Produccin de protena microbiana a partir de los desechos del procesamiento de la caa de azcar (bagacillo)1 Microbial protein production from

waste of sugar cane processing (bagasse pith)

J. R. Ferrer , Y. Davalillo, C. Chandler, G. Pez, Z. Mrmol y E. Ramones
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Proyecto No. CC-0869-01 financiado por el Consejo de Desarrollo Cientfico y Humanstico (CONDES). LUZ. 2 Apartado 4011-A 526. Maracaibo, Estado Zulia, Venezuela. E-mail: jrferrer@cantv.net Laboratorio de Tecnologa de Alimentos, Escuela de Ingeniera Qumica, Facultad de Ingeniera, La Universidad del Zulia, Venezuela. Recibido Mayo 15, 2003. Aceptado Febrero 05, 2004. Code Number: la04008 ABSTRACT. A study was undertaken of microbial biomass production using hydrolyzed pith bagasse acid as a growth medium. Hydrolysis was carried out using diluted (6%v/v) sulfuric acid in a reaction time of four hours. The equipment used operated at boiling conditions with atmospheric pressure reflux, and with a liquid/solid relation of 30. The concentration of sugars in the hydrolyzed solution was carried out by a rotational evaporator. The Candida utilis (ATCC 9256) and Saccharomyces cerevisiae (ATCC 26603) yeasts were cultivated in the hydrolyzed concentrate 3 at a pH of 5.00, 30 C and 200 rpm. The greatest production of biomass was 4.90 0,03 kg/m in S. 3 cerevisiae and 9.45 0,01 kg/m in C. utilis. The yield of biomass was 1.19 0,012 kg/kg in S. cerevisiae and 1.86 0,040 kg/kg inC. utilis. The specific rate of growth was 0.0141 0,0001 and -1 0.0544 0,0001 h for S. cerevisiae and C. utilis, respectively. The biotechnological process utilized is an important fundamental alternative for the industrial usage of pith bagasse from sugar cane through the production of a protein concentrate for animal feeds. Key words: Microbial biomass, acid hydrolysis, Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae. RESUMEN. Se realiz un estudio de la produccin de biomasa microbiana usando hidrolizado cido de bagacillo de caa de azcar como medio de crecimiento. La hidrlisis se llev a cabo con cido sulfrico diluido (6%v/v) en un tiempo de reaccin de 4 horas. El equipo utilizado se oper en condiciones de ebullicin a reflujo a presin atmosfrica, con una relacin lquido/slido de 30. La concentracin de los azcares del hidrolizado fue realizada en un evaporador rotatorio. Las levaduras Candida utilis (ATCC 9256) y Saccharomyces cerevisiae (ATCC 26603) fueron cultivadas en el hidrolizado concentrado a pH 5,00, 30 C y 200 rpm. La mayor produccin de 3 3 biomasa fue de 4,90 0,03 kg/m para S. cerevisiae y 9,45 0,01 kg/m para C. utilis. El rendimiento de biomasa en funcin de consumo de sustrato fue 1,19 0,012 kg/kg para S. cerevisiae y 1,86 0,040 kg/kg para C. utilis. La tasa especfica de crecimiento fue 0,0141 0,0001 -1 y 0.0544 0,0001 h , para S. cerevisiae y C. utilis, respectivamente. El proceso biotecnolgico implementado, es una alternativa de importancia fundamental, para el aprovechamiento industrial del bagacillo de caa de azcar como va de produccin de concentrado proteico para alimentacin animal. Palabras clave: Biomasa microbiana, hidrlisis cida, Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae.

