INSTITUTO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD Dr. Nestor Morales Villazn I.N.L.A.S.A.

PROCEDIMIENTOS TCNICOS DE LA RED NACIONAL DE TOXOPLASMOSIS Niveles I, II y III

La Paz, Bolivia 2003 AUTORES: Dr. Sergio MOLLINEDO Dr. Jos SANTALLA Tec. Sup. Pamela DURAN

CONTENIDO

I. ESTRUCTURA Y REGLAMENTO DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE DIAGNOSTICO DE LA TOXOPLASMOSIS DEFINICIN ESTRUCTURA LABORATORIO NIVEL I: LABORATORIO NIVEL II LABORATORIO NIVEL III II. PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS PATRON (POPs) OBTENCIN DE MUESTRA Obtencin de sangre por puncin venosa Obtencin de sangre por puncin capilar Uso de anticoagulantes REGISTRO DE MUESTRAS CRITERIOS DE RECHAZOS DE MUESTRAS CENTRIFUGACIN DE MUESTRAS TRANSPORTE DE MUESTRAS CONSERVACIN DE LA MUESTRA (suero o plasma) DESINFECCIN DE MATERIAL CONTAMINADO ENTREGA DE INFORME DE RESULTADOS CONDUCTA ANTE UN DIAGNSTICO BIOLGICO DE TOXOPLASMOSIS

III. PROCEDIEMIENTOS TECNICOS AGLUTINACIN DIRECTA 2

HEMAGLUTINACIN INDIRECTA (HAI) Fundamentos ENZIMOINMUNOENSAYO CLSICO DE TOXOPLASMOSIS (Ig. G) Principios y fundamentos Material, reactivos y equipos Calibracin y control Procesamiento Lectura e interpretacin Limitaciones del mtodo Reporte y liberacin de resultados ENZIMOINMUNOENSAYO CLSICO DE TOXOPLASMOSIS (Ig. M) Principios y fundamentos Material, reactivos y equipos Calibracin y control Procesamiento Lectura e interpretacin Limitaciones del mtodo Reporte y liberacin de resultados INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Pricipios y fundamento Material, reactivos y equipos Control Procesamiento Lectura e interpretacin Fuentes de error Reporte y liberacin de resultados IV. BIBLIOGRAFA GLOSARIO ANEXOS

I. ESTRUCTURA Y REGLAMENTO DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE DIAGNOSTICO DE TOXOPLASMOSIS:

DEFINICIN:
La Red Nacional de Laboratorios de Diagnostico de la Toxoplasmosis es el conjunto de laboratorios que efectan diagnostico de laboratorio de la esta patologa, estableciendo en todos los servicios Departamentales de Salud del Pas, que ejecutan tcnicas y procedimientos normalizados dirigidos a apoyar el diagnostico y control de la Toxoplasmosis en todos los niveles de atencin en salud.

ESTRUCTURA:
La estructura orgnica de la Red de Laboratorios de diagnstico de la Toxoplasmosis para su funcionamiento esta organizada en los siguientes niveles: Laboratorio Nacional de Referencia establecido en el Instituto Nacional de Laboratorios de Salud INLASA, mediante resolucin Ministerial N 175/2003. Laboratorios Departamentales ubicados en cada capital de Departamento Laboratorios Municipales Laboratorios de Centros de Salud y Puestos de Recoleccin de Muestra

Estos se encuentran clasificados en niveles de acuerdo a la complejidad, equipamiento, material y disponibilidad de recursos humanos. Laboratorios de Nivel Laboratorios de Nivel II Laboratorios de Nivel III

LABORATORIOS DE NIVEL I.
Son aquellos servicios que realizan pruebas bsicas serolgicas de tamizaje epidemiolgico, cuentan con un equipo mnimo, ambientes, material; su actividad esta en funcin a la disponibilidad de recursos humanos. EFECTUAN: 1. Funciones Tcnicas: Toma, envi y desecho de muestras Registro de la muestra Obtencin del suero o plasma Tcnica de Aglutinacin Directa (AD) Tcnica de Hemoaglutinacin Indirecta (HAI) Informacin a la comunidad Envi de muestras a nivel superior de la red. Funciones administrativas: Envi de informes al Laboratorio Departamental. Envi de sueros problema para confirmacin diagnostica a nivel superior de la Red. Envi de sueros para el control de calidad Solicitud y requerimientos

2.

DEPENDENCIA Y OBLIGACIONES: Administrativamente dependen del Servicio Departamental de Salud SEDES donde estn establecidos. Tcnicamente dependen del Laboratorio Departamental y de la Red Nacional, en ambos sistemas deben trabajar en estrecha coordinacin, para cumplir sus funciones en forma ptima. OBLIGACIONES: Brindar atencin permanente al paciente de su rea. Cumplir las disposiciones tcnicas que rigen los Laboratorios de Nivel I tanto para las medidas de Bioseguridad, procedimientos tcnicos y administrativos garantizando la buena calidad de ejecucin de estos. Cumplir con el envi de sueros problema para confirmar el diagnstico Cumplir con el envi de sueros positivos y negativos para el control de calidad

Enviar oportunamente la solicitud de requerimientos para el cumplimiento de sus funciones Participar en las actividades de reciclaje, capacitacin e informacin determinadas por el Laboratorio departamental o la Red nacional

PERSONAL: El laboratorio debe contar con personal calificado, dependiente de cada DILOS o SEDES. MATERIAL Y REACTIVOS NECESARIO PARA SU FUNCIONAMIENTO Kit Diagnostico Aglutinacin Directa Kit Diagnostico Hemoaglutinacin Indirecta Tubos de hemlisis Hipoclorito de Sodio al 0,5% (lavandina) Guardapolvo Guantes

LABORATORIOS DE NIVEL II
Son aquellos servicios que cuentan con capacidad instalada, ambientes y reas especificas para realizar pruebas de deteccin de ttulos de anticuerpos especficos y as detectar la etapa en la que se encuentra la enfermedad. EFECTUAN: 1. Funciones Tcnicas: Tcnica de Enzimo inmuno ensayo Toxoplasmosis para deteccin de Ig. M Tcnica de Enzimo inmuno ensayo Toxoplasmosis para deteccin de Ig. G Hemoaglutinacin semi cuantitativa 2. Funciones Administrativas: Capacitacin Supervisin Directa e Indirecta Evaluacin Coordinacin con e Laboratorio Nacional de Referencia Envi de Informacin al Laboratorio Nacional de Referencia. Envi de sueros problema para confirmacin diagnostica a nivel superior de la Red. Envo de sueros para el control de calidad Programar los requerimientos e insumos en su regin.

DEPENDENCIA Y OBLIGACIONES: Los laboratorios del Nivel II administrativamente dependen del Servicio Departamental de Salud SEDES donde estn establecidos. Tcnicamente dependen del Laboratorio Nacional de referencia, en ambos sistemas deben trabajar en estrecha coordinacin, para cumplir sus funciones en forma ptima. OBLIGACIONES: Cumplir las disposiciones del presente reglamente tanto en el mbito tcnico como administrativo. Ejecutar las tcnicas y procedimientos del laboratorio de acuerdo a las normas de aplicacin establecidas por el Laboratorio de Referencia Nacional de Toxoplasmosis. Cumplir con las regulaciones propias de su nivel respecto al control de calidad.

