que ninguno de los grupos alfa amino o alfa carbonilo estan combinados en forma de enlace peptidicos, por lo tanto pueden ionisarse en la zona de PH entre 0 y 14, y esto determina la capacidad tamponante.

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9.- Qu otras caracteristicas de las proteinas se pueden utilizar para purificarlas? Otras caracteristicas, por las cuales las proteinas pueden purificarse, es a traves de la electroforesis el cual utiliza la ionizacion del grupo funcional R de la proteina. Este grupo funcional, junto con los grupos alfa amino, y alfa carbonilo, al ser ionizado, puden ser reconocidos, por electroforesis, por lo tanto, luego de esto, las proteinas pueden ser identificadas en su condicion de tamponante, y por lo tanto, pueden ser purificadas, conociendo estas caracteristicas.

Bibliografia:
Lenhinger, capitulo proteinas, edicion 1996 Mathews, capitulo proteinas edicion1994 Enciclopedia encarta 1997 microsoft. Guia laboratorio Bioquimica, laboratorio de proteinas.

Objetivos. Estudiar el efecto de varios factores sobre la actividad de la fosfatasa cida.

Objetivos especficos. Medir actividad enzimatica de la fosfatasa cida. Determinar el pH optimo de la fosfatasa cida. Determinar la temperatura optima de trabajo de la fosfatasa cida. Estudiar el efecto del sustrato sobre la actividad enzimatica de la fosfatasa cida.

Materiales. Aorta de bovino. Buffer citrato 0.10M de pH 3.0; 4.0: 4.8; 5.2; 5.7; 6.2; 7.0; 8.0. p-nitrofenilfosfato disodio 0.025M pH (4.8). p-nitofenilfosfato disodio 25 mM pH (4.8). p-nitrofenol 60uM, en NaOH 0.02M. NaOH 0.02M.

33 NaOH 0.1M. MgCl2 25mM.

Procedimiento. Preparacin de extracto de crudo de la enzima. Esta preparacin la realizaron los profesores de laboratorio y el crudo se dejo en un vaso precipitado rodeado de hielo para mantener al crudo a baja temperatura. Curva de calibracin con p-nitrofenol. Se prepara una serie de 6 tubos segn la presente tabla. Compuesto 1 p-nitrofenol 60 uM 0 NaOH 0,02 M 6 2 1 5 3 2 4 4 3 3 5 4 2 6 5 1

Se mezclan bien los tubos y luego se transfieren a tubos de espectrofotmetro y se lee a 405 nm usando el tubo N1 como blanco, para poder ajustar el espectrofotometro. Efecto del pH en la reaccin enzimatica. Para determinar el efecto del pH en la actividad de realizan reacciones en buffer de citrato de valores de pH distintos segn como indica la siguiente tabla. Compuesto B C 1 2 3 4 5 6 7 8 p-nitofenilfosfato (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 MgCl2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 buffer citrato (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 agua (ml) 4,5 4,5 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 extracto crudo (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 pH del buffer citrato 3,0 4,0 4,8 5,2 5,7 6,2 7,0 8,0 B: Blanco (no contiene sustrato). C: Control (no contiene enzima y mide la hidrlisis qumica del sustrato). MgCl2: La enzima es dependiente del magnesio para su actividad. Nota: el extracto de crudo debe agregarse en ultimo lugar, cada tubo se debe dejar encubar por 30 min. Y a 37C. Luego de esto se realiza. Transferir inmediatamente una alcuota de 1 ml del medio de incubacin a un tubo que contenga 5 ml de NaOH 0.1M. A pH bsico el producto tiene un mximo de absorcin a 405nm y utilizando el tubo blanco para poder calibrar el espectrofotmetro. Tambin se utiliza el NaOH para poder detener la reaccin ezimatica debido que queremos ver cuanto producto se forma en un tiempo determinado. Efecto de la temperatura en la reaccin enzimtica. Se estudiara la reaccin a las temperaturas de : 0C, 20C, 37C, 60C, 100C. Se debern para esto los siguientes tubos, los cuales debern ser repetidos 5 veces cada uno a excepcin del tubo B (blanco). Compuesto p-nitofenilfosfato (ml) MgCl2 buffer citrato pH 5,6 agua (ml) extracto crudo (ml) B 0,5 2,5 2,0 1,0 C 1,0 0,5 2,5 2,0 T 1,0 0,5 2,5 2,0 1,0

B: Blanco (no contiene sustrato) C: Control (no contiene enzima y mide la hidrlisis qumica del sustrato). El pH debe ser constante.

