PRACTICA DE LABORATORIO 7 COPROCULTIVO El paciente afectado de diarrea emite heces líquidas o blandas, mucosas o hemorrágicas.

La diarrea puede ser aguda o crónica, con o sin fiebre. Se debe recordar que no todos los episodios diarreicos tienen una etiología infecciosa y que todas las diarreas infecciosas no se deben a la presencia de bacterias. En esta práctica solamente nos enfocaremos a las diarreas de origen infeccioso. El objetivo principal consiste en la búsqueda de microorganismos patógenos responsables de diarrea y para esto el coprocultivo intenta aislar del seno de una flora compleja, un número limitado de especies patógenas. El coprocultivo se practica sobre heces líquidas, blandas, mucosas o hemorrágicas o bajo indicaciones muy precisas en heces sólidas. En medio hospitalario, se puede investigar en las heces, bacterias de infecciones nosocomiales (i.e P.aeruginosa en el recién nacido, una cepa con una resistencia particular a un antibiótico (i.e Enterococos resistentes a la vancomicina o una enterobacteria productora de una betalactamasa de espectro extendido). En el caso habitual y en ausencia de criterios específicos de orientación se buscará sistemáticamente: Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp., adicionalmente sembraremos un medio no inhibidor para la búsqueda de bacterias de las familias Vibrionaceae y Pseudomonadaceae (oxidasa positivas) y un medio para valorar dismicrobismo de la flora fecal (puresa o predominancia del cultivo) MATERIALES 1 Muestras de heces fecales líquidas o blandas 2 Una caja de agar por grupo de los siguientes medio: - Agar MacConkey - Agar Hektoen - Gelosa alcalina - 1 tubo con Mueller Kauffmann (puede ser reemplazado por caldo selenito, tetrationato o medio Rappaport) 3 Placas portaobjetos (3 por grupo) 4 Placas cubreobjetos (2 por grupo) 5 Hisopos 6 Pipeta Pasteur 7 Asa redonda para estriado 8 Solución salina (1 tubo con 10 mL)

PROCEDIMIENTO Primer día 1 Abrir el recipiente conteniendo la muestra y seleccionar el sitio de donde se tomará una porción (presencia de moco o sangre) 2 Con el hisopo tomar una cantidad del tamaño de un fréjol y colocarla en el tubo que contiene la solución salina (dilución aproximada 1/10)

Realizar una coloración gram y un Ziehl modificado para visualización de coccídeos.3 4 5 6 7 Con otro hisopo tomar otra porción de muestra y realizar dos frotis finos y dejar secar al ambiente. LIA. Urea) Tercer día 1 Retirar el segundo Hektoen sembrado a partir del medio de enriquecimiento y buscar colonias lactosa negativas (sospechosa de Salmonella spp. Kligler. es un dismicrobismo que deberá ser reportado) 5 Tomar una gota del tercio superior del caldo de enriquecimiento y sembrar otro agar Hektoen. incubar a 35ºC durante 18 a 24h Con la suspensión de heces en solución salina sembrar los medios Hektoen. MacConkey y Gelosa alcalina (una gota en la superficie y estriar). MRVP.) 2 Reportar los resultados . La tercera placa portaobjetos será utilizada para realizar un coproparasitario con suspensiones en solución salina y lugol Colocar en el medio de enriquecimiento previo a la siembra cuatro gotas de solución Yodo-yodurada (oxidación del tiosulfato en tetrationato para inhibición de crecimiento de coliformes). Incubar a 35ºC durante 18 a 24h Segundo día 1 Retirar las cajas y el tubo de enriquecimiento del incubador 2 Buscar en el medio Hektoen colonias lactosa negativas (sospecha de Salmonella o Shigella) 3 Hacer la prueba de oxidasa en varias colonias del medio gelosa alcalina en búsqueda de bacterias sospechosa de pertenecer a las familias Vibrionaceae o Pseudomonadaceae. Incubar a 35ºC durante 18 a 24h 6 Sobre las colonias sospechosas se deberá realizar una galería de pruebas bioquímicas (Citrato. SIM. 4 Observar el agar MacConkey y anotar las características de las colonias (si evidencia presencia pura de un solo tipo de colonias. Tomar una porción de heces con el hisopo y sembrar el medio de enriquecimiento para Salmonella (dilución aproximada 1/10).

IMÁGENES Hektoen con colonias lactosa positivas (color salmón) Hektoen con colonias lactosa negativas (color verde con o sin punto negro) Detalle de las colonias lactora negativas productoras de H2S (punto negro) .

- . Dejar secar la preparación al ambiente. Lavar con agua rápidamente.11.6. Fijar 5’ con alcohol metílico al 95%.10. filtrar y fechar el frasco obscuro. Limpiar con agua.8. La lectura se debe realizar con el objetivo 40x colocando sobre el frotis una gota de aceite de inmersión en extensión.PRACTICA DE LABORATORIO COLORACION DE ZIEHL NEELSEN MODIFICADA (CRYPTOSPORIDIUM – CICLOSPORA) REACTIVOS: Solución A: Solución B: 15g de Fucsina básica en 100 ml de etanol 95º.Realizar un frotis fino de heces frescas bien extendidas sobre la lámina e identificarla. descartar el excedente y secar al medio ambiente.- 4. Acido sulfúrico al 2% Azul de metileno al 5% TECNICA: 1. Dejar unos días.3. 2.9.5. Limpiar con agua. Disolver en un mortero Agua fenicada a 5% La Fucsina de Ziehl: 100 ml de solución A + 900 ml de solución B. Confirmar a 100x. Secar sobre la platina o al ambiente. Contracoloración con Azul de Metileno al 5% durante 1 minuto. Colorear la lámina con Fucsina de Ziehl durante 30’.- 12. Diferenciar en el Acido Sulfúrico al 2% durante 30” segundos.7.

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