 PERSONAL:

Confirmar el diagnstico y titulacin de los sueros problemas enviados por laboratorios perifricos. Cumplir con el envi de sueros positivos y negativos para el control de calidad al Nivel III

Debe contar con personal calificado, profesionales bioqumicos o Tcnicos en Laboratorio Clnico dependientes de la SEDES. MATERIAL Y EQUIPOS: Debe contar con el equipo necesario para mencionadas. Equipo: Material: Lector de ELISA Incubadora Kit Diagnostico Enzimo inmunoensayo toxoplasmosis Ig. M Kit Diagnostico Enzimoinmunoensayo toxoplasmosis Ig. G Kit Diagnostico Hemaglutinacin Inrecta Semicuantitativo Tubos de hemolisis Tips Micropipetas Hipoclorito de Sodio al 0,5% (lavandina) Guardapolvo Guantes ejecutar las pruebas ya

LABORATORIOS DE NIVEL III:

Constituido por el Laboratorio de Nacional de Referencia que emite normas tcnicas y administrativas, realiza tcnicas de mayor complejidad. Cumple las funciones de Direccin de la Red Nacional de Laboratorios de Diagnostico de Toxoplasmosis, ejecutando funciones de normalizacin tcnica y administrativa, adems de investigacin bsica y epidemiologa. FUNCIONES: Es el laboratorio que tiene la capacidad de realizar la funciones tcnicas siguientes: 1. Funciones Tcnicas: Inmunofluorescencia Indirecta ISAGA Ig. M PCR INMUNOBLOT 2. Funciones Administrativas: Organizacin y Direccin de la Red Capacitacin Supervisin Evaluacin Programacin de actividades Programacin de insumos y materiales Recoleccin de informacin Anlisis de datos Envi de resultados de pruebas complejas a los laboratorios departamentales.

DEPENDENCIA Y OBLIGACIONES: Depende directamente del Instituto Nacional de Laboratorios de Salud y efecta actividades coordinando en forma estrecha con las SEDES a nivel nacional. OBLIGACIONES: Implementar y ejecutar las tcnicas y procedimientos, de mayor complejidad en forma ptima. Elaborar de normas tcnicas

 PERSONAL:

Elaborar normas administrativas Ejecutar sistemas de control de calidad interno y externo. Supervisar directa e indirecta de Laboratorios dependientes de la red. Disear programas de capacitacin Disear sistemas de Evaluacin Nacional Elaborar informes escritos de control de calidad nacionales y departamentales. Programar actividades nacionales e internacionales

Debe contar con personal especializado, profesionales Mdicos, Bioqumicos, Bilogos y Tcnicos superiores en Laboratorio Clnico dependientes del MSyD. MATERIAL Y EQUIPOS: Debe contar con el equipo necesario para mencionadas. Equipo: Material: Guantes Secador de cabello Portaobjetos especiales IFI Cubreobjetos 24 x 48mm ejecutar las pruebas ya

Microscopio de inmunofluorescencia. Campana de flujo laminar Centrifugadoras Estufas de cultivo Heladeras Aparato de hibridacin Balanza de precisin Vortex Agitador magntico Container de Nitrgeno lquido Campana de extraccin Cmara Hmeda

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Jarras Koplin Vasos de precipitado Frasco gotero Papel filtro Micropipetas Tips Tubos de hemlisis Gradillas

Reactivos:

Solucin Buffer fosfato salina Ph 7,2 (PBS) Antgeno Toxoplasma gondii marcada con

Anti gamma globulina Humana isotiocianato de fluorescenina o conjugado. Azul de Evans Solucin de montaje. Kit ISAGA Kit PCR

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II. PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS PATRON

(POPs)

OBTENCIN DE MUESTRA
La sangre puede considerarse como el liquido biolgico en el que se pueden realizar un numero mayor de anlisis cuantitativos. Antes de realizar cualquier anlisis debe asegurarse la adecuada calidad de la muestra. El profesional responsable debe instruir detalladamente utilizando un lenguaje claro y adecuado al paciente sobre los cuidados que debe seguir antes de la obtencin de muestra. Para la adecuada obtencin de un volumen de sangre destinado a realizar la prueba serolgica de Toxoplasmosis, se utilizaran: puncin venosa (en adultos) puncin capilar (pacientes peditricos, con quemaduras severas, obesos, con tendencias tromboticas, geritricos, etc).

Las muestras deben ser obtenidas con medidas de bioseguridad adecuadas: uso de mandil de proteccin, guantes, barbijo, ....... Debe existir estricta relacin de identidad entre el etiquetado de la muestra, el formulario de solicitud del medico que adems debe llevar datos del diagnostico presuntivo y orientadores de la patologa que sufre el paciente. Luego de la toma de muestra, el material utilizado debe ser desechado en recipientes adecuados y con un rotulo de material peligroso.

OBTENCIN DE SANGRE POR PUNCIN VENOSA

SITIO DE PUNCIN: vena ceflica o mediana cubital, femoral, yugular, venas del dorso de la mano.

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ANTISPTICO: Alcohol al 70% TORNIQUETE: Aplicar por el lapso de un minuto y liberarlo despus de la puncin. AGUJAS Y JERINGAS DESECHABLES: Estriles, de volumen entre 3 a 5 ml. Con agujas N 21 a 23G , en nios se recomienda aguja mariposa N 21 a 23G.

Una vez extrada la sangre debe colocarse desde la jeringa, sacando previamente la aguja para evitar hemlisis y formacin de espuma, a un tubo limpio y seco rotulado con el nombre del paciente. Los tubos pueden tener o no anticoagulante, luego se deben tapar y enviar al laboratorio lo mas antes posible (dentro de 45 minutos como mximo).

OBTENCIN DE SANGRE POR PUNCIN CAPILAR

SITIO DE PUNCIN: Existen diversas alternativas: - Dedo anular en su superficie palmar en el ultimo segmento (yema del dedo). - Lbulo de la oreja. - Superficie plantar media o lateral del taln. - Dedo grande del pie en su superficie plantar en el ltimo segmento (yema del dedo). PROCEDIMIENTOS PARA CALENTAR LA ZONA DE PUNCIN: Cubrir el sitio con una toalla hmeda o bien utilizar una bolsa de agua, a una temperatura no superior de 42C por un mnimo de tres minutos ANTISPTICO: Alcohol al 70% ENVASES: Capilares con o sin heparina. RECOLECCIN: Eliminar las dos primeras gotas con algodn seco, recoger la sangre por capilaridad presionando suavemente alrededor del sitio de puncin. Sellar los capilares en un extremo con plastilina.

Nota: por este tipo de puncin no siempre se obtiene una muestra significativa.

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Recomendaciones: En el informe indicar el tipo de puncin realizada. No se debe usar agujas para jeringa.

USO DE ANTICOAGULANTES
Se puede realizar la tcnica con suero o plasma, por lo que se puede o no utilizar anticoagulante.

REGISTRO DE MUESTRAS
Debe existir un libro de registros en los que se inscriba los datos del paciente como: Nombre completo Edad Sexo Procedencia Antecedentes clnicos de la enfermedad: Antecedentes gineco obsttricos (Menarca, gesta, para, abortos, FUM) Tipo de prueba a realizarse

CRITERIOS DE RECHAZO DE MUESTRAS

Bajo las siguientes condiciones las muestras no deben ser aceptadas para su anlisis: Identificacin inadecuada o falta de identificacin Muestras hemolizadas Transporte inadecuado (ejemplo: tapones mojados, tubos rotos, no refrigerados, muestras no conservadas) Ordenes de examen que no contengan todos los datos: nombre, edad, sexo, procedencia y antecedentes clnicos de la enfermedad, en casos de mujeres embarazadas tiempo de gestacin y antecedentes gineco obsttricos.

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CENTRIFUGACIN DE MUESTRAS
No centrifugar las muestras de sangre hasta que coagulen adecuadamente. Nunca desprender el coagulo adherido con aplicador o similar, ya que es una potencial fuente de hemlisis. Centrifugar las muestra lo mas rpidamente posible.

TRANSPORTE DE MUESTRA
Tiempo: Se debe hacer llegar la muestra al Laboratorio tan pronto como sea posible, mximo dentro de los 45 minutos, evitar temperatura ambiente de 30C o mas. Identificar las muestras infecciosas: hepatitis (+), VIH (+) con etiqueta especial de tal manera que las diferencie de las otras. Las muestras deben ser transportada en forma de suero o plasma y no as como sangre entera.

