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LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA CITOGENETICA CURSO PRCTICO PRACTICA Nro 1 ESTUDIO DE LA CROMATINA SEXUAL

1. Introduccin: Es bien sabido que las mujeres poseen dos cromosomas X y los hombres solo tienen uno. Durante la mayor parte de este siglo sabemos que el cromosoma X contiene muchos genes codificadores de protenas importantes. As, las mujeres tienen dos copias de cada gen ligado al cromosoma X, mientras que los hombres nicamente poseen una copia. Se sabe desde los comienzos de este siglo que las clulas masculinas difieren de las femeninas normales por su complemento de cromosomas sexuales, pero no se verific hasta 1921 con el descubrimiento de una diferencia entre las clulas masculinas y femeninas, visibles en la interface. El Dr. Barr de la universidad de Westeer Ontario y su alumno E. G. Bertram, observaron la existencia de una pequea masa de cromatina, reconocida ya previamente, pero mal interpretada, que se situaba en el ncleo de algunas clulas nerviosas; esta masa era muy frecuente en las mujeres y en cambio, muy rara en los hombres; se conoce en la actualidad con el nombre de Cuerpo de Barr. 2. Competencias: Contribuir a mejorar sus conocimientos en el contexto del mbito cientfico, sentando las bases para su formacin docente e investigadora. Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas que los pueden servir para integrarse en grupos de investigacin de Servicios de Gentica de Hospitales, institutos de investigacin, salud pblica, etc. Capacidad de aplicar los conocimientos en la prctica. Capacidad de resolucin de problemas. Trabajar en equipo 3. Contenidos: Inactivacin del Cromosoma X. Hiptesis de Lyon. Mecanismos de Inactivacin 4. Metodologa: La metodologa a usar ser de tipos: La primera parte audiovisual, dirigida y la Segunda parte netamente prctica donde los alumnos podrn identificar los Corpsculos de Barr y adems debern resolver un cuestionario al trmino de la prctica. 5. Materiales Reactivos: a. Materiales: Balanza Matraz 250ml Probeta 100ml

Pipetas Volumtricas de 5ml y 10ml b. Reactivos: ALCOHOL ETER (FIJADOR) Alcohol etlico absoluto ter etlico

volumen volumen

CIDO CLORHDRICO 5N(SOL. HIDROLIS) Acido Clorhdrico qp 35ml Agua Destilada csp 100ml COLORANTE CARBOL FUCSINA Solucin Stock Fucsina bsica 3g Alcohol etlico 70% 100ml Solucin de trabajo Solucin stock 10ml cido fenico 5% 90ml cido Actico glacial 5ml Formol 40% 5ml Mezclar con cuidado, filtrar el colorante 2 veces y guardar en frasco oscuro y en refrigeracin. De preferencia utilizar el colorante luego de 5 das de preparado para as evitar precipitados de colorante. 6. Tcnica del Carbol Fucsina: 6.1 Toma de Muestra: Se recomienda que se haga un enjuague bucal, o se haga una higiene bucal utilizando una gasa, previa al momento de toma de muestra. Utilizando una lmina portaobjetos limpia se hace un raspado de la mucosa oral, y luego se hace un frotis sobre una lmina portaobjetos, evitando retornar la lamina por el mismo lugar del extendido 6.2 Fijacin: Una vez tomada, la muestra colocar la lmina en un frasco (Koplins) que contenga al fijador durante 15 minutos como tiempo mnimo, aunque lo podemos dejar por ms tiempo (1 semana) sin que la muestra se deteriore. 6.3 Hidrlisis: Dejar secar, y luego colocarlo en un frasco (Koplins) que contenga el HCl 5N por un tiempo de 10 segundos o ms, dependiendo del tiempo de fijacin. 6.4 Lavado: Una vez retirada la muestra de la Solucin de Hidrlisis, pasar al frasco (Koplins) que contenga Agua Destilada o Agua simple para detener la accin del HCL. 6.5 Coloracin: Luego del lavado, la lmina es cubierta por el colorante Carbol Fucsina. El tiempo de coloracin depender fundamentalmente del grado de madurez y/ o tiempo de preparado el colorante. Tiempo promedio 5 a 10 minutos. 6.6 Decoloracin:

Luego la lamina deber ser pasada sucesivamente en dos frascos (Koplins) que contenga Alcohol Etlico 70% y Alcohol Etlico 100%, a manera de lavados rpidos. 6.7 Observacin al Microscopio: Una vez seca la lmina se procede a observar en el microscopio primero con objetivo de 10X para seleccionar el campo a estudiar y luego se pasa a objetivo de 100X para realizar el recuento de corpsculos de Barr siguiendo un criterio el conteo preestablecido.

CRITERIOS PARA EL RECUENTO DE CORPSCULOS DE BARR Se considera como cromatina X (Corpsculo de Barr) solamente el corpsculo Heteropicntico que se encuentra situada perifricamente y pegado a la cara interna de la membrana nuclear (carioteca). Se debe contar solo los ncleos que tengan membrana nuclear completa y cuya cromatina este finalmente distribuida as presente o no el corpsculo de Barr, para luego sacar el porcentaje de CB observados en a muestra. Para esto se deber contar no menos de 100 ncleos. No entran en el recuento los ncleos que estn superpuestos o plegados. No entran en el recuento los ncleos cuya cromatina sea heteropicntica y distribuida de forma irregular. No entran en el recuento los ncleos vacuolizados, ni ncleos que estn contaminados por grmenes. NOTA: En el recuento de los CORPSCULOS DE BARR no solo se deber tener en cuenta el numero de corpsculos presentes si no tambin se deber poner especial inters en la morfologa y el tamao del corpsculo. Las formas de corpsculo pueden ser redondeados, triangulares, trