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Contenido

INTRODUCCION

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OBJETIVOS

3

DESARROLLO EXPERIMENTAL

3

DIAGRAMAS DE BLOQUE

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ANALISIS DE RESULTADOS

8

Método de Bradford

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CONCLUSIONES

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REFERENCIAS

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ANEXOS

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INTRODUCCION

Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en la célula, ellas constituyen más del 50% del peso seco de la célula. Cada tipo celular, tiene un rol específico determinado por su composición proteica. Con la posibilidad de que 20 (o 22) aminoácidos diferentes puedan estar unidos en cualquier orden para conformar polipéptidos de cientos de aminoácidos, tienen el extraordinario potencial de producir una gran cantidad de variantes en su conformación. Esta variedad genera funciones tan refinadas como las de las enzimas que están involucradas en el metabolismo celular. Una bacteria puede tener cerca de 1000 proteínas diferentes, en una célula humana puede haber más de 10.000 clases de proteínas distintas. La composición proteica de las células en un determinado momento depende del conjunto de genes que se estén activando y esto está relacionado directamente con las señales que recibe la célula, de su micro ambiente y de las características celulares que le son propias.

Finalidad del extracto proteico: esto determinará el buffer de extracción que se utilizará dependiendo se desea o no que las proteínas conserven su actividad biológica, su conformación nativa, su interacción con otras proteínas u otras moléculas (evitar una desnaturalización). Algunos protocolos son tan violentos que involucran la ruptura de todas las membranas; otros en cambio permiten fraccionar y obtener, distintos componentes subcelulares (núcleos, mitocondrias, etc.).

En la presente práctica se hiso la determinación de proteína soluble por espectrofotometría UV- VISIBLE de una muestra de harina de arroz ya que en su mayoría contiene glutelina que constituye el 80% de las proteínas presentes, aparte de los tipos de proteína como las albúminas, globulinas, y prolaminas. Respecto al uso del espectrofotómetro, se realizó una curva tipo de absorbancia contra concentración para cuantificar la concentración de proteínas. La determinación de la proteína se realizó por el método de Bradford, existe también el método de Lowry y de Bouriet.

La prueba para determinar proteínas por el método de Bradford se basa en el acoplamiento del colorante con la proteína y se determina colorimétricamente, existe una relación directa entre el desarrollo del color y la concentración de proteínas.

Con este método las proteínas tienen una capacidad de absorción máxima de 465 eso cambia a 595 nm cuando el colorante esta unido a las proteínas, por eso las lecturas de la cuantificación de las proteínas se hicieron a esa longitud de onda. Este es el principio básico del azul de Coomasie para la determinación de proteínas por Bradford. La ventaja de este método es su simplicidad (solamente un reactivo) y su rapidez (5 min.), no presenta interferencia con sustancias reductoras como el DTT y el β-mercaptoetanol. Sí interfieren con los ensayos de Lowry y BCA, La desventaja es que es altamente sensible a detergentes y lípidos.

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OBJETIVOS

En esta práctica se pretende saber el fundamento, sus ventajas, inconveniencias y diferencia con el método empleado para la determinación de proteína (Biuret y Lowry).

Se aplicará el método de Bradford y se realizará una curva estándar.

Se determinará espectrofotométricamente la concentración de proteínas solubles en una muestra problema.

Se realizará una curva tipo de Absorbancia vs concentración.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

DESENGRASADO DE LA MUESTRA

- Se colocó harina de arroz en un vaso de precipitado y se mezcló con hexano en relación 1:2 (harina : solvente).

- Se agitó en una parrilla eléctrica la mezcla con un agitador magnético durante 30 minutos.

- Se retiró la mezcla y se dejó reposar por 10 minutos.

- Se decantó el solvente que contenía la grasa.

- Se dejó secar el sólido en la campana, para usarlo en la extracción de la proteína.

PREPARACION DE DISOLUCIONES ESTÁNDAR DE BSA (Alubina de soro bobina)

- De una concentración de BSA de 2mg/mL.

- Se preparó para una concentración de 125μg/mL una cantidad de 62.5 μL de BSA.

- Se preparó para una concentración de 250 una cantidad de 125μL de BSA.

- Se preparó para una concentración de 500 una cantidad de 250μL de BSA.

- Se preparó para una concentración de 750 una cantidad de 375μL de BSA.

- Se preparó para una concentración de 1000 una cantidad de 500μL de BSA.

- Se utilizó como blanco agua.