CONSERVACIN DE LA MUESTRA (SUERO O PLASMA)

Si la muestra ser procesada dentro de la primera semana de haber sido obtenida, se conservar a una temperatura de 2 a 8C. Si la muestra se procesar pasada la primera semana de haber sido obtenida se conservar a una temperatura de 10C. Es importante evitar ciclos de descongelamiento repetidos.

DESINFECCIN DE MATERIAL CONTAMINADO

Se realizar la desinfeccin del material empleado y superficies (mesones) con una solucin de hipoclorito de sodio al 0,5% (una parte de lavandina que contiene hipoclorito de sodio al 5% y 9 partes de agua ) o 1% (1 parte de lavandina que contiene hipoclorito de sodio al 5% y 4 partes de agua).

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ENTREGA DE INFORME DE RESULTADOS

Se debe establecer un protocolo (ver ejemplo en anexos) general entrega de resultados: Fecha de entrega Lugar y va de despacho (personal, correo ordinario, fax, etc) Establecer un libro de registro de la fecha de despacho, va, identificacin de la persona que lo retira. de

CONDUCTA ANTE TOXOPLASMOSIS:

UN

DIAGNSTICO

BIOLGICO

DE

Las situaciones clnicas en las cuales se realiza la exploracin de la respuesta humoral especfica (serodiagnstico) de Toxoplasmosis se pueden resumir en cuatro situaciones tipo: En la mujer embarazada en su control pre natal En producto de la gestacin En inmunocompetentes En inmunodeprimidos a) Embarazada en su control pre natal: La Ley N 2426 del Seguro Universal Materno Infantil (SUMI), implementa servicios complementarios de diagnstico de una serie de enfermedades parasitarias, una de ellas es la Toxoplasmosis, este examen complementario es incluido como parte de un plan de prevencin de la infeccin congnita y no del diagnstico de la enfermedad en la embarazada. El objetivo es el de identificar lo ms antes posible a las mujeres en riesgo (mujeres seronegativas), y en caso de detectar la positivodad de las reacciones serolgicas, contribuir a excluir una infeccin reciente. Los mtodos diagnsticos difieren del nivel de la red donde se realicen diferentes pruebas: 16

Nivel I: HAI, AD Nivel II: HAI, ELISA Nivel III: HAI; ELISA; ELISA inverso, ISAGA, PCR, INMUNOBLOT

Serologa no reactiva (negativa): El objetivo esta puesto en el descubrimiento de pacientes embarazadas sero negativas, en las cuales se tendr que evitar su primo infeccin y el riesgo probable de transmisin al feto, estas embarazadas entran a un plan preventivo de informacin (profilaxis de la enfermedad) y al seguimiento serolgico cada 8 a 12 semanas (repeticin de la serologa) hasta la finalizacin del embarazo; estas acciones tambin se realizan en otras gestaciones mientras la paciente sea susceptible a la infeccin. Serologa reactiva (positiva): Cuando la prueba de una paciente es sero positiva para Ig. G, es necesario dilucidar el estadio clnico de la infeccin, mediante la investigacin de la presencia de Ig. M (o tambin Ig. A), adems de la repeticin de la prueba a las 3 semanas; de no existir cambios en la tasa de Ig. G y de ser negativa la Ig. M (Ig. A) , se concluye que la paciente esta en estadio crnico de la enfermedad y no existe posibilidad de transmisin de la enfermedad al feto, por lo que nuevos exmenes son innecesarios. Seroconversin positiva: Si en estos exmenes aparece una sero conversin (la serologa previamente negativa de la paciente se vuelve positiva), el laboratorio deber determinar la presencia de Inmunoglobulina M se deber recomendar el inicio del tratamiento y la confirmacin de los resultados remitiendo a la paciente a un nivel superior en la red de laboratorios.

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b) En el producto de la gestacin: Si el diagnstico de infeccin materna se confirma lo ms importante es precisar si existe o no infeccin fetal; el riesgo de contaminacin fetal cuando la madre a tenido una seroconversin en su embarazo varia de 5 a 80% dependiendo de la fecha de contaminacin, por lo tanto toda primo infeccin de la embarazada debe hacernos proponer un diagnstico antenatal y si no se realiza este, deber realizarse un abanico de pruebas al nacimiento del nio, seguido de un control peridico serolgico que permita confirmar o desestimar el diagnstico de infeccin congnita. Para este efecto el Nivel I tendr que remitir el paciente a un nivel de mayor complejidad para que se realicen un abanico de pruebas que permitan emitir un diagnstico mediante: Diagnstico antenantal: amniocentesis Cordonocentesis

Diagnstico posnatal: sangre del nio para buscar IgM o IgA anti-Toxoplasma, por medio de ELISA, western blot o ELIFA. c) Diagnstico en Inmunocompetentes: Las adenopatias cervicales, a veces asociadas con fiebres fugaces en nios pueden hacernos pemnsar en una primo infeccin por Toxoplasma; la serologa permite confirmar el diagnstico. La Corioretinitis toxoplasmica puede ser observada por una reactivacin endgena de una infeccin congnita (nio o adulto joven), siendo raro observarla como primo infeccin, tambin en este tipo clnico se puede realizar pruebas con el humor acuoso.

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d) En el Inmunodeprimido: En este tipo de pacientes conviene identificar sobre todo a los sujetos en riesgo de reactivar una Toxoplasmosis importante. Se recomienda la utilizacin de tcnicas serolgicas las ms sensibles. DISPOSICIONES REGLAMENTARIAS 1) Todo Examen deber precisar el umbral de positividad del reactivo 2) El examen inicial o los posteriores de seguimiento, comprenden la utilizacin de por lo menos dos tcnicas diferentes. 3) El estudio sistemtico de la Ig G e IgM es obligatorio; en el Nivel I la deteccin de Inmunoglobulina G debe ser obligatoria. 4) Un examen de control debe estar previsto cuando se encuentren tasas lmites o de sospecha de infeccin reciente. 5) Al final de cada examen el laboratorio debe aportar una conclusin al mdico solicitante sobre la presencia o ausencia de anticuerpos antitoxoplasma, la ancianidad probable en caso de positividad 6) El laboratorio deber eventualmente proponer al mdico solicitante las modalidades de seguimiento serolgico. 7) En caso de un resultado que sea lmite (se aproxime al umbral), una nueva muestra de control se aconseja a los 21 das (3 semanas). 8) En caso de sospecha de infeccin reciente (presencia de Ig M), un seguimiento serolgico es recomendado, utilizando tcnicas complementarias que permitan estimar la fecha de contagio particularmente en la mujer anteriormente adquirida, una quimioprofilaxis especfica es recomendada cuando existe una inmunodepresin

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embarazada.

