1 El reino de los hongos se clasifican en

Hongos filamentosos (mohos), Organismos filamentosos eucariotas multicelulares y

3 Crecimiento
Las micotoxinas se suelen formar al final de la fase exponencial o al principio de la fase estacionaria del crecimiento del moho.

Constituidos por micelio verdaderos, Carecen de clorofila y estn formados por una serie de clulas alineadas, llamadas hifas. El micelio es el conjunto de hifas ramificadas, y resulta visible sobre el alimento, bien en superficie o en el interior, mediante un aspecto o color caracterstico.

4 Las micotoxinas se producen en condiciones

desfavorables de: Recoleccin Almacenamiento Elaboracin de cereales y semillas

5 Etapas observables del proceso de crecimiento

de los mohos en los cereales: 1. 2. 3. Disminucin de la capacidad del grano para germinar Decoloracin Produccin de las micotoxinas, autocalentamiento, produccin de olores, formacin de costra y aumento rpido de la actividad de agua Finalmente, deterioro completo del grano y crecimiento de una larga lista de microorganismos

2 Los hongos utilizan para su crecimiento una

serie de sustancias qumicas denominadas metabolitos primarios, como pueden ser cidos nucleicos, protenas, carbohidratos y lpidos mayoritariamente. El uso de estos metabolitos primarios se asocia con la base de rpido crecimiento, Los metabolitos secundarios son una serie de compuestos que no esenciales para el crecimiento o metabolismo de los organismos. Dentro de este grupo, tenemos a los antibiticos y a las micotoxinas. Las micotoxinas, deriva de las palabras griegas mikes y toxina, que significan hongo y veneno respectivamente. Segn la FAO, define las micotoxinas, como metabolitos secundarios de hongos que provocan cambios patolgicos, en humanos y animales, la micotoxicosis son los sndromes de la toxicidad d la absorcin de micotoxinas. Las micotoxinas son compuestos de bajo peso molecular que a diferencia de las toxinas bacterianas no provocan sntomas inmediatos de envenenamiento cuando se ingieren.

4.

La ocratoxina puede estar implicada en la epidemiologia de la enfermedad del arroz amarillo, se destaca por la presencia de penicilios y sus metabolitos txicos en la superficie de los granos de arroz. Este arroz enmohecido suele tener un color amarillo descolorido y varios de los metabolitos txicos son en s pigmentos amarillos.

Dentro de las micotoxinas se pueden

Estos hongos no disponen de mecanismos

encontrar: Aflatoxinas Esterigmatocistina Ocratoxinas Zearalenona Patulina Fumonisinas Tricotecenos

Las ocratoxinas tienen en su estructura tiene un anillo lactnico y se encuentran en diversos alimentos como, cereales, maz, arroz, frutos secos, semillas, legumbres, pasas, vino, tejidos de animales y derivados lcteos, frutas y zumos, y quesos.

7 Ocratoxinas
La ocratoxina A (OTA) es la ms txica de ellas. Las ocratoxinas en especial la OTA son producidas por los hongos: Aspergillus ochraceus Penicillum verrucosum

activos para la dispersin de sus esporas, pero producen una gran cantidad de esporas no humedecibles que son resistentes al dao de la desecacin y de la luz, por tanto las esporas de Penicillum y de Aspergillus llegan a todas partes de manera pasiva por lo que las especies d estos dos gneros son responsables de una gran parte de la alteracin de alimentos. Por ejemplo las esporas de Penicillum son esfricas y tiene un dimetro de 2-3 m, por ello son lo suficientemente pequeas y ligeras para ser dispersadas en el aire turbulento. El polvo generado cada vez que se maneja el grano es una de las principales causas de dispersin de las esporas fngicas al ambiente de los silos y molinos. Estos hongos son denominados hongos de almacenamiento, ya que estn adaptados a las condiciones ms constantes de los cereales en almacenamiento y generalmente crecen a actividades de agua ms bajas.

9 En los alimentos las ocratoxinas tienen inters,

adems de por desconocerse su efecto en el hombre, al menos por tres razones: 1. 2. 3. Su toxicidad para ciertos animales Algunas de ellas son termorresistentes Muchos hongos son capaces de crecer y elaborar ocratoxinas a temperaturas inferiores a 10C

Los principales efectos txicos de las ocratoxinas: Nefrotxica Teratognicas Carcinognicas Inmunotxicas

El riesgo de intoxicacin por micotoxinas en el hombre es bajo o moderado en comparacin a intoxicaciones de origen microbiolgico o por contaminantes qumicos.

