Taq polimerasa recombinante para aplicaciones de Diagnstico Molecular Diagn g

Marcelo Garcs Cea Gerente MR PROT

Bioqumico, U. de Concepcin Dr ( ) en Ciencias, Ingeniera Gentica Vegetal U. d Talca (c) l de l Dr (c) en Ciencias, Biologa Celular y Molecular U. Bordeaux 1

Suractivo, 7 de octubre 2008

Taq polimerasa Reaccin de la polimerasa en cadena: PCR Aplicaciones Ejemplo de aplicacin

Taq ADN polimerasa q Np

Enzima E i que multiplica el ADN l i li l ADN, proveniente de Thermophilus aquaticus Permite multiplicar una regin de ADN millones de veces, por el proceso de la reaccin de la polimerasa en cadena (PCR) Por la invencin del PCR se otorgo el premio Nobel de Qumica 1993 a Kary Mullis M lli y USD 10.000 por ceder derechos 10 000 d d h de patente a Cetus Corp.

Patentes
Cetus Corporation vendi la patente a Roche Molecular Systems en USD 300 millones. A partir del 28 de marzo de 2005, vencieron en EEUU las patentes que protegan este proceso, abriendo el mercado a empresas productoras d l enzima d d de la i En Chile l E Chil el mercado d l T polimerasa l h d de la Taq li lo hemos estimado en 500 millones de pesos/ ao. Nuestra meta es ocupar mas de el 10% del mercado en 12 meses. meses

Produccin de ADN Taq polimerasa recombinante

PURIFICACION

Control d lid d C ntr l de calidad

PCR Reaccin de la polimerasa en cadena

1. Denaturacin 95C 15 seg 1 D t i 95C,

2. Alineamiento 55C, 30 seg

35 CICLOS

3. Extensin 72C, 90 seg

: Taq polimerasa ca antidad ciclos

1 2 4 8

20 ciclos 35 ciclos 524.288 1.71X1010

Mtodo

Extraccin de ADN

Amplificacin PCR

Visualizacin de resultados

costos $758

$91

$50

Aplicaciones p
Las principales Aplicaciones del Diagnstico Molecular son:
Medicina Identificacin de bacterias, virus patgenos Evaluacin del riesgo cancergeno BRCA1-BRCA2 Evaluacin de riesgo cardiovascular Evaluacin mutaciones frmaco genticas hereditarias (intolerancia a frmacos) (i t l i f ) Diagnstico de enfermedades hereditarias Alimentaria Deteccin patgenos Deteccin de transgnicos Certificacin molecular Veterinaria Deteccin de patgenos zoonticos

PCR para diagnostico

TOMA DE MUESTRA

PCR DIAGNOSTICO SIGNOS C SG S CLINICOS Y C S OTROS EXAMENES

Habilitacin de un Laboratorio de Diagnstico M l l para Vi Di i Molecular, Virus Papiloma Humano (VPH) de Alto Riesgo
Dr (c) Marcelo Garcs Cea Gerente MR Prot, Reactivos Moleculares 1er piso Arco de Medicina Universidad de Concepcin. Concepcin www.mrprot.com

Presentacin

Importancia del Virus Papiloma Humano Imp rt n i d l Vir P pil m H m n Recomendaciones Internacionales sobre tipificacin de VPH Mtodos Moleculares de Diagnstico Nuestra Empresa Estudio de Costos

El C Cancer d C ll U i (CCU) de Cuello Uterino

Es la segunda neoplasia maligna mas frecuente en la poblacin femenina a nivel mundial f i i l di l En Chile se estima una tasa de mortalidad de 16,7 x 100.000 en mujeres mayores de 15 aos

En la IX Regin (Servicio Araucana Sur) el CCU corresponde a 68% de los canceres ginecolgicos y constituye la tercera causa de muerte, con una tasa de mortalidad de 9,46 x 100.000 en el ao 2000 ,

Neoplasias Cervicales Intraepiteliales (NC ) (NCI)

LBG: Lesiones de bajo grado LAG: Lesiones de alto grado El virus del papiloma humano (VPH) es considerado uno de los patgenos mas comunes transmitidos sexualmente Principal agente causal de la neoplasias p g p cervicales intraepiteliales (NCI) y el CCU

Virus del papiloma h Vi d l il humano (VPH)

Genotipos virales de alto riesgo VPH 16, 18, 45 y 56 detectados en lesiones de Alto riesgo y carcinomas Genotipos virales de riesgo intermedio VPH 31, 33, 35 , 51 y 52 asociados a neoplasias cervicales intraepiteliales En la actualidad, se ha observado que la asociacin cancer VPH es igualmente poderosa en ambos genotipos, por lo tanto deben ser considerados como oncognicos. oncognicos

Virus del papiloma humano ( p p (VPH) )

En la mayora de los casos, las infecciones por VPH se encuentran en su fase latente, por lo que es difcil detectarlas por exmenes citolgicos, hi d l i l i hispatologicos l i o por tcnicas inmunohistoquimicas. Mtodos moleculares de deteccin son la tcnica utilizada p para su diagnostico g

Recomendaciones Internacionales
En septiembre 2006, en Bethesda, MD, EEUU, se reuni un 2006 Bethesda MD EEUU grupo de 146 expertos representando 29 organizaciones y sociedades cientificas elaborando la guia Consensus guidelines for managing women with abnormal cervical cancer screening test(www.AJOG.org) S c Se recomend el uso del diagnostico por ADN de HPV d s d d g s c p Nd V complementario a citologa cervical para mujeres de 30 aos y mayores

Porque para mayores de 30 aos?

Aunque la infeccin con HPV es muy comn en pacientes menores de 30 aos, las infecciones no se mantienen activas por mucho tiempo, ya que su sistema inmune es mas activo. El Cncer cervical es muy raro en mujeres jvenes. y j j Al aumentar la edad, las infecciones con HPV son menos comunes y las que existen tienen posibilidades de ser persistentes, con mayores probabilidades de causar cncer cervical Se ha demostrado que tipificacin molecular de HPV cada 5 aos , junto con el PAP despus de los 35 aos, disminuye en un 50% las posibilidades de desarrollar cancer

Experiencias Internacionales
Estudios de Screening en EEUU y Europa
(Cuzick et al, Int J Cancer 2006;119:1095) (ACOG practice bulletin.Obstet Gynecol 2005;105:905)

exmenes citolgicos + tipificacin de HPV ambos exmenes combinados tienen un valor de prediccin de negativos de 99-100% 99-

GES

GES Chile

Su principal herramienta es la extender la cobertura del examen PAP la tipificacin de VPH de alto se menciona en la g sin abordar su Habilitacin p gua

Examen molecular de diagnostico de VPH por la tcnica de la PCR

Toma de muestra Extraccin de ADN Amplificacin ADN Visualizacin resultado Tiempo total anlisis: 4 horas Resultado: Portadora VPH AR + o -

Toma de muestra
El examen puede ser realizado a partir de: Biopsia Hisopado genital Orina conservar a 4C 4

Extraccin de ADN

Amplificacin de ADN por PCR

Equipo Fabricado en Alemania

Amplificacin de ADN por PCR

Visualizacin de la muestra
Equipo Fabricado en EEUU Cmara que incluye fuente de poder q p Gel de pequeo tamao que reduce costos de agarosa y buffer

Empresa d Bi l Molecular A li d E de Biologa M l l Aplicada

Red de proveedores nacionales e internacionales Mejores precios del mercado nacional

Herramientas biotecnolgicas propias Amplia experiencia tcnica Inters en desarrollo regional

Laboratorios Departamento de Microbiologa Facultad de Ciencias Biolgicas Universidad de Concepcin info@mrprot.com 0909-7902067

Recursos humanos especializados

Marcelo Garcs Cea M l G C Bioqumico Dr. en Biologa Celular y Molecular Universidad Bordeaux1 Amplia experiencia experimental 3 aos experiencia en el departamento de Cardiologia Molecular de la Universidad de Alabama en Birmingham, Al EEUU Birmingham 2 aos en el equipo de gentica del Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INRA). Burdeos, Francia. Experiencia en Administracin de Laboratorios: Puesta en marcha de laboratorio de secuenciacin de ADN, Depto de Botnica. Universidad de , p Concepcion (2000)

Anlisis de costos- Equipos d costos- q p

Articulo Termociclador Entrenamiento y gastos operativos p Agarosa, Mw marker Camara Embitec Balanza Centrifuga C13 Micropipetas Precision SIST CAPTURA DIGITAL COSTO $2,005,882 $ $600,000 , $210,084 $362,250 $257,250 $593,250 $222,600 $2,800,000

$ $6.955.518

setset-up laboratorio

$6.955.518 +$1.321.548 IVA= $8.277.066

Anlisis de costos Reactivos (160 muestras)

Kit extraccin ADN (USA) $113.700 2 Kit deteccin Human Papilloma Virus high risk (Alemania)(160+20+20) $720.000 tubos / soluciones $30.000 $863.700 /160 muestras

$5.398 por muestra

$25.000 - $5400 = $19.600 $19.600 x 355= $6.958.000

http://icbm.cl/

Beneficios de Habilitacin del Laboratorio de Diagnstico Molecular

Diagn Diagn ti de Di stico d HPV en portadoras que no muestran signos citolgicos t d t i it l i evidentes, con el virus en estado de latencia. Mediante un anlisis de orina se puede diagnosticar la presencia de HPV. Maximizar M i i recursos , concentrndose en pacientes portadoras de HPV de alto t d i t t d d d lt riesgo para efectuar seguimiento preventivo de CCU Llegar a un 99-100% de prediccin de casos negativos 99El costo d l anlisis moleculares h di i id t de los li i l l r ha disminuido Existe personal capacitado para efectuar el diagnostico El b f l beneficio social j l justifica l implementacin d l d f la implementaci del diagnstico molecular, l diagn l l ya que puede ayudar a los profesionales de la salud en el diagnstico diagn precoz, seguimiento y tratamiento de CCU.

Lneas de Desarrollo Implementacin de Laboratorios de Diagnstico molecular Elaboracin de kits para distintas aplicaciones Formulacin de Taq polimerasa liofilizada Formulacin de Taq polimerasa para PCR en tiempo real

www.mrprot.com info@mrprot.com f celular (09) 7902 5067