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III. PROCEDIEMIENTOS TECNICOS

Durante una infeccin por Toxoplasma no existen sntomas especficos de esta infeccin por lo tanto la sospecha clnica requiere siempre la confirmacin por el laboratorio. El laboratorio juega, entonces, un papel crucial para determinar la etiologa en esta infeccin parasitaria. La estrategia diagnstica puede basarse en tcnicas serolgicas que midan anticuerpos especficos o tcnicas cualitativas y semi cuantitativas que establezcan perfiles inmunolgicos comparados. Estos perfiles inmunolgicos comparados permiten distinguir entre anticuerpos maternos y fetales o una neoproduccin. Cuando se sospecha un dficit inmunitario o una produccin dbil de anticuerpos, como en los casos de inmunosupresin o infeccin fetal se puede emprender la deteccin directa del parsito tanto en ratn como en cultivo celular o evidenciar su presencia por la amplificacin de un segmento del ADN del parsito. El diagnstico se puede basar en pruebas serolgicas que evidencian la presencia de inmunoglobulinas especficas IgG, IgM, IgA o IgE. Es importante conocer la cintica de aparicin de los anticuerpos y el tiempo de duracin de cada isotipo de inmunoglobulinas para realizar la interpretacin de las pruebas serolgicas en el inicio de la infeccin. Las infecciones clnicamente importantes pertenecen (salvo en el caso de los inmunosuprimidos) a infecciones recientes. La cintica va a depender de la tcnica de deteccin de anticuerpos que se utilice y los mtodos de fabricacin del antgeno. El patrn que se menciona a continuacin se refiere a lo que se halla por Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) o las tcnicas inmunoenzimticas (ELISA) o en la Aglutinacin directa (AD) en el caso de la IgG. La IgG aparece 1 a 3 semanas despus de adquirida la infeccin y alcanza su mximo nivel 3 a 6 meses despus para luego descender y quedar a bajos niveles por el resto de la vida. La elevacin de IgG especficas para Toxoplasma en muestras tomadas con un intervalo de cuatro semanas puede ser utilizada como criterio diagnstico pero tiene el inconveniente de que retarda el diagnstico. La deteccin de IgM fue propuesta como marcador de infeccin activa. La tcnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI-IgM) no tiene una buena sensibilidad ya que la deteccin puede ser bloqueada por la presencia de IgG en altos niveles o factor reumatoideo, slo entre 10-25 % de las toxoplasmosis agudas son positivas por esta tcnica. La mayor utilidad del test especfico para IgM es para determinar si una mujer embarazada no se ha infectado recientemente. Una prueba

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negativa para IgM en una mujer embarazada descarta virtualmente una infeccin reciente. La utilizacin del PCR en el diagnstico de la toxoplasmosis aporta un progreso indiscutible en aquellos casos donde los exmenes clnicos y serolgicos son inoperantes, as como una mayor rapidez para realizar el diagnstico, dando resultados disponibles en 24 horas.

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AGLUTINACIN DIRECTA
Principio: Es una tcnica simple que posibilita la deteccin cualitativa anticuerpos en suero o plasma. de

Los anticuerpos tanto IgG como IgM se detectan mediante una reaccin inmunolgica de aglutinacin, utilizando el reactivo ltex que posee anti IgG y anti IgM absorbidas sobre las partculas de ltex. Mezclando de forma directa la muestra con el reactivo ltex la presencia de anticuerpos tanto IgG como IgM, dan lugar a la aglutinacin de las partculas de ltex que se visualiza macroscpicamente. La cantidad de anticuerpos aglutinada con antgeno creciente es lineal al principio y en un momento alcanza un pico (punto de equivalencia). Frente a un exceso de antgeno la cantidad de anticuerpo aglutinado por lo general disminuye dado que ya no se forman los enlaces cruzados adecuados para la formacin de grandes complejos.

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HEMAGLUTINACIN INDIRECTA
Fundamento: El reactivo consiste en una suspensin de hemates estabilizados, sensibilizados con antgeno purificado obtenido a partir Toxoplasma gondii cultivado en exudado peritoneal de ratn. Estos hemates reaccionan con los anticuerpos especficos presentes en el suero del paciente, formando una malla homognea en la policubeta (caso positivo). Si los anticuerpos especficos estn ausentes, los hemates sedimentan formando un botn ntido en la poli cubeta (caso negativo). El equipo para realizar Hemoaglutinacion indirecta (HAI), proporciona el material para la rpida determinacin de anticuerpos anti-Toxoplasma gondii. La Aglutinacin emplea un antgeno que consiste en trofozoitos enteros formalinizados o fijados con acetona. La muestra de suero debe ser previamente tratada para eliminar las IgM. La lectura de los resultados da ttulos muy altos. La Hemaglutinacin indirecta emplea como soporte del antgeno hemates tratados con glutaraldehdo. El antgeno empleado es diferente segn la marca productora (de membrana o citoplsmicos). Esto hace que sea poco reproductible y no debe emplearse para el diagnstico de infeccin congnita ni para los casos de infeccin aguda. Esto es debido a que los anticuerpos que detecta se desarrollan ms lentamente. ELISA IgG es la metodologa ms empleada. Los resultados obtenidos con ella se correlacionan bien con los del resto de las pruebas. Otra posibilidad disponible es la medida de la AVIDEZ de los anticuerpos IgG. Se basa en la medida de la afinidad (avidez) de los anticuerpos por su antgeno. Durante la fase inicial de su produccin poseen una afinidad baja y a medida que transcurre el tiempo esta aumenta progresivamente. La sexta semana de la infeccin es el punto de inflexin en el cambio de la avidez. Con esta prueba se puede discriminar muy bien la infeccin reciente de la antigua, quizs mejor que con la determinacin de IgM. ELISA IgM es el mtodo ms frecuente para la deteccin de este tipo de

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anticuerpos. Su positividad define la infeccin aguda aunque en ocasiones, cuando su concentracin es baja, esto no es cierto. La versin ELISA con captura de cadena pesada es ms sensible y especfica ya que no tiene interferencias con el F.R. De igual diseo que el anterior es la prueba de ISAGA-IgM empleando como antgeno toxoplasmas enteros. Es muy sensible. Tcnica Biocientfica S.A. HI. : o Diluir el suero 1/32 empleando solucin diluyente. o Colocar 25 ul de esta dilucin en uno de los orificios de la placa de microtitulacin en V. o Adicionar 25 ul de antgeno Toxoplasmosis HI, previamente agitado. o Agitar muy bien la placa y dejar en reposo durante 2 horas a temperatura ambiente y en lugar libre de vibraciones. Interpretacin de resultados : La reaccin es considerada reactiva cuando forma una malla o red de bordes irregulares con 50 a 100% de aglutinacin. La reaccin es considerada negativa cuando los hemates se depositan en el fondo de la placa formando un botn de eritrocitos no aglutinados. Limitaciones del mtodo : La utilidad de este ensayo es el screening de anticuerpos anti Toxoplasma gondii en muestras de sangre. Los valores obtenidos con este ensayo deben ser tomados como una ayuda en el diagnstico y deben ser evaluados por el mdico considerando, adems, la historia clnica del paciente, los hallazgos fsicos y sintomatolgicos y otros procedimientos diagnsticos.

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ENZIMOINMUNOENSAYO CLSICO DE TOXOPLASMOSIS (IgG) I. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS

Estudios serolgicos indican que la inyeccin por Toxoplasma gondii, agente causante de la toxoplasmosis, esta ampliamente presente entre la poblacin. En adultos la infeccin suele cursar de forma asintomtica a pesar de los casos descritos sintomticos as como de evolucin fatal. En nios, la enfermedad puede afectar el sistema nervioso central y las vsceras. Tambin puede ocurrir la infeccin congnita causando malformaciones que pueden terminar con la muerte. Quit : SeraQuest, Estandarizado 02-02-03. La Paz, Enero de 2003 Los resultados son de ayuda en la valoracin del estado inmunolgico del paciente. El equipo Sera Quest Toxoplasma IgG esta indicado para la deteccin de anticuerpos del tipo IgG frente a Toxoplasma gondii. Los resultados se obtienen despus de una hora y media de incubacin. Los resultados son objetivos y expresados en valor de ndice o unidades internacionales (IU/ml) referenciadas a la preparacin del tercer Standard internacional de 1994 del suero anti-toxoplasma de la OMS. Las muestras diluidas se incuban en pocillos recubiertos de antgeno. Los anticuerpos anti-toxoplasma, si estn presentes, se fijan a los pocillos. Los componentes que no han reaccionado se eliminan mediante lavado, aadiendo e incubando a continuacin el conjugado (anticuerpos anti-IgG humana marcados con un enzima). Si la muestra contiene anticuerpos antitoxoplasma, el conjugado se fijar en los pocillos. El conjugado residual se elimina mediante lavado, aadiendo e incubando a continuacin el substrato. En presencia de la enzima, el substrato se transforma en un producto final de color amarillo el cual se lee fotomtricamente.