10 La ocratoxina A
La OTA es liposoluble y no se excreta fcilmente, se acumula en la grasa de depsito de los animales afectados ingirindose al consumir carne de los mismos. En cuanto a la toxicidad crnica de la ocratoxina A, la agencia Internacional de Investigacin sobre el Cncer (IARC; Internacional Agency for Research on Cancer), clasifica a las ocratoxinas en el Grupo 2B: Agente posiblemente carcingeno; la evidencia en humanos es limitada y tampoco hay suficiente evidencia con animales de experimentacin. El P. verrucosum est especialmente asociado con cereales almacenados y es muy comn en pases del norte de Europa y Canad, por el contrario el A. ochraceus es un hongo de clima clido y tropical.

13 TOXICIDAD
Toxicocintica En todas las especies animales estudiadas la OTA se absorbe rpidamente del tracto gastrointestinal y se elimina lentamente. Su biodisponibilidad en las especies de mamferos es superior al 50 %. Se excreta en heces y orina Toxicidad aguda La toxicidad aguda de la OTA es relativamente baja y muestra variaciones interespecficas. La DL50 por va oral se encuentra en un intervalo entre aproximadamente 20 y 50 mg/kg en ratas y ratones; hasta 0.2-1 mg/kg en perros, cerdos y pollos, que son las especies ms sensibles. Los sntomas de la intoxicacin aguda consisten en hemorragias multifocales en los principales rganos y trombos de fibrina en bazo, cerebro, hgado, rin y corazn, as como nefrosis y necrosis heptica y en el tejido linfoide. Toxicidad crnica El consumo crnico de OTA produce nefropata intersticial en los animales de granja, como pollos y cerdos, que puede causar importantes prdidas econmicas. A pesar de las diferencias en cuanto a la toxicocintica en diversas especies, las lesiones renales en cerdos, aves y roedores son muy similares. En el ser humano se ha relacionado con la etiologa de una nefropata que es endmica en la zona de los Balcanes, debido a que presenta una gran semejanza histopatolgica con la que se produce en los animales y a que la exposicin a OTA parece ser muy alta en esa zona geogrfica comparada con otras. Se trata de una enfermedad renal crnica y progresiva que representa actualmente el 11 % de todas las enfermedades primarias diagnosticadas en la antigua Yugoslavia. Esta enfermedad se acompaa a veces de tumores malignos del tracto urinario superior que resultan muy agresivos.

11 La produccin de OTA se da a una aw mnima

de 0,80. A. ochraceus es capaz de crecer a valores de aw tan bajos como 0.77-0.85 en medio agar y entre 0.80-0.85 en granos cereales. P. verrucosum crece a 0.80 aw en medio agar y de 0.85 en granos cereales La OTA produce en mayor cantidad entre 0.90 y 0.95 aw a 20C ,siendo la aw mnima de 0.830.85 que corresponde a la P. verrucosum.

12 Fuentes de OTA en alimentos.

Los cereales (trigo, cebada, avena, centeno, maz y arroz) son la principal fuente de consumo alimentario de OTA por su susceptibilidad a la contaminacin por hongos toxignicos durante la cosecha, el secado y/o almacenamiento, adems de ser la base de la alimentacin a nivel mundial Entre los derivados de cereales, el pan puede presentar esta micotoxina porque el lavado y la molienda de los granos del trigo no disminuyen considerablemente la presencia de la OTA en la harina y por consiguiente en el producto final. En cereales de desayuno su presencia es baja, excepto en aquellas muestras ricas en muesli donde se obtuvieron valores ms altos ya que las uvas pasas son una de las fuentes de OTA.

