La cintica enzimtica es la parte de la Enzimologa que se ocupa del estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas y las

causas de su variacin. Los ensayos enzimticos se emplean rutinariamente en muchos laboratorios clnicos para el diagnstico de numerosas enfermedades, bien observando velocidades de reaccin anormales o bien observando niveles enzimticos inadecuados en el plasma u otros tejidos. Un ensayo enzimtico se basa en la actuacin de la enzima sobre una sustancia, llamada sustrato, catalizando su conversin en otra especfica, conocida como producto. Normalmente algn elemento de los que intervienen en la reaccin absorbe luz a una longitud de onda determinada, con lo que la reaccin puede seguirse por colorimetra o espectrofotometra.

El proceso enzimtico sigue las siguientes etapas:

En primer lugar el sustrato (S) y la enzima (E) se unen y forman un complejo enzimasustrato (ES). Una vez formado el complejo ES, este o bien se disocia en enzima ms el sustrato o se transforma el sustrato en producto formado el complejo enzima-producto (EP), que se disocia para dar enzima (E) ms producto (P). El proceso fue modelizado por Michaelis y Menten y le permitio obtener una ecuacin, ecuacin de Michaelis-Mente en donde la velocidad de la accin de un enzima es funcin de la cantidad de sustrato presente, la cantidad de enzima y las caractersticas del enzima, la afinidad del enzima por el sustrato y el poder cataltico del enzima:

La Km nos da una idea la afinidad que tiene el enzima por su sustrato, cuanto mayor es Km menor es la afinidad (predominan las formas E y S libres), cuanto menor es Km mayor es la afinidad (predomina la forma ES).

La velocidad mxima Vmx estima el nmero de centros activos del enzima. Recordar que hemos definido la Vmx como la velocidad que obtendramos cuando todo el enzima se encuentra unido al sustrato. A la constante k2 (poder cataltico del enzima) se la reconoce con el nombre de nmero de recambio, es el nmero de molculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo. Por lo que la Vmx depende de dos cosas, la cantidad de enzima presente y la capacidad cataltica del enzima, es decir la velocidad con que transforma al sustrato.

La representacin grfica de la velocidad en funcin de la concentracin de sustrato:

Del estudio del modelo se desprende que la velocidad de transformacin de sustrato en producto en una reaccin enzimtica depende:

La cantidad de sustrato presente. [S] La afinidad del enzima por el sustrato. Km La cantidad de enzima presente. [E] El poder cataltico del enzima. [k2]

Estudia en las siguientes grficas los las variaciones de la velocidad en funcin de los cambios: Cantidad de sustrato:

Afinidad del enzima por el sustrato y cantidad de enzima o poder cataltico:

Poder cataltico de los enzimas

Como catalizadores: - Aceleran la velocidad de las reacciones. - Son eficaces en pequeas cantidades. - Su estado inicial es igual a su estado final. - No alteran el equilibrio de las reacciones que catalizan. - No afectan a la G Como protenas: - Son termolbiles, es decir, son sensibles a la temperatura - Son ms eficientes que los catalizadores qumicos. - Son muy especficos. - Su regulacin es muy compleja. - La especificidad reside en unos aminocidos especficos, que conforman 2 centros diferentes: - El centro cataltico y el centro de unin al sustrato, que conjuntamente conforman el centro activo.

OFACTORES
- Son compuestos no proteicos, de los que necesitan algunos enzimas para poder realizar su funcin cataltica. - Holoenzima: Complejo enzima cofactor - Apoenzima: grupo proteico del enzima - Iones metlicos: han de ser aportados con la dieta. Pueden ser: Fe, Cu, Zn, Mn, Co, Se, Na, K, Mg, - Coenzimas: Son molculas orgnicas esenciales, que tambin han de entrar con la dieta. Se suele tratar de vitaminas insolubles como: B1, B2, B3, B6, B12, Si es un grupo prosttico est unido a la parte proteica por un enlace covalente. - Si se trata de un cosustrato el enlace ser dbil. - Puede ocurrir que necesiten ms de un cofactor. - Puede ser difcil distinguir si se trata de un grupo prosttico o de un cosustrato. - Los cofactores ayudan al enzima: - Favoreciendo la correcta alineacin. - Aportando un sitio adicional de enlace. - Participando en la catlisis. Los Coenzimas: - No son proteicos - Orgnicos, con un peso molecular bajo. - Termoestables - Estequiometra. - No son especficos. - Tienen diferentes estructura a la de los sustratos. - Elevada movilidad de electrones. - Ejemplos:

- NAD+: Nicotinamidaadeninnucletido (Forma reducida del NADH) - NADP+: Nicotinamidaadeninnucletidofosfato (Forma reducida del NADPH) - Se denominan nucletidos de la piridina o coenzimas piridnicos. - Nicotinamida: deriva de la vitamina P.P. (Preventivo de la pelagra). - Es el grupo prosttico de algunas Deshidrogenasas (DH): - IsocitratoDH - PiruvatoDH - LactatoDH Nucletidos de la flavina o coenzimas flavnicos. - Son derivados de la vitamina B2 o rivoflavina. - Es el grupo prosttico de las flavoprotenas o de las flavinDH. - Se trata del FAD o del FMN - La parte reactiva es la del anillo de isoaloxacina. - Puede tener 2 etapas de reduccin: - FAD FADH- FADH2 - Acta como coenzima en algunas reaccione como la catalizada por la succinatoDH. Un cofactor es un componente no proteico, termoestable y de bajo peso molecular, necesario para la accin de una enzima. El cofactor se une a una estructura proteica denominada apoenzima, y a este complejo se le denomina holoenzima. Entre los cofactores mencionables se encuentran: Iones metlicos (Fe2+, Cu2+, K+, Mn2+, Mg2+, entre otros) y molculas orgnicas. Aquellos cofactores que estn fuertemente unidos a la apoenzima son denominados grupos prostticos; en otros casos los que estn unidos dbilmente a la apoenzima y actan fundamentalmente como uno de los sustratos especficos de la reaccin, se llaman coenzimas. El ion metlico puede actuar como:

Centro cataltico primario. Grupo puente para reunir el sustrato y la enzima, formando un complejo de coordinacin Agente estabilizante de la conformacin de la protena enzimtica en su forma catalticamente activa.

Las enzimas que precisan de iones metlicos se llaman a veces metaloenzimas.

Las coenzimas son pequeas molculas orgnicas no proteicas que transportan grupos qumicos entre enzimas. A veces se denominan cosustratos. Estas molculas son sustratos de las enzimas y no forman parte permanente de la estructura enzimtica. Esto distingue a las coenzimas de los grupos prostticos, que son componentes no proticos que se enlazan estrechamente a las enzimas, tales como los centros hierro-azufre, la flavina o los grupos hemo. Tanto coenzimas como grupos prostticos pertenecen a un grupo ms amplio, los cofactores, que son molculas no proticas (por lo general, molculas orgnicas o iones metlicos) que requieren las enzimas para su actividad.

Estructura 3D de la coenzima NAD+

En el metabolismo, las coenzimas estn involucradas en reacciones de transferencia de grupos (como la coenzima A y la adenosina trifosfato (ATP)), y las reacciones redox (como la coenzima Q10 y la nicotinamida adenina dinucletido (NAD+)). Las coenzimas se consumen y se reciclan continuamente en el metabolismo; un conjunto de enzimas aade un grupo qumico a la coenzima y otro conjunto de enzimas lo extrae. Por ejemplo, las enzimas como la ATP sintasa fosforilan continuamente la adenosina difosfato (ADP), convirtindola en ATP, mientras que enzimas como las quinasas desfosforilan el ATP y lo convierten de nuevo en ADP. Las molculas de coenzima son a menudo vitaminas o se hacen a partir de vitaminas. Muchas coenzimas contienen el nucletido adenosina como parte de su estructura, como el ATP, la coenzima A y el NAD+. Esta estructura comn puede reflejar un origen evolutivo como parte de los ribozimas en un antiguo mundo de ARN.

Un grupo prosttico es el componente no aminoacdico que forma parte de la estructura de algunas protenas y que se halla fuertemente unido al resto de la molcula. Las protenas con grupo prosttico reciben el nombre de heteroprotenas (o protenas conjugadas). Hay enzimas que son protenas conjugadas; se trata de enzimas que requieren algn cofactor (metlico u orgnico) y ste se halla ligado con fuerza de manera permanente en la estructura molecular. Si un cofactor enzimtico (metlico u orgnico) slo se une a la enzima durante la catlisis no debe ser considerado un grupo prosttico.

COFACTORES - Son compuestos no proteicos, de los que necesitan algunos enzimas para poder realizar su funcin cataltica.ApoenzimaIn metlico: metaloenzimasGrupo prostticoHoloenzimaCofactor CoenzimaCosustratoHoloenzima: Complejo enzima cofactor - Apoenzima: grupo proteico del enzima- Iones metlicos: han de ser aportados con la dieta. Pueden ser: Fe, Cu, Zn, Mn, Co,Se, Na, K, Mg,...- Coenzimas: Son molculas orgnicas esenciales, que tambin han de entrar con ladieta. Se suele tratar de vitaminas insolubles como: B 1 ,B 2