II.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS a. Material: Cuaderno de Registro

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gondii -

Guantes desechables Placas de tiras microelisa Precintos para placas Micropipeta automtica graduable de 4 a 200ul Micropipeta multicanal automtica Tips Tubos de ensayo Cronmetro Papel absorbente recubiertas con Ag de T.

Recipientes de desechos, biolgicamente peligrosos, para los materiales potencialmente contaminados. b. Reactivos Agua destilada o desionizada

Conjugado: Liofilizado de antigammaglobulinas G marcadas con HRP. Control Negativo: Suero humano, no reactivo a antitoxoplasma IgG. Calibrador 1: Suero humano. Fuertemente reactivo para anticuerpos anti-toxoplasma IgG. Calibrador 2: Suero humano. Moderedamente reactivo anti-toxoplasma IgG. Tampn fosfato concentrado Solucin TMB (tetrametilbencidina en cido ctrico) Solucin de perxido de urea cido sulfrico 1 mol/l para anlisis

c. Equipo - Lector de microplacas (espectrofotmetro para microplacas con filtro de 405nm) - Incubador (seco o humedecido) o bao mara a 37 2C. III. CALIBRACIN Y CONTROL a. Calibracin: Alternativamente, los resultados pueden calcularse a partir de una curva de calibracin a tres puntos: calibrador 1 (punto alto), calibrador 27

2 (punto medio) y blanco de reactivos (cero), usando un grfico punto a punto. b. Control: Los calibradores y controles deben incluirse en cada prueba. El valor de absorbancia del calibrador 1 debe ser al menos de 0.4 cuando se lee frente al blanco. El valor de absorbancia del blanco debe ser menor de 0.35. El control negativo debe presentar un valor inferior de 27 IU/ml y un ndice menor de 0.9. El control positivo debe presentar un valor de ndice dentro del rango indicado en el vial.

Si no se cumple uno de estos criterios, se deber repetir la prueba.

IV.

PROCEDIMIENTO a. Preparacin de reactivos: Atemperar todos los reactivos y muestras antes de usar. Devolverlas pronto al frigorfico despus de usar. 1. Preparar la dilucin 1:50 de las muestras, calibradores y controles. Por ejemplo: aadir 4 microlitros de muestra a 200 microlitros de diluyente en un pocillo o tubo y mezclar bien. 2. Colocar el nmero requerido de pocillos en el soporte de la microplaca. 3. Introducir 100 microlitros de cada calibrador, control y muestra diluidos a los pocillos correspondientes. 4. Incubar los pocillos a temperatura ambiente (20 a 25C) durante 30 minutos (+/- 5 minutos). 5. Lavar los pocillos 4 veces, vacindolos a continuacin. 6. Aadir 2 gotas (100 microlitros) de conjugado en cada pocillo. 7. Incubar los pocillos a temperatura ambiente durante 30 minutos (+/- 5 minutos). 8. Lavar los pocillos 4 veces, vacindolos a continuacin. 9. Aadir dos gotas (100 microlitros) de substrato en cada pocillo.

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10. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos (+/- 5 minutos). 11. Aadir dos gotas (100 microlitros) de solucin de parada en cada pocillo. 12. Leer y anotar la absorbancia del contenido de cada pocillo a 405 nm frente a blanco. Las lecturas deben realizarse dentro de las 2 horas despus de que la reaccin se detuvo.

V.

LECTURA E INTERPRETACIN a. Lectura: Hacer blanco al aire sin la placa y leer la absorbancia de la solucin de cada pocillo a 450 5 nm (longitud de onda nica). b. Clculos: Punto Final: (calibrador 2) : Determinar el valor del ndice o IU/ml para cada muestra (o control) usando la frmula siguiente: ndice calibrador o IU/ml x Absorbancia muestra = ndice o IU/ml Absorbancia calibrador muestra SI se realiza el calibrador por duplicado, utilizar la media de los valores obtenidos para realizar el clculo. c. Interpretacin: El Toxoplasma gondii es un parsito ubicuo en el humano y los animales. La mayora de las infecciones en el humano pasan inadvertidas, aunque, en algunos casos, la enfermedad pueda tener un carcter benigno o ms grave y de larga duracin. No obstante si una mujer embarazada est infectada, el parsito Toxoplasma puede pasar por la placenta e infectar al feto. Estas infecciones congnitas pueden tener consecuencias muy serias, en algunos casos, incluso el aborto o el mortinato. NO existe comercialmente ninguna vacuna contra la infeccin, pero la infeccin natural suele conferir una inmunidad de por vida.

29

Se determina el estado inmune controlando la presencia de anticuerpos anti-toxoplasma IgG. Antiguamente el diagnstico de una Toxoplasmosis aguda de basaba exclusivamente en la deteccin de anticuerpos anti-toxoplasma IgM, debido a que la IgM suele permanecer en algunos pacientes por el lapso de un ao o ms, es mejor realizar dos controles con 21 das de diferencia. El aumento de la tasa de Inmunogobulinas es indicativa de una infeccin reciente. Las pruebas IgG de ELISA estn reconocidas como herramientas serolgicas en el control de Toxoplasma y se basan en: Un resultado reactivo refleja una infeccin anterior o actual por T. gondii. Un resultado no reactivo indica que probablemente no exista proteccin contra una infeccin por T. gondii, vale decir una gestante en riesgo (seronegativa); sin embargo debe tenerse en cuenta de que el resultado de la prueba ser no reactivo durante el periodo de incubacin y durante las primeras fases de la infeccin. Los anticuerpos IgG durante la fase aguda del toxoplasma aumentan gradualmente hasta alcanzar sus niveles mximos entre los dos a cinco meses de presentarse los sntomas. El diagnstico de toxoplasmosis aguda (sero conversin positiva) debe estar dado en combinacin con la deteccin de IgM especfica y el aumento de la tasa de IgG.

VI.

LIMITACIONES DEL METODO Esta destinado solo a la deteccin de anticuerpos IgG frente al Toxoplasma gondii. Las sustancias interferentes que podran afectar la interpretacin son insignificantes. Se recomienda volver a analizar las muestras que resulten reactivas despus del primer anlisis.

VII.

REPORTE Y LIBERACIN DE RESULTADOS

30

IU/ml Valor del ndice Interpretacin < 27 < 0.9 Negativo > 27< 33 > 0.9 < 1.1 Equvoco > 33 > 1.1 Positivo Cuando se obtienen valores equvocos, se debe obtener otra muestra dos o tres semanas despus y valorarla de nuevo en paralelo con la muestra inicial. Si la segunda muestra resulta nuevamente equvoca, se considera al paciente negativo para una infeccin primaria o reciente y equvoco en cuanto al estado inmunolgico. Si la segunda muestra es positiva, puede considerarse el paciente

Quit Human IgG : Estandarizado 03-04-03 I PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS La prueba Human Elisa Toxo IgG esta basada en la clsica tcnica ELISA. Los micropocillos ELISA son recubiertos con antgenos de Toxoplasma preparados con parsitos sonicados Toxoplasma gondii (taquizoitos). En la primera etapa la incubacin , los anticuerpos anti TOXO , contenidos en la prueba o el control se fijan especficamente a los antgenos inmovilizados. Al final de la incubacin los componentes excesivos son eliminados por lavado. En la segunda etapa de incubacin se aade un conjugado anti IgG (anticuerpos anti-IgG-humana marcados con peroxidasa) que se fijan especficamente a los anticuerpos IgG. Se forman inmunocomplejos tpicos. Despus de eliminar el conjugado excesivo por lavado y aadir TMB / substrato (etapa 3) , se forma un color azul que se transforma a amarillo despus de parar la reaccin. La intensidad de este color es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos anti- TOXO IgG en la muestra. II MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS a. gondii Material: Cuaderno de Registro Guantes desechables Placas de tiras microelisa recubiertas con Ag de T.