14 INGESTAS DIARIAS DE OTA EN FUNCIN DE

LOS ALIMENTOS CONSUMIDOS

15

Niveles mximos de OTA en alimentacin humana

16 Algunas formas de control en cereales:

o maquinaria de los molinos debe limpiarse regularmente para evitar la acumlacion de materiales estticos, en los que existan mohos e insectos La limpieza de todas las reas en las que manipulen productos secos deben realizarse sin agua. Harinas con menos del 15% de humedad y por debajo del 14% de agua para evitar el crecimiento fngico Molinos con programa de control de insectos y roedores Evitar condensaciones que puedan caer sobre los productos o acumularse en la maquinaria Limpieza de insectos muertos inmediatamente despus de la fumigacin y asi evitar la descomposicin y la contaminacin

17 Los mtodos mas utilizados para la

extraccin de ocratoxinas son o Extraccin en fase slida (SPE) Esta tcnica consiste en extraer las micotoxinas disueltas en una matriz acuosa al atravesar un soporte slido, previamente acondicionado, donde quedan retenidas, y eluir posteriormente con una cantidad pequea de disolvente. Esta tcnica es recomendable para el anlisis de muestras lquidas; en primer lugar se acondiciona la columna, la muestra lquida se pasa a travs de la columna y el analito junto con interferencias de la matriz queda atrapado en la misma. Las Interferencias son eluidas previamente mediante un enjuague de la columna; posteriormente se eluye el analito y concentra mediante la evaporacin del exceso de disolvente empleando corriente de nitrgeno. La eleccin de la fase slida depende de la polaridad de las micotoxinas y del tipo de matriz utilizada.

o o

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DE DETERMINACION DE o Extraccin con columnas Mycosep Consisten en una columna compuesta de una mezcla de varios adsorbentes (carbn, celita, resinas de intercambio inico entre otras) En el extremo inferior de la columna hay un borde de plstico, una membrana porosa y una vlvula que facilita el paso del extracto por la columna; en el extremo superior tiene un tubo de plstico donde se recolecta el extracto purificado en cuestin de egundos. La mayora de las interferencias se retienen en la columna pero no el analito, por lo que no es necesario eluir.

METODOS OCTRATOXINAS

El anlisis de micotoxinas en un alimento se divide en tres bloques extraccin y purificacin: La extraccin se basa en la solubilidad de las micotoxinas en disolventes orgnicos y acuoorgnicos. Se pretende el paso de la micotoxina desde la matriz a una fase lquida sufientemente limpia con la cual trabajar. Despues de la extraccin es importante llevar a cabo una etapa de purificacin o limpieza que permita obtener cromatogramas ms limpios.

19Microextraccin en fase slida (SPME, Solid

Phase MicroExtraction). Las micotoxinas son retenidas sobre una fase absorbente emplazada en el extremo de una microjeringa modificada, las cuales se desorben posteriormente en el inyector de un cromatgrafo de gases o de lquidos. La extraccin se puede realizar por inmersin directa de la fibra en la muestra lquida, o por espacio de cabeza (un sistema cerrado, donde la fibra se encuentra suspendida sobre la muestra). La principal ventaja de esta tcnica es que elimina la utilizacin de disolventes y no requiere apenas mano de obra, sus inconvenientes son que requiere un largo tiempo de extraccin, es reproducible pero no necesariamente cuantitativa y para cada alimento deben estudiarse los efectos de matriz.

aplicado en la determinacin de ocratoxina A en arroz y derivados.

22
Extraccin lquida presurizada (PLE Pressurized Liquid Extraction) La extraccin sigue tres etapas; el analito difunde del interior de la matriz a la superficie, despus se transfiere al solvente de extraccin y por ltimo el analito es eluido de la celda de extraccin. La tcnica consiste en introducir la muestra dentro de una celda de extraccin de acero inoxidable y cerrarla. Una vez colocada en el carrusel de extraccin, la celda se llena de disolvente. Bajo condiciones estticas, el disolvente y la muestra estn en contacto bajo temperatura y presin constantes determinadas por el analista (5-10 min generalmente), a este periodo de tiempo se le denomina ciclo o tiempo esttico, el ciclo puede programarse para repetirse varias veces y mejorar la extraccin. Cuando el ciclo ha terminado, se hace pasar disolvente limpio a travs de la celda, para empujar el disolvente que pueda quedar atrapado en la matriz hacia el vial colector se hace pasar una corriente de nitrgeno.