,B 3 ,B 6 ,B 12 ,...- Si es un grupo prosttico est unido a la parte proteica por un enlace covalente.- Si se trata de un cosustrato el enlace ser dbil.- Puede ocurrir que necesiten ms de un cofactor.- Puede ser difcil distinguir si se trata de un grupo prosttico o de un cosustrato.- Los cofactores ayudan al enzima:Favoreciendo la correcta alineacin.- Aportando un sitio adicional de enlace.Participando en la catlisis.- Los Coenzimas:- No son proteicos- Orgnicos, con un peso molecular bajo.- Termoestables- Estequiometra.- No son especficos.Tienen diferentes estructura a la de los sustratos.- Elevada movilidad de electrones.- Ejemplos:- NAD + : Nicotinamidaadeninnucletido (Forma reducida del NADH)- NADP + : Nicotinamidaadeninnucletidofosfato (Forma reducida del NADPH) Tema 2: Enzimas 17

Para determinar la velocidad mxima de una reaccin enzimtica, la concentracin de sustrato ([S]) se aumenta hasta alcanzar una velocidad constante de formacin de producto. Esa es la velocidad mxima (Vmax) de la enzima. En ese caso, los sitios activos de la enzima estn saturados con sustrato.

Diagrama de velocidad de reaccin y constante de Michaelis-Menten.

[editar] Velocidad de reaccin/velocidad'V'

La velocidad V indica el nmero de reacciones por segundo que son catalizadas por una enzima. Con concentraciones crecientes de sustrato[S], la enzima va acercndose asintticamente su velocidad mxima Vmax, pero nunca la alcanza. Por esta razn, no hay un [S] determinado para la Vmax. De todas formas, el parmetro caracterstico de la enzima est definido por la concentracin de sustrato a la cual se alcanza la mitad de la velocidad mxima (Vmax/2).

[editar] Constante de Michaelis KM'

Entonces, aunque la concentracin de sustrato a Vmax no puede ser medida exactamente, las enzimas pueden ser caracterizadas por la concentracin de sustrato a la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. Esta concentracin de sustrato se conoce como constante de Michaelis-Menten (KM). Esta constante representa (para enzimas que exhiben una cintica de Michaelis-Menten simple), la constante de disociacin (la afinidad del complejo enzima-sustrato (ES) por el sustrato). Valores bajos indican que el complejo ES est unido muy fuertemente y raramente se disocia sin que el sustrato reaccione para dar producto. As para estos casos, se obtendr una diferente KM, segn el sustrato especfico, en que acte cada enzima (como sucede en el caso de enzimas que actan en sustratos anlogos); y las condiciones de reaccin en que se realice las mediciones. Nota: KM solo puede ser usada para determinar la afinidad de una enzima por un sustrato k2 es limitante de la velocidad, por ejemplo, k2 << k1 y KM se convierte k-1/k1. Generalmente, k2 >> k1, o k2 and k1 son comparables. Nelson, DL., Cox, MM. (2000) Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd Ed., Worth Publishers, USA

[editar] Ecuacin
La derivacin de Michaelis-Menten est descrita por Briggs y Haldane. Se obtiene de la siguiente manera:

Se supone que la reaccin enzimtica es irreversible, y que el producto no se liga con la enzima despus de la reaccin.

Siguiendo la aproximacin del estado estacionario, que seala que la concentracin del complejo enzima-sustrato (ES) es pequea y se mantiene casi constante a lo largo de la reaccin enzimtica:

Se define:

Entonces:

(1)

La velocidad de reaccin es:

(2) La concentracin total de la enzima: [E0] = [E] + [ES] Por lo tanto: [E] = [E0] [ES] (3)

Sustituyendo(3) en(1) da:

Reordenando: Km[ES] + [S][ES] = [E0][S]

(4) Sustituyendo(4) en (2) :

Esta ecuacin puede ser analizada experimentalmente con un diagrama de LineweaverBurke o un diagrama de Eadie-Hofstee.

E0 es el total de enzima. No es prctico medir la cantidad de complejo enzima sustrato durante la reaccin, por lo que debe escribirse est en trminos de cantidad total o inicial de enzima, que es una cantidad conocida. d[P]/dt o V0 es la velocidad de produccin de producto. k2[E0] o Vmax es la velocidad mxima. k2 es frecuentemente llamada kcat.

Notar que [S] es grande comparada con Km, [S]/(Km + [S]) tiende a 1. La velocidad de formacin de producto es igual a k2[E0] en ese caso. Cuando [S] es igual a Km, [S]/(Km + [S]) vale 0.5. En ese caso, la velocidad de formacin de producto es la mitad de la mxima(1/2 Vmax). Graficando V0 contra [S], se puede fcilmente determinar Vmax y Km. Esto requiere una serie de experimentos a E0 constante y diferentes concentraciones de sustrato [S].