31

Precintos para placas Micropipeta automtica graduable de 4 a 200ul Micropipeta multicanal automtica Tips Tubos de ensayo Cronmetro Papel absorbente

Recipientes de desechos, biolgicamente peligrosos, para los materiales potencialmente contaminados. b. Reactivos Agua destilada o desionizada

Conjugado: Anti-IgG-humano, marcado con peroxidasa (conejo). Control Negativo: Suero humano, no reactivo a antitoxoplasma IgG. Control Cut off Control positivo IgG alto, medio y bajo. Buffer de dilucin IgG. y B. Solucin TMB

Reactivo substrato A (tetrametilbencidina en cido ctrico) Solucin de lavado. -

cido sulfrico 1 mol/l para anlisis

c. Equipo - Lector de microplacas (espectrofotmetro para microplacas con filtro de 450nm) III PROCEDIMIENTO.1. 2. 3. 4. 5. Diluir el suero del paciente 1+100 con buffer de dilucin. Mezclar vigorosamente. Colocar 100 ul de las muestras diluidas, adems de colocar los controles negativo y positivos directamente. Incubar por 30 min. Entre 17 a 25 C. Lavar 4 veces con la solucin de lavado. Colocar el conjugado 100 ul. 32

6. 7. 8. 9. 10. 11.

Incubar por 30 min. Entre 17 a 25 C. Lavar 5 veces con la solucin de lavado. Colocar el substrato 100 ul. Incubar por 15 min. Entre 17 a 25 C. Aadir 100 ul de solucin stop. Leer a 450 nm de absorbancia dentro de 30 min.

ENZIMOINMUNOENSAYO TOXOPLASMOSIS (IgM)

I.

PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS El diagnstico de toxoplasmosis es frecuentemente asistido por mtodos serolgicos. La demostracin de anticuerpos IgM antitoxoplasma es generalmente indicativo de una infeccin activa o reciente o, en caso de recin nacidos, de infeccin congnita. Quit : SeraQuest . Estandarizado 04-02-03 La Paz, Enero de 2003. El equipo SeraQuest Toxoplasma IgM se ha diseado para la deteccin de anticuerpos IgM anti-toxoplasma. Los resultados de la prueba se obtienen despus de una hora y media de incubacin. Los resultados son objetivos y expresados como valor de ndice permitiendo uniformidad de los resultados.

II.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS a. Material: Cuaderno de Registro Guantes desechables recubiertas con IgM anti-

Placas de tiras microelisa humana (oveja) Precintos para placas -

Micropipeta automtica graduable de 5 a 200ul Micropipeta multicanal automtica 33

Tips Tubos de ensayo Cronmetro Papel absorbente

Recipientes de desechos, biolgicamente peligrosos, para los materiales potencialmente contaminados. b. Reactivos Agua destilada o desionizada

Antgeno/conjugado: Antgeno toxoplasma y antitoxoplasma (de oveja) marcado con HRP liofilizado. Control Negativo: Suero humano, no reactivo a antitoxoplasma IgM. Control positivo: Suero Humano reactivo a antitoxoplasma IgM Control fuertemente positivo: Suero bovino conteniendo anti.toxoplasma IgM (monoclonal humano) Tampn fosfato concentrado Solucin TMB (tetrametilbencidina en cido ctrico) Solucin de perxido de urea cido sulfrico 1 mol/l para anlisis

c. Equipo - Lector de microplacas (espectrofotmetro para filtro de 405nm) - Incubador (seco o humedecido) o bao mara a 37 2C.

III.

CALIBRACIN Y CONTROL a. Calibracin: Alternativamente, los resultados pueden calcularse a partir de una curva de calibracin a tres puntos: calibrador 1 (punto alto), calibrador 2 (punto medio) y blanco de reactivos (cero), usando un grfico punto a punto. b. Control: Los calibradores y controles deben incluirse en cada prueba.

34

El valor de absorbancia del calibrador 1 debe ser al menos de 0.4 cuando se lee frente al blanco. El valor de absorbancia del blanco debe ser menor de 0.35. El control negativo debe presentar un valor inferior de 27 IU/ml y un ndice menor de 0.9. El control positivo debe presentar un valor de ndice dentro del rango indicado en el vial.

Si no se cumple uno de estos criterios, se deber repetir la prueba.

IV.

PROCEDIMIENTO a. Preparacin de reactivos: Atemperar todos los reactivos y muestras antes de usar. Devolverlas pronto al frigorfico despus de usar. 1. Preparar la dilucin 1:25 de las muestras, calibradores y controles. Por ejemplo: aadir 8 microlitros de muestra a 200 microlitros de diluyente en un pocillo o tubo y mezclar bien. 2. Colocar el nmero apropiado de pocillos en el soporte de la microplaca. 3. Introducir 100 microlitros de cada calibrador, control y muestra diluidos a los pocillos correspondientes. 4. Incubar los pocillos a temperatura ambiente (20 a 25C) durante 30 minutos (+/- 5 minutos). 5. Lavar los pocillos 4 veces, vacindolos a continuacin. 6. Aadir 2 gotas (100 microlitros) de conjugado en cada pocillo. 7. Incubar los pocillos a temperatura ambiente durante 30 minutos (+/-5 minutos). 8. Lavar los pocillos 4 veces, vacindolos a continuacin. 9. Aadir dos gotas (100 microlitros) de substrato en cada pocillo. 10. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos (+/-5 minutos). 11. Aadir dos gotas (100 microlitros) de solucin de parada en cada pocillo.

35

12. Leer y anotar la absorbancia del contenido de cada pocillo a 405 nm frente a blanco. Las lecturas deben realizarse dentro de las 2 horas despus de que la reaccin se detuvo.

V.

LECTURA E INTERPRETACIN a. Lectura: Hacer blanco al aire sin la placa y leer la absorbancia de la solucin de cada pocillo a 450 5 nm (longitud de onda nica). b. Clculos: Punto Final: (calibrador 1 o calibrador 2) : Determinar el valor del ndice o IU/ml para cada muestra (o control) usando la frmula siguiente: ndice calibrador o IU/ml x Absorbancia muestra = ndice o IU/ml Absorbancia calibrador muestra SI se realiza el calibrador por duplicado, utilizar la media de los valores obtenidos para realizar el clculo. c. Interpretacin: El Toxoplasma gondii es un parsito ubicuo en el humano y los animales. La mayora de las infecciones en el humano pasan inadvertidas, aunque, en algunos casos, la enfermedad pueda tener un carcter benigno o ms grave y de larga duracin. No obstante si una mujer embarazada est infectada, el parsito Toxoplasma puede pasar por la placenta e infectar al feto. Estas infecciones congnitas pueden tener consecuencias muy serias, en algunos casos, incluso el nacimiento de un nio muerto. Una infeccin aguda por el toxoplasma es en general una enfermedad ms bien benigna, frecuentemente sub-clnica. Una enfermedad sintomtica se presenta normalmente mediante linfoadenopata, fiebre o fatiga. Los anticuerpos IgM pueden aparecer ya en los primeros 5 das despus de la infeccin, alcanzando su mxima

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concentracin en las primeras semanas y pueden persistir durante meses (o aos) despus de la infeccin. Un resultado es reactivo indica una infeccin reciente o aguda por toxoplasma. Un resultado no reactivo excluye probablemente una infeccin aguda o reciente por toxoplasma. En caso de una infeccin congnita la sensibilidad de la prueba es menor debido a las cantidades de IgM producidas. Resultados no reactivos en este caso no excluyen una infeccin congnita.

VI.

LIMITACIONES DEL MTODO - Esta destinado solo a la deteccin de anticuerpos IgM frente al Toxoplasma gondii. - Existen algunas sustancias interferentes que podran afectar la interpretacin de los resultados. - Se recomienda volver a analizar las muestras que resulten reactivas despus de 21 das (3 semanas).