INTRODUCCIN Los mtodos convencionales para producir alimentos ricos en protenas no son suficientes para cubrir la alta demanda de estos a nivel mundial. Por consiguiente, la exploracin de fuentes no convencionales como la protena microbiana representa una alternativa de importancia fundamental para complementar dietas en alimentacin animal (Church y Pond, 1992). La razn principal para orientar la investigacin hacia estas fuentes proteicas, es que se logra una alta produccin de masa microbiana por hora, debido a que su tiempo de duplicacin es mayor al compararlo con otras fuentes animales o vegetales de protena (Meyer et al., 1992; Nigan, 2000). Los sustratos utilizados para la produccin de protena microbiana incluyen fuentes de carbono fsil (hidrocarburos lquidos y gaseosos) y las fuentes de carbono renovables como melaza, suero e hidrolizados de polisacridos (Bui y Galzy, 1990; Leveau y Bouix, 2000). La levadura utilizada para alimentacin animal es un producto rico en protenas y en vitaminas, la cual no fermenta por que presenta un metabolismo exclusivamente respiratorio sobre sustratos carbonados. Los valores promedios de protenas, expresados en porcentajes de materia seca, para Candida utilis, Candida lipolytica, Candida rugosa, Schawaniomyces cerevisiae y Kluyveromyces marxianus vara entre 33 y 45 % (Bui y Galzy, 1990). Estas protenas tienen en comn un alto porcentaje de lisina (del 7 al 9 %) y un bajo porcentaje de aminocidos azufrados (de 0,7 a 1,7 % de cistena y de 1 a 2 % de metionina). El bagacillo de caa de azcar es un material lignocelulsico, obtenido de las centrales azucareras como desecho, representando el 25 % del total de la caa de azcar procesada. La hidrlisis cida 3 del mismo con cido sulfrico diluido (6 % v/v) y 4 horas de reaccin, produce 16,76 kg/m de azcares reductores (Ferrer at al., 2002). Esta metodologa ha permitido desarrollar procesos biotecnolgicos para obtener protena microbiana y compuestos qumicos, usando como sustrato diferentes desechos agropecuarios (Colina et al., 1998; Quintero et al., 2001) y desechos de la industria de mariscos (Ferrer et al., 1996; Garca et al., 1996). Estableciendo la alternativa tecnolgica de aprovechamiento del bagacillo de caa de azcar y considerando la posibilidad de producir un concentrado proteico para suplementar la alimentacin de bovinos y caprinos, se estableci como objetivo de esta investigacin, estudiar los parmetros de crecimiento de las levaduras Candida utilis (ATCC 9256) y Saccharomyces cerevisiae (ATCC 26603) en el hidrolizado concentrado de bagacillo de caa de azcar. MATERIALES Y MTODOS Microorganismos. Las cepas utilizadas en esta investigacin fueron Candida utilis (ATCC 9256) y Saccharomyces cerevisiae (ATCC 26603), obtenidas de la American Type Culture Colletion (USA), en estado liofilizado. Ambos microorganismos fueron cultivados en cuas con agar YMBacto a 4 C y subcultivados cada tres meses. El medio de mantenimiento tiene la siguiente 3 3 3 composicin: Agar extracto de malta (3 kg/m ), glucosa (10 kg/m ), peptona (5 kg/m ) y agar (20 3 kg/m ) (American Type Culture Collection, 1991). Sustrato. El bagacillo de caa de azcar, objeto de este estudio, fue suministrado por la Central Azucarera Matilde, ubicada en Chivacoa, Estado Yaracuy, Venezuela. El material secado (estufa Memmert 840 Schwabach, modelo 772534, Alemania) y molido (molino Thomas Wiley, modelo 4 laboratory mill, USA) fue cernido a travs de un tamiz de 20 mesh, para homogeneizar las partculas a un tamao menor o igual a 0,84 mm. El mismo fue mantenido a temperatura ambiente en bolsas plsticas cerradas hermticamente hasta el momento de su uso.