34 Cada tubo debe ser encubado durante 30 min y a sus respectivas temperaturas. Antes se debe tener listo los tubos que contienen NaOH como en la experiencia anterior. Efecto de la concentracin de sustrato en la reaccin enzimtica. Se debe seguir la siguiente tabla. Compuesto B 1 2 3 4 p-nitofenilfosfato (ml) 0,5 1,0 1,5 2,0 MgCl2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 buffer citrato pH 5,6 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 agua (ml) 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 extracto crudo (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 B: Blanco (no contiene sustrato). La concentracin de la enzima al igual que el pH deben ser constantes. En esta experiencia tambin se deben frenar las reacciones con NaOH como en las experiencias anteriores.

Cuestionario. Qu significa que una enzima posea temperatura y un pH optimo? La temperatura optima quiere decir que cada enzima necesita una determinada temperatura para que esta funcione a su mxima capacidad en una racin, si la temperatura es mas baja la enzima pierde capacidad de acelerar la racin y si esta es mas alta la enzima al ser una protena esta se desnaturaliza y no realiza la reaccin. Las enzimas tienen un pH optimo o un intervalo de pH en que su actividad es mxima. A valores superiores o inferiores de pH la actividad disminuye dado que algunas cadenas laterales de amino cidos pueden actuar como cidos o bases dbiles que desarrollan funciones critica en el sitio activo del enzima. El cambio en el estado de ionizacin es un estado frecuente en el cambio de actividad. Qu significado tiene Km Vmax? Cmo se determina experimentalmente? Km es la concentracin de sustrato a la que la velocidad inicial es la mitad de la velocidad mxima. Vmax es la variacin del sustrato sobre la velocidad inicial cuando se mantiene constante la concentracin de enzima. A concentracin de sustrato relativamente bajas la velocidad inicial aumenta casi linealmente al incremento del sustrato. A mayores concentraciones de sustrato la velocidad inicial aumenta a incrementos cada vez menores en respuesta a incremento de concentracin de sustrato. Finalmente se alcanza un punto mas all del cual se dan incrementos pequesimos de la velocidad inicial con el incremento de la concentracin de sustrato. A esto se le llama Vmax. La velocidad mxima se determina cuando todo el enzima este virtualmente como complejo enzima sustrato y la concentracin de enzima sean extremadamente pequeas. Cual es el objetivo de hacer controles durante el ensayo enzimtico. Cuales son los ms usados?. Siempre hay que realizar controles para conocer la posible contaminacin del medio de ensayos con productos. Los controles tpicos son: tiempo cero de la reaccion enzimatica y control no enzimatico. Que funcin cumple el blanco en este experimento? La funcin de este es para poder calibrar el espectrofotmetro debido a que este no contiene sustrato. Defina actividad enzimatica y actividad especifica, como determinara cada una de ellas. La actividad enzimtica: los grupos funcionales cataliticos de los enzimas puede interaccionar de manera transitoria con un sustrato activndolo para la reaccion. En muchos casos, estos grupos disminuyen la energa de activacin (acelerando de este modo la reaccin) al proporcionar una ruta de reaccin de menor energa.

La actividad especifica: la interaccin entre enzima y sustrato es canalizada por las mismas

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fuerzas que estabilizan la estructura proteica, a saber, puentes de hidrogeno e interacciones inicas, hidrofobicas y de van der waals. Por que se realiza una curva de calibracin con p-nitrofenol en la reaccin enzimatica medida? Por que es un indicador para la reaccin. En la siguiente actividad practica cmo se evala la actividad enzimatica?
Mediante la cantidad de producto que se forma en un tiempo determinado y luego con el espectrofotmetro se ve la absorbancia. Por que se utiliza un tampn o buffer para medir la actividad enzimatica? Se utiliza un tampn para poder detener la formacin de producto debido a que este frena la actividad de la enzima, debido a que se necesita calcular la formacin de producto en un tiempo determinado.

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Laboratorio de Bioqumica Informe N 4 Extraccin Y caracterizacin de la fosfatasa cida

Bibliografa. Gua de laboratorio de bioqumica plan comn, semestre de otoo 2000. Laboratorio N 4. Lehninger, Principios de bioqumica 2 edicin, editorial omega. Pag. 205, 213, 215, 222. Encarta, Enciclopedia multimedia.