REPORTE Y LIBERACIN DE RESULTADOS Valor del ndice < 0.9 > 0.9 < 1.1 > 1.1 Interpretacin Negativo Equvoco Positivo

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INMUNOFLUORESCENCIA TOXOPLASMOSIS La Paz, Enero de 2003. I. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS El mtodo de inmunofluorescencia se basa en la capacidad que tienen las protenas de unirse a fluorocromos sin alterar sus propiedades inmunolgicas; esto permite observar al microscopio de fluorescencia la formacin de complejos antgeno anticuerpo, si es que en una segunda etapa este complejo se une a un inmuno-reactivo ligado a un fluorocromo. El antgeno figurado fijado a la placa de vidrio o portaobjetos y generalmente se obtienen de los parsitos recuperados del ascitis de ratones inoculados. La reaccin de inmunofluorescencia Indirecta correctamente estandarizada es una de las pruebas inmunodiagnsticas ms sensibles y especficas que puede ser utilizada como prueba patrn para estudiar la sensibilidad y especificidad de otras tcnicas.

II.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS a. Material: - Cuaderno de registro Guantes Secador de cabello Portaobjetos especiales IFI Cubreobjetos 24 x 48mm Jarras Koplin Vasos de precipitado Frasco gotero Papel filtro Micropipetas

38

Tips Tubos de hemlisis Gradillas

b. Reactivos: - Solucin Buffer fosfato salina Ph 7,2 (PBS) Antgeno fijado a portaobjetos Antigammaglobulina Humana marcada con isotiocianato de fluoresceina o conjugado. Azul de Evans Solucin de montaje.

c. Equipos: - Microscopio de inmunofluorescencia. Estufa de cultivo Heladera Cmara Hmeda

III.

CONTROL Los testigos debern presentar las siguientes caractersticas: Testigo negativo: Al microscopio de fluorescencia, los parsitos debern presentar una coloracin pardo-rojiza y no presentar fluorescencia. Testigo positivo: Al microscopio de fluorescencia los parsitos se presentan teidos con el fluorocromo, en este caso presentaran color verde fluorescente. La fluorescencia es particularmente intensa en la membrana del parsito.

IV.

PROCEDIMIENTO Sacar los portaobjetos con los antgenos de la heladera y dejar que sequen en papel filtro. Diluir los sueros control positivo y negativo en PBS a 1:32. Diluir los sueros problema a partir de 1:16

39

Colocar una gota de cada una de las soluciones en las divisiones de la placa incluyendo los controles positivos y negativo. Incubar los portaobjetos en cmara hmeda a 37C por 30 minutos Lavar los portaobjetos tres veces con PBS, cada vez por 5 minutos. Secar los portaobjetos con corriente de aire fro . Diluir el conjugado de acuerdo a su ttulo en azul de Evans. Colocar una gota del conjugado diluido en cada una de las divisiones del portaobjeto. Incubar los porta objetos en cmara hmeda a 37C por 30 minutos. Lavar los portaobjetos tres veces con PBS, cada vez por 5 minutos. Secar los portaobjetos con corriente de aire fro . Colocar los cubreobjetos con el lquido de montaje.

V.

LECTURA E INTERPRETACIN a. Lectura: Leer en microscopio de inmunofluorescencia. Hacer la lectura de los testigos antes que los sueros problemas. La fluorescencia es particularmente intensa en la membrana del parsito. La dilucin diagnstica para esta prueba corresponde a 1:32 por lo que cualquier ttulo igual o superior se considera como positivo. b. Interpretacin: La IFI como cualquier otra prueba de diagnstico serolgico, no puede ser concebida como un mtodo de diagnstico definitivo, por lo tanto todo resultado debe ser interpretado como una probabilidad mayor o menor de acierto en relacin al caso estudiado dentro de una poblacin normal o parasitada.

40

Los individuos parasitados por T. gondii infectados despus del nacimiento suelen dar resultados positivos para IFI antes que en la HAI, esto porque el antgeno utilizado en la IFI es de superficie. En los recin nacidos infectados dentro del tero la reaccin positiva puede demorarse un tiempo en aparecer , sin embargo tambin har su aparicin antes que la HAI. Los infectados en ms del 95% de los casos suelen dar ttulos de 1:16 o mayores, a pesar de esto la lnea de corte se ha fijado a una dilucin 1:32 porque a diluciones menores suelen presentarse reacciones cruzadas con otras parasitosis. Las personas presumiblemente no parasitadas, en el 95% de los casos no superan la dilucin de 1:8, este ttulo tiende a aumentar en personas de bajo nivel socio-econmico, en las que el ttulo puede alcanzar a 1:16 pero en ningn caso es mayor. Un suero reactivo a ttulo 1:8 no podr ser considerado como negativo si es que se sospecha una toxoplasmosis de transmisin congnita ya que en esta caso se deber repetir la prueba a los 30 das

VI.

LIMITACIONES DEL MTODO La inexperiencia del personal que realiza el diagnstico puede llevar a la lectura de falsos positivos en el caso de sueros con factor reumatoideo positivo ya que estos dan una fluorescencia mono o bipolar en los parsitos, esto es particularmente evidente cuando el conjugado utilizado es anti IgM o es un conjugado polivalente (GMA). Suelen presentarse reacciones cruzadas con otras parasitosis.

VII.

FUENTES DE ERROR Unas de las principales causas de error de la IFI es que el conjugado fluorescente no este correctamente titulado ya que puede dar lugar a los falsos positivos y falsos negativos. Los lavados durante la realizacin de la tcnica son de mucha importancia ya que as se eliminan las sustancias no ligadas y se evita la inmunofluorescencia inespecfica.

41

VIII. REPORTE Y LIBERACIN DE RESULTADOS a. Reporte: NO REACTIVO cuando el parsito presenta color cafrojizo sin fluorescencia. REACTIVO cuando se presenta con una fluorescencia verde intensa, debe indicarse la dilucin hasta la que alcanza el ttulo del suero b. Liberacin de Resultados: ver anexos

BIBLIOGRAFA
1.- Ambroise, T.; Pelloux, H.; Toxoplasmosis congenita, avances en el diagnstico serolgico y molecular; Memorias Segundo congreso internacional de Toxoplasmosis, Santa F de Bogota 1998; 19-23. 2.- Francis Derouin; Philippe Thulliez; Stphane Romand; Bertrand Lecolier; La Toxoplasmose chez lhomme, Diagnpstic, prevention et traitement; Supplement au LABORAMA N 35. BIORAD. 3.-Jorge Enrique Gmez Marn,. Jhon Carlos Castao; Mara Teresa Montoya Londoo; Nelsy Loango; Consuelo Lpez; Mara Cristina Sarmiento; Lyda Pinzn; Fernando Alvarado Toxoplasmosis congnita en Colombia: Anlisis clnico y de laboratorio en 27 casos. 4.- Frenkel J.K.; Toxoplasmosis mechanisms of infection. Laboratory diagnosis mangement; Curr Ttop Path 1971; 541; 28-75 5.- Mollinedo S.; Desjeux P.; Alvarez H.; Martinez E.; Torrez M.; Sainz Z.; Toxoplasmosis; Anuario Instituto Bolivianao de Biologa de la Altura; 19861987. 6.- Mollinedo S.; Desjeux P.; Torrez M.; Sainz Z.; Alvarez H.; Evaluacin de los mtodos: Hemaglutinacin indirecta (HAI), Inmunofluorescencia indirecta (IFI), ELISA y Latex; en el despistaje seroinmunolgico de la Toxoplasmosis en La Paz, Bolivia; Anuario Bodas de Plata Instituto Boliviano de Biologa de la Altura; 1988. 7.- Pedro Jimnez Monroy; Guias de manejo de la Toxoplasmosis en el embarazo; Santaf de Bogot, Colombia. 8.- Norma Cecilia Serrano; Mara Eugenia Crdenas; Estado Actual del Diagnstico de la Toxoplasmosis en la Mujer Embarazada y su Feto. 9.- Sera Quest.Manual tcnico. 42