El bagacillo tamizado fue sometido a caracterizacin qumica mediante la determinacin de: materia seca (934.01), protena cruda (988.05), grasa (954.02), cenizas (942.05), lignina, celulosa y hemicelulosa (973.18), utilizando la metodologa descrita en el manual de la AOAC (1990). Todos los anlisis se realizaron por triplicado. Hidrlisis cida. El bagacillo de caa de azcar fue sometido a un proceso de hidrlisis cida mediante reflujo total a presin atmosfrica, utilizando un equipo de destilacin de vidrio, con una capacidad de operacin de 500 mL. La concentracin del cido sulfrico, la relacin lquido/slido y el tiempo de reaccin usadas fueron 6% v/v, 30 y 4 horas, respectivamente. El hidrolizado se enfri rpidamente, en un bao con hielo, para detener la reaccin, se filtr al vaco a travs de papel Whatman N 1 y posteriormente, se ajust el pH de 2,00 a 4,50 con una solucin 2N de NaOH. Finalmente, se decolor con carbn activado y se guard bajo refrigeracin (8 C) hasta su utilizacin (Ferrer et al., 2002). Concentracin del hidrolizado. El equipo utilizado para concentrar el hidrolizado fue un evaporador rotatorio con bao de calentamiento (90 C) (Marca Heidolph, Alemania), el cual se conect a una bomba de vaco (Marca Welch duo seal, modelo 1400, USA) y a un sistema refrigerante. Las condiciones de operacin de la bomba de vaco y del refrigerante fueron 88 kPa de presin de vaco y 19 C de temperatura, respectivamente. Cultivo de S. cerevisiae en medio definido. Para conocer el comportamiento del crecimiento de la levadura S. cerevisiae utilizada en este estudio, se llev a cabo un cultivo por carga por triplicado, 3 en un medio definido con la siguiente composicin(Ferrer et al., 1996): glucosa (225 kg/m ), 3 3 3 peptona (10 kg/m ), KH2PO4 (0,25 kg/m ) y sulfato de magnesio (0,25 kg/m ).El bioproceso se realiz en fiolas de 500 mL con un volumen de trabajo de 100 mL con un pH ajustado a 4,5 y en una incubadora Innova 4300 (New Brunswick Scientific, USA ) a 30 C y 200 rpm, por un perodo de tiempo de 22 horas. El inculo consisti de 10 mL de suspensin de levadura, la cual tena 72 6 7 horas de incubacin a 30 C (con 10 a 10 unidades formadoras de colonias). Para el establecimiento de la cintica del bioproceso, se filtr el contenido de la fiola a travs de un filtro de membrana milipore (poro de 0,2 m), recuperndose en viales para la determinacin de azcares reductores y de biomasa. La biomasa se determin gravimtricamente, por triplicado, luego de secar la levadura a 45 C hasta peso constante. El contenido de azcares reductores se determin utilizando el mtodo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) con glucosa como estndar (Ferrer et al., 2002). Cultivo de S. cerevisiae en medio hidrolizado de bagacillo de caa de azcar. La capacidad de desarrollo de la levadura S. cerevisiae en el hidrolizado obtenido a partir del bagacillo de caa de azcar, se estableci mediante la cintica de produccin de biomasa y el porcentaje de consumo de sustrato (representado por el porcentaje de la diferencia entre los azcares reductores iniciales y los azcares reductores presentes con el tiempo, con respecto a los azcares reductores iniciales). Para tal fin, se cultiv la levadura en hidrolizado con pH ajustado a 4,50 y suplementado con medio 3 mineral estril. Dicho medio se formul con la siguiente composicin: KH 2PO4 (0,25 kg/m ), sulfato 3 3 de magnesio (0,25 kg/m ) y peptona (10 kg/m ). El volumen de trabajo fue de 100 mL en fiolas de 6 500 mL. El medio de cultivo fue inoculado con 10 mL de una suspensin de levadura (10 a 7 10 unidades formadoras de colonias) acondicionadas en el hidrolizado suplementado. Las fiolas se incubaron a 30 C y 200 rpm, durante 22 horas. Cultivo de C. utilis en medio definido. La cepa de C. utilis se cultiv en un medio de crecimiento conocido (Nigan, 1999) para establecer la cintica de crecimiento y de consumo de sustrato. La 3 3 composicin del medio utilizado fue: glucosa (200 kg/m ), KH2PO4 (10 kg/m ), (NH4)2SO4 (70 3 3 3 3 kg/m ), MgSO4 (2,5 kg/m ), CaCl2 (2 kg/m ) y extracto de levadura (0,1 kg/m ).