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA EXTRACCIÓN DE PROTEÍNA

- Se prepararon 25mL de NaCl 0.1 M y 25mL de NaOH 0.1 M respecto a los cálculos previamente realizados.

- Estas soluciones se utilizaron en frío.

EXTRACCIÓN DE PROTEÍNA

- Se colocó 1g de harina desengrasada en un vaso de precipitado de 50mL.

- Se agregó 10mL de agua destilada para agitar durante 10 minutos.

- Se transfirió la solución a la centrifuga equilibrando los tubos aplicando agua en las fundas.

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- Se centrifugó a 1,300 rpm durante 15 minutos.

PREPARACIÓN DE LA CURVA TIPO

- De cada disolución preparada en las mencionadas disoluciones de BSA

- Se tomaron los volúmenes y las condiciones mencionadas en la bitácora para realizar la curva tipo.

- El blanco solo se hiso de 40μL de agua destilada + 2mL del reactivo de Bradford.

- El equipo 1 utilizó como solvente agua, el equipo 2 NaCl, el equipo 3 NaCl, nuestro equipo (4) NaOH y el equipo 5 usó NaOH.

- Se leyeron las Absorbancias de las soluciones registrándolas en la bitácora.

- Solo se leyó por triplicado la absorbancia de las soluciones.

- Esto se hiso por equipo

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA POR EXTRACTOS

- Se tomaron 40μL de los extractos de proteína obtenidos en la actividad de extracción de proteína.

- Se agregaron 2mL del reactivo de Bradford.

- Se homogenizó en agitador vórtex dejando reposar 8 minutos

- Se leyeron las Absorbancias a 595 nm

- Se utilizó como blanco agua destilada

- Se realizó por triplicado la lectura y se sacó un promedio de éstas.

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DIAGRAMAS DE BLOQUE

- Preparación del reactivo de Bradford

DIAGRAMAS DE BLOQUE - Preparación del reactivo de Bradford - Desengrasado de la muestra 5

- Desengrasado de la muestra

DIAGRAMAS DE BLOQUE - Preparación del reactivo de Bradford - Desengrasado de la muestra 5

5

- Preparación de disoluciones estándar de BSA

- Preparación de disoluciones estándar de BSA - Preparaciones de soluciones para extracción de proteína -

- Preparaciones de soluciones para extracción de proteína

disoluciones estándar de BSA - Preparaciones de soluciones para extracción de proteína - Extracción de proteína

- Extracción de proteína

disoluciones estándar de BSA - Preparaciones de soluciones para extracción de proteína - Extracción de proteína

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- Preparación de la curva tipo

- Preparación de la curva tipo - Cuantificación de proteína en extractos 7

- Cuantificación de proteína en extractos

- Preparación de la curva tipo - Cuantificación de proteína en extractos 7

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ANALISIS DE RESULTADOS.

Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica). Como en algunos casos el fenómeno de la desnaturalización es reversible, es posible precipitar proteínas de manera selectiva mediante cambios en:

- La polaridad del disolvente.

- La fuerza iónica.

- El pH.

- La temperatura.

Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan. Asimismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones débiles y desorganiza la estructura de la proteína, de forma que el interior hidrófobo interacciona con el medio acuoso y se produce la agregación y precipitación de la proteína desnaturalizada.

La prueba para determinar proteínas por el método de Bradford se basa en el acoplamiento del colorante con la proteína y se determina colorimétricamente, existe una relación directa entre el desarrollo del color y la concentración de proteínas.

Con este método las proteínas tienen una capacidad de absorción máxima de 465 eso cambia a 595 nm cuando el colorante esta unido a las proteínas, por eso las lecturas de la cuantificación de las proteínas se hicieron a esa longitud de onda. Este es el principio básico del azul de Coomasie para la determinación de proteínas por Bradford.

La ventaja de este método es su simplicidad (solamente un reactivo) y su rapidez (5 min.)

Método de Bradford. Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 μg), simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.

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Determinación de proteínas solubles por espectrofotometría UV-vis.

Obtención de la curva de calibración.