20extraccin con columnas de inmunoafinidad

(IAC, ImmunoAffinity Column). es la ms utilizada por su alta selectividad frente a otras tcnicas y facilidad de uso. El procedimiento de purificacin consiste en acondicionar previamente la columna, para luego aadir el extracto objeto de anlisis. La micotoxina problema se unir a los anticuerpos monoclonales fijados en la columna de inmunoafinidad y mediante un lquido de lavado podrn eliminarse los restos de la matriz. Por ltimo, la elucin de la micotoxina por desnaturalizacin de los anticuerpos permitir continuar el anlisis (Figura 1.13). Las columnas de inmunoafinidad presetan el inconveniente de tener un alto coste, fecha de caducidad y en ocasiones la variabilidad de la reproducibilidad interlotes. columna de inmunoafinidad Las micotoxinas tienen por lo general un tamao molecular bajo compotandose como sustancias haptenos. Los anticuerpos producidos requieres una unin a distintos transportadores tales como agarosa, sefarosa o dextrano, para fijarlo en la fase estacionaria.

23 Tcnicas de exploracin o screening

La finalidad analtica de las tcnicas de exploracin o screening es la de descartar, de una manera rpida, las muestras negativas y reducir al mximo el nmero de anlisis. o ELISA Se basa en la detencin de un antgeno inmovilizado sobre una fase slida mediante anticuerpos que directa o indirectamente produccin una reaccin cuyo producto, puede ser un colorante, que puede ser medido espectrofotomtricamente.

21Extraccin acelerada por disolventes

Consiste en una extraccin slido-lquida a temperatura y presin prefijadas. Para ello se rellena una columna con un alimento deseado y se combea el disolvente, o la mezcla de ellos, consiguindose en ocasiones una extraccin ms eficaz con menor cantidad de disolvente. Se ha

24 Tcnicas de confirmacin
o Cromatografa en capa fina (CCF o TLC, Thinlayer chromatography) En la TLC, consiste en una fase estacionaria polar y una fase mvil apolar, la fase estacionaria puede ser de papel, de celulosa o de un gel de silicato (vidrio molido bien fino)unido a una superficie solida(placa de vidrio, aluminio, plstico o papel) Procedimiento: se colocan las muestras a un centmetro del borde en uno de los extremos de la placa, se deja secar, se coloca la placa en un envase (tanque de desarrollo) que ya contiene una pequeacantidad del solvente, se tapa y se deja correr por un rato. El solvente subir por capilaridad e ir arrastrando las molculas, las cuales se movern segn la afinidad que muestren por la fase estacionaria (casi hasta el borde superior de la placa), se extrae la placa y se deja secar. Si la mezcla de muestras que se est analizando presenta color cuando se procede a la visualizacin del crotograma, se vern los distintos colores migrando a distintas velocidades, las placas en general portan un agente fluorescente inorgnico en la fase estacionaria,con la aplicacin de luz UV de 333nm se detecta la fluorescencia verde caracterstica de las ocratoxinas A 30% de uso en ocratoxina A

correspondiente a cada pico, la cual proporcional a la cantidad de sustancia. Para ocratoxina A se utiliza en un 4%

es

26 Cromatografa lquida y de alta eficiencia (LC

y HPLC) La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra mvil. En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija. La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual est rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de los micrones, lo cual gener la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase mvil. De esta manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas. Los detectores utilizados son: UV, que es universal pero poco selectivo ya que muchas molculas absorben a la misma longitud de onda que las micotoxinas; la fluorescencia que por el contrario es muy selectiva y por lo tanto no aplicable a cualquier micotoxina la espectrometra de masas que genera detecciones especficas Para ocratoxina A se utiliza en un 66%

25 Cromatografa gaseosa (GC)

El gas portador (fase mvil) proviene de cilindros provistos de vlvulas reductoras. La muestra se introduce en el inyector con una microjeringa a travs de un septum de goma. All se produce la vaporizacin instantnea de la muestra y su introduccin en la corriente de gas. La columna se halla dentro de un horno que permite variar su temperatura y es el lugar en donde se produce la separacin de los componentes de la muestra. El detector produce una seal elctrica proporcional a la cantidad de materia a medida que cada componente separado pasa a travs de l. Esa seal es enviada al registrador que realiza un grfico de intensidad en funcin del tiempo (cromatograma) del tipo: Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. El integrador calcula adems el rea