El cultivo se realiz en fiolas de 500 mL, por triplicado, con un volumen de 100 mL de medio de 6 7 crecimiento e inoculado con 10 mL de suspensin de levadura (10 a 10 unidades formadoras de colonias). El crecimiento del cultivo a 30 C y 200 r.p.m. se realiz hasta alcanzar la fase estacionaria (36 horas). Cultivo de C. utilis en medio hidrolizado de bagacillo de caa de azcar. Para establecer las caractersticas de crecimiento de la cepa de C. utilis en el medio formado con hidrolizado de bagacillo de caa de azcar y suplementado con 10 mL de medio mineral estril con la siguiente 3 3 3 composicin: KH2PO4 (2,00 kg/m ), (NH4)2SO4 (14,00 kg/m ), MgSO4 (0,50 kg/m ), CaCl2 (0,42 3 3 kg/m ) y extracto de levadura (0,01 kg/m ). El cultivo se realiz en fiolas de 500 mL, por triplicado, con un volumen de 100 mL de medio de 6 7 crecimiento e inoculado con 10 mL de suspensin de levadura (10 a 10 unidades formadoras de colonias). El crecimiento del cultivo a 30 C y 220 r.p.m. se realiz por 20 horas (tiempo para alcanzar la fase estacionaria del crecimiento). Caracterizacin de las levaduras S. cerevisiae y C. utilis. Las levaduras cultivadas fueron caracterizadas en lo concerniente a su contenido de protenas (mtodo de Kjeldah)(954.01) y minerales (968.08) (Espectrofotmetro de Absorcin Atmica Perkin Elmer, modelo 31310, Norwalk, Connecticut., USA)(A.O.A.C., 1990). Anlisis estadstico. Para comparar los resultados del crecimiento microbiano de las dos levaduras en el hidrolizado cido concentrado de bagacillo de caa de azcar, se aplic la prueba t student de comparacin de medias para un nivel de significancia P= 0,01 (Montgomery,1991) RESULTADOS Y DISCUSIN En el Cuadro 1 se puede observar la composicin del bagacillo de caa de azcar. El anlisis de dicho cuadro permite establecer que los contenidos de celulosa, hemicelulosa y lignina se encuentran dentro de los rangos correspondientes a la composicin de los materiales lignocelulsicos (40-60 %, 20-40 % y 10-25 %, para celulosa, hemicelulosa y lignina, respectivamente) indicados por otros investigadores (Colina et al. 1998; Ferrer et al., 2001; Krisna et al., 1998). Se puede observar una alta composicin en carbohidratos (celulosa 52,25 % y hemicelulosa 19,27 %) lo cual permite considerar a este desecho agroindustrial como un potencial material para obtener azcares solubles mediante hidrlisis cida (sacarificacin). Hidrlisis cida y concentracin del hidrolizado. El contenido de azcares reductores del 3 3 hidrolizado fue 16,211,24 kg/m , el cual se concentr a 341,63 kg/m en una hora de evaporacin al vaco, mediante la reduccin de volumen del hidrolizado en un 65 %. Crecimiento microbiano. La Figura 1 presenta las curvas de crecimiento de S. cerevisiae y el consumo de sustrato (glucosa) en medio definido con el tiempo. Se destaca la mxima produccin 3 de biomasa (6,96 0,04 kg/m ), una tasa especfica de crecimiento (pendiente de la recta de -1 crecimiento exponencial) de 0,080,002 h , un rendimiento en biomasa de 0,070,001 kg/kg de sustrato y un 38 por ciento de consumo de sustrato. La Figura 2 representa la cintica de crecimiento de S. cerevisiae y del consumo de sustrato (azcares reductores) en hidrolizado concentrado de bagacillo de caa de azcar. Las 3 caractersticas del crecimiento incluyen: mxima produccin de biomasa de 4,90 0,03 kg/m , tasa -1 especfica de crecimiento de 0,0141 0,0001 h , rendimiento en biomasa de 1,19 0,012 kg/kg sustrato y 8,0 por ciento de consumo de sustrato.