TABLA 1.- Absorbancias registradas para la elaboración de la curva tipo

tubo

concentración BSA

abs λ=595 equipo

abs λ=595 equipo

abs λ=595 equipo

Abs

(μg/mL)

4

1

4

promedio

blanco

0

0

0

0

 

1

125

0.081

0.104

0.098

0.09433333

2

250

0.104

0.17

0.146

0.14

3

500

0.209

0.35

0.352

0.30366667

4

750

0.455

0.383

0.531

0.45633333

5

1000

0.598

0.558

0.634

0.59666667

Título del gráfico

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 y = 0.0006x + 0.0086 R² = 0.9976 Abs promedio
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
y = 0.0006x + 0.0086
R² = 0.9976
Abs promedio
0.2
Lineal ()
0.1
Lineal (Abs
promedio )
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Abs promedio

concentracion BSA (μg/mL)

Es posible observar que la curva de calibración obtenida con los estándares, tiene una buena regresión, R2 = 0.9976. Y es posible determinar que cumple con el ajuste que se planeta la obtención de el coeficiente > de

0.96.

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Obtención de [ ] de proteína en las muestras.

TABLA 2.- Absorbancias de los extractos de harina.

         

Abs

muestra

Solvente utilizado

abs 1 λ=595

abs 2 λ=595

abs 3 λ=595

promedio

1

H2O

0.132

0.13

0.14

0.134

 

2 NaCl

0.282

0.203

0.278

0.25433333

 

3 NaCl

0.224

0.325

0.26

0.26966667

 

4 NaOH

0.259

0.301

0.284

0.28133333

 

5 NaOH

0.251

0.167

0.258

0.22533333

Para obtener la [ ] de proteína soluble presente en el extracto, considerando la absorbancia promedio de cada

muestra. Para esto utilizaremos la ecuación obtenida de la recta del calibrado y=mx+b; donde:

y es igual a la Absorbancia a λ=595.

b es igual a la ordenada de origen.

m es igual a la pendiente.

x es igual a la [ ] de proteína.

La determinación de la cantidad de proteína en las muestras problema despejando los valores de “x” de la

ecuación de la recta (y = 0.0006X +0.0086) quedaría:

Tabla 3: determinación de la cantidad de proteína utilizando la ecuación de recta.

Tubo No.

Abs promedio

[ ] de proteína

1

0.134

209

2

0.25433333

409.55

3

0.26966667

435.1

4

0.28133333

454.55

5

0.22533333

361.21

En el caso de las diluciones realizadas por los equipos 4 y 5 se tomamos en cuenta los factores de disolución, por cada mililitro de muestra se obtiene la siguiente tabla:

Tabla 4: Concentración de proteína en las muestras problema.

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Tubo No.

[ ] de proteína

Factor de disolución

Proteína (mg/ml)

 

4 454.55

1X10

4545.5

 

5 361.21

1X10

3612.1

Para determinar el valor del % de proteína, utilizaremos la siguiente expresión:

Donde:

[ ] de proteína es el valor de cada muestra dado en la tabla 3.

mL de extracto es igual a 0.04 mL.

g de harina es igual a 1.

muestra

 

1

8.36

2

16.382

3

17.404

4

18.182

5

14.448

g de harina es igual a 1. muestra   1 8.36 2 16.382 3 17.404 4

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CONCLUSIONES

La curva de patrón es un método de química analítica empleado para medir la concentración de una

sustancia en una muestra por comparación con una serie de elementos de concentración conocida.

Se puede determinar la concentración de proteína en una o varias muestras problema, que resultan

al interpolar los valores de absorbancia en una curva patrón originada a partir de concentración de

proteína conocida.

La solubilidad de proteínas se ve influenciada por factores como: composición de aminoácidos, estructura y el entorno de la proteína.

Se determino el valor de R2 = 0.9976. lo que nos indicó un resultado favorable.

La concentración de la muestra 1 fue de 209 mg/mL.

La concentración de la muestra 2 fue de 409.55 mg/mL.

La concentración de la muestra 3 fue de 435.1 mg/mL.

La concentración de la muestra 4 fue de 454.55 mg/mL.

La concentración de la muestra 5 fue de 361.21 mg/mL.

REFERENCIAS

Se consulto: 29/04/2012

Se consulto: 29/04/2012

Skoog, Douglas.West, Donald.Haller, James.1997.”Fundamentos de química analítica volumen 2”.2da edición. Editorial Reverte. Impreso en España.

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ANEXOS

Cálculos para determinar la concentración de proteína de cada una de las muestras.

Tubo1 Tubo2 Tubo 3 Tubo4 Tubo5
Tubo1
Tubo2
Tubo 3
Tubo4
Tubo5
Cálculos para determinar % de proteína de cada una de las muestras. Tubo 1 Tubo
Cálculos para determinar % de proteína de cada una de las muestras.
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Tubo 5

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