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Curva de calibracin con P-Nitrofenol:

El experimento de la curva de calibracin con P-Nitrofenol, dio como resultado que el tubo 2 posee menos absorbancia, y esta aumenta con el numero de tubos hasta llegar al numero 6, que es la que posee la mayor absorbancia, debido a la concentracin existente en los tubos de p-Nitrofenol, que en solucin alcalina, como esta (NaOH), se transforma en P-Nitrofenolato, que absorbe fuertemente la luz a 405 nm. Por lo tanto a mayor concentracin de P-Nitrofenol, mayor absorbancia y viceversa.
Tubo 1 2 3 4 5 6 Absorbancia 0,19 0,349 0,532 0,694 0,83 Concentracin 0 1 2 3 4 5

Curva de Calibracin con P-Nitrofenol


Concentracin 6 4 2 0 0 0,5 Absorbancia 1
Concentracion

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Efecto del pH en la reaccin enzimtica Este experimento dio como resultado que a mayor pH existir mayor absorbancia, y por lo tanto ser ms lenta la reaccin enzimtica, ya que el sustrato, P-Nitrofenilfosfato, disociar ms lento hasta P-Nitrofenol, que luego dar P-Nitrofenolato, y por lo tanto, existir menor absorbancia.
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 Absorbancia -0,089 0,09 0,192 0,152 0,098 0,062 -0,034 -0,074

0,3 0,2 0,1 0 -0,1 0 -0,2

Absorbancia

Absorbancia 5 Tubos 10

Efecto de la temperatura en la reaccin enzimtica. En los tubos T, que poseen el extracto crudo, dio como resultado general, que la enzima no acta bien ni a altas ni a bajas temperaturas, por lo que tiene un punto optimo de accin a los 37C, en cambio en los tubos C que no poseen extracto crudo, la reaccin aumenta paulatinamente con la temperatura, por lo que a mayor temperatura mayor hidrlisis qumica del sustrato. En cambio en los tubos T a mayor temperatura la reaccin enzimtica, comienza a decaer ya menor temperatura, la reaccin enzimatica, comienza a ascender, llegando hasta su punto optimo, para luego descender.
tubo del 1 al 5 Temperatura 0 20 37 60 100 Absorbancia 1,27 0,104 0,269 0,102 0,226

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Efecto de la temperatura en la reaccin enzimatica


Absorbancia 1,5 1 0,5 0 0 50 100 150 Temperatura

Absorbancia

tubo del 1 al 5 Temperatura 0 20 37 60 100

Absorbancia 0,01 0,009 0,008 0,009 0,124

Efecto de la temperatura en la reaccin enzimatica


0,15 0,1 0,05 0 -0,05 0 Absorbancia

Absorbancia 50 100 150

Temperatura

Efecto de la concentracin de sustrato en la reaccin enzimatica. El experimento dio como resultado que a mayor concentracin de P-nitrofenilfosfato, existe una mayor reaccin enzimatica, no llegando as hasta su punto de saturacin, y por ende a mayor concentracin de sustrato no es reaccin enzimatica.
Tubo 1 2 3 4 Absorbancia 0,026 0,071 0,091 0,132

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E fe c to d e la c o n c e n tra c i n d e s u s tra to e n la c o n c e n tra c i n e n z im a tic a


Absorbancia 0 ,1 5 0 ,1 0 ,0 5 0 0 2 T ubos 4 6

Ab s o rb a n c ia

Conclusin. Cada enzima tiene un pH optimo as como una especifidad caracterstica para los sustratos donde acta.
Tambin la temperatura tiene que ser la adecuada para el funcionamiento de cada enzima en particular, para que esta pueda desminuir con mayor eficiencia la energa de activacin y as poder acelerar la formacin de producto. Tambin pudimos determinar que la concentracin de sustrato afecta en la capacidad cataltica de un enzima debido a que esta se satura a determinada concentracin y la actividad se mantiene constante, por otro lado a poca cantidad de sustrato esta no logra su mxima capacidad cataltica.. Por lo tanto un enzima debe estar en las condiciones adecuadas para que su funcionamiento sea el mejor y para poder esperar los resultados que se estn buscando.

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