El anlisis del crecimiento de S. cerevisiae en hidrolizado concentrado de bagacillo de caa de azcar, al compararlo con el crecimiento en un medio definido, indica que el hecho de producirse una concentracin de biomasa, un porcentaje de consumo de sustrato y una tasa especfica de crecimiento menores, no influye en el rendimiento en biomasa, ya que este se increment sustancialmente al producirse 1,19 kg de biomasa por cada kg de sustrato consumido, lo cual sugiere que el microorganismo utiliz como sustrato algn carbohidrato que no fue medido como azcar reductor. Es importante destacar que las tasas especficas de crecimiento y los rendimientos de la levadura S. cerevisiae, encontrados en este estudio, se encuentran dentro de los valores reportados por otros investigadores (Ferrer et al., 1996; Kosaric et al., 1989; Lyutskanov et al., 1990). Con respecto a la C. utilis, la cintica de crecimiento y consumo de sustrato (glucosa) en medio definido se presenta en la Figura 3. En dicha figura se observa una produccin mxima de biomasa de 19,70 0,05 kg/m y un 54 % de consumo de sustrato. As mismo, para este cultivo se obtuvo una tasa especfica de crecimiento -1 de 0,11 0,002 h y un rendimiento de 0,20 0,01 kg de biomasa por kg de sustrato consumido. Para el crecimiento de C. utilis en hidrolizado concentrado de bagacillo de caa de azcar (Figura 3 4), los resultados obtenidos fueron: 9,45 0,01 kg/m de produccin mxima de biomasa, 11,6 % -1 de consumo de sustrato, 0,0544 0,0001 h de tasa especfica de crecimiento y un rendimiento de 1,86 0,040 kg de biomasa/kg sustrato consumido. El anlisis comparativo del comportamiento de la levadura C. utilis, creciendo en estos dos sustratos, indica que a pesar de alcanzar valores menores de biomasa, consumo de sustrato y tasa especfica del crecimiento en el hidrolizado, el rendimiento en biomasa fue nueve veces mayor. La literatura cientfica reporta valores similares para estos parmetros cuando la levadura C. utilis se desarrolla en diferentes sustratos (Alroy y Tannenbaum, 1973; Nigan, 1999; Tobajas y Garca-Calvo, 1999). Es importante destacar que al comparar la produccin de protena unicelular para S. cerevisiae y C. utilis, utilizando como sustrato hidrolizado cido de bagacillo de caa de azcar, en fase lquida, la levadura C. utilis produce 48 % mas biomasa para la misma concentracin de sustrato. El anlisis estadstico aplicado al crecimiento de las dos levaduras en hidrolizado cido concentrado de caa de azcar (ver Cuadro 2) indic que la produccin de biomasa, el rendimiento y la tasa especfica de crecimiento presentaron diferencias significativas, con un nivel de significancia P= 0,01, lo cual infiri que la levadura Candida utilis es la mejor levadura a usar en este bioproceso. Caracterizacin de las levaduras. El Cuadro 3 presenta la composicin de las levaduras estudiadas en base seca. La comparacin de estos componentes con otras fuentes de protenas tradicionales permite establecer que ambas levaduras tienen un contenido de protenas y minerales (Ca, P y Mg) mayor que la carne magra, las sardinas frescas, la carne de pollo, el atn enlatado, los huevos de gallina y la soya (Instituto Nacional de Nutricin, 1994). Estudios reportados por otros investigadores (Lyutskanov et al., 1990; Paraj et al., 1995, Pessoa et al., 1996) sobre el contenido de cidos nucleico de estas levaduras, indican valores de 1,4 % y 0,5 % para S. cerevisiae y C. utilis, respectivamente.
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Con respecto a la calidad de la protena unicelular, la Cuadro 4 muestra una comparacin entre el contenido de aminocidos de las levaduras S. cerevisiae y C. utilis, con granos de soya y alimento para rumiantes. Es importante destacar que las protenas de levaduras tienen un alto valor nutricional, caracterizadas por un perfil de aminocidos balanceado con un elevado contenido de lisina y treonina, lo cual le confiere un extraordinario potencial para su uso como complemento de dietas de cereales para animales, ya que estos son deficientes en estos aminocidos (Bhattacharjee, 1970; Kihlberg, 1972). CONCLUSIONES Se produjo concentrados proteicos de las levaduras S. cerevisiae y C. utilis, para suplementar la alimentacin de bovinos y caprinos, mediante el aprovechamiento biotecnolgico del desecho generado en el procesamiento industrial de la caa de azcar. La hidrlisis con cido sulfrico diluido (6% v/v) y una relacin lquido/slido de 30, mediante 4 horas en ebullicin a reflujo, de bagacillo de caa de azcar permite obtener azcares reductores solubles, los cuales sirven de medio de cultivo para el crecimiento de las levaduras S. cerevisiae y C. utilis, no txicas para los animales. La C. utilis super a la S. cerevisiae en la produccin de biomasa (protena unicelular) en un 48 %, para la misma concentracin de azcares reductores, provenientes del hidrolizado cido concentrado de bagacillo de caa de azcar. El anlisis estadstico indic que la C. utilis es la mejor levadura a usar en este bioproceso. El elevado contenido de lisina y treonina, as como un contenido balanceado de aminocidos, sugiere un uso potencial de los concentrados proteicos producidos como complementos de dietas de cereales, ya que stos son deficientes en estos aminocidos.