10.-Juan J. Picazo; Antonio Fuertes Ortiz de Urbina; Protocolos Clnicos de diagnstico serolgico comentado. N 6; Versin 1. Enero 1998 Innogenetics Diagnstica y Teraputica

GLOSARIO
Anticuerpo: Glucoprotena producida en el organismo en respuesta directa a la introduccin de un antgeno o de un hapteno. Antgeno: Sustancia que produce en los animales superiores la formacin de anticuerpos y/o de reaccin de hipersensibilidad inmunolgica activa. Absorbancia: Cantidad de rayos luminosos absorbidos por una sustancia coloreado. Liofilizado: Sustancia congelada rpidamente a una temperatura muy baja y luego deshidratada rpidamente. Anticuerpo: Glucoprotena producida en el organismo en respuesta directa a la introduccin de un antgeno o de un hapteno. Antgeno: Sustancia que produce en los animales superiores la formacin de anticuerpos y/o de reaccin de hipersensibilidad inmunolgica activa. Anticoagulante: Sustancia que previene o se opone a la coagulacin. Fluorescencia: Propiedad de ciertos cuerpos de absorber luz de una determinada longitud de onda y emitirla a una longitud de onda superior. Fluorescena:: Ftalena de la resorcina; materia colorante que en solucin alcalina presenta una fluorescencia verde muy intensa.

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ANEXO
LABORATORIO DE ZOONOSIS PARASITARIAS DIAGNOSTICO DE TOXOPLASMOSIS
Nombre: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Edad: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mdico Tratante: . . . . . . . . . . . . . . . . Fecha toma de muestra: . . . . . . . . . . . Impresin diagnstica: . . . . . . . . . . . . Examen solicitado: . . . . . . . . . . . . . . .

Procedencia: . . . . . . . . . . . . . Folio: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fecha resultado: . . . . . . . . . .

Resultado a ser llenado de acuerdo al nivel de complejidad del laboratorio A) AGLUTINACIN DIRECTA (AD): B) HEMAGLUTINACIN INDIRECTA: Inmunoglobulina G (IgG): Inmunoglobulina M (IgM):

C) Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA): Inmunoglobulina G (Ig G): . . . . . . . . . . . . . . . Inmunoglobulina M (Ig M);

D) INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI): Inmunoglobulina G (Ig G): . . . . . . . . . . . . . . . Inmunoglobulina M (Ig M); ________________________________________________________________________ Interpretacin: _ Reaccin Negativa correspondiente a una Toxoplasmosis antigua _ Baja tasa de anticuerpos IgG considerada como Negativa _ Presencia de Inmunoglobulina M especfica. _ Se sugiere efectuar control serolgico a las 2 semanas

FIRMA Responsable del laboratorio

44

Control serolgico de la embarazada para la prevencin de la toxoplasmosis

Ante un ttulo estable de IgG, o en espera de que transcurran las 3-4 semanas para la obtencin de la 2 muestra, podemos determinar la avidez de las IgG, efectuar una determinacin de IgA anti-Toxoplasma y valorar todos los factores de probabilidad de toxoplasmosis, cuya positividad incrementar el grado de probabilidad de infeccin aguda:
a

predominio de IgG de baja avidez ttulo de IgG elevado (>300 UI/ml) ttulo de IgM elevado ttulo de IgA elevado antecedente de adenopatas

45

Pauta de actuacin ante un recin nacido con sospecha de infeccin congnita (TC).

La presencia de calcificaciones cerebrales, hidrocefalia o coriorretinitis en el recin nacido (RN), es muy sugestiva de toxoplasmosis congnita (TC). Hay que considerar la posibilidad de efectuar PCR o aislamiento del parsito en LCR, sangre u orina. La positividad de cualquiera de estas tcnicas, confirmar el diagnstico de TC. En el RN asintomtico se realizar el seguimiento serolgico segn el algoritmo propuesto. b Es muy importante no efectuar la determinacin en sangre de cordn, para evitar la contaminacin con IgM maternas.

Toxoplasmosis (Toxoplasma gondii)

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Deteccin de Anticuerpos El examen serolgico es usado para indicar la presencia de la infeccin a travs de la deteccin de anticuepos anti toxoplasma especficos en suero, plasma, lquido cefalo-raqudeo o fluidos oculares Si se quiere determinar seropositividad, una sola muestra es suficiente. Si se quiere determinar el tiempo de infeccin se toman dos muestras obtenidas entre 21 das a tres meses de diferencia. Algunas veces la deteccin de una elevacin de ttulos o niveles de IgG o IgM , no es posible debido a que los ttulos todava no han alcanzado un nivel en el momento en que la muestra inicial es tomada.
Test en suero para detectar la presencia de anticuerpos anti Toxoplasma IgG especficos Ig G Negativo : No infectada Ig G Positivo: Infectada

Para determinar tiempo aproximado de la infeccin, test serolgico para detectar la presencia de anticuerpos anti Toxoplasma IgM especificos

IgG Positivo IgM Positivo: 1. Infeccin dentro de los ltimos 2 aos, o 2. Falso positivo IgM

IgG Positivo IgM Negativo: Infectado por ms de 1 ao Obtener la 2da muestra 2 semanas despus de la primera, enviar ambas muestras al laboratorio de referencia para la confirmacin antes de cualquier intervencin

En nuestro pas muchos test serolgicos estn disponibles, la sensibilidad y la especificidad de estos Kits pueden variar ampliamente de una casa comercial a otra. Esto es importante, porque los resultados serolgicos pueden influir en la toma de decisiones para continuar o detener un embarazo.

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LABORATORIO NACIONAL DE PARASITOLOGA PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD RED NACIONAL DE DIAGNOSTICO DE LA TOXOPLASMOSIS (2003)

1. IDENTIFICACIN DEL PARTICIPANTE: NOMBRE: Laboratorio 2. RESULTADO DE SU PARTICIPACIN: TCNICA AD HAI Total de muestras Positivo Ig. G (tasa) Positivo Ig. M (tasa) Negativo Ig. G Negativo Ig. M 3. ERRORES ENCONTRADOS: Informe de resultado falso negativo Informe de resultado falso positivo Resultados con solo una tcnica serolgica Solamente determinacin de Ig G Falta de titulacin de la muestra Contaminacin de la muestras Resultados sin interpretacin 4. RESULTADOS: Control positivos Laboratorio positivos Laboratorio negativos TOTAL SENSIBILIDAD: % ESPECIFICIDAD: % VALOR PREDICTIVO POSITIVO: VALOR PREDICTIVO NEGATIVO: 5.- COMENTARIO: La Paz, ...............................de 2003 Control negativos TOTAL ELISA IFI OTROS

% %

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UNIDAD DE PARASITOLOGA Y MEDICINA TROPICAL (UPAMET) RED NACIONAL DE DIAGNOSTICO DE LA TOXOPLASMOSIS (2003)

PRIMERA REUNIN

PROGRAMA
Lugar: Fecha: 08:00 a 9::15 a.m. 09:15 a 10:00 a.m. 10:00 a 10:15 a.m. 10:15 a 10:30 a.m. 10:30 a 11:00 a.m. Auditrium INLASA 24 Abril 2003 Inscripcin y entrega de material Toxoplasmosis Generalidades. Red Nacional de Laboratorios Proyeccin de la Red de Laboratorios de Parasitologa. Refrigerio. Diagnostico de la Toxoplasmosis Diagnstico Clnico Diagnstico Biolgico (Mtodos Directos e Indirectos) 11:00 a 11:30 a.m. Principales tcnicas de diagnostico. HAI ELISA 11:30 a 12::00 a.m. Fijacin de responsabilidades y calendario de prximas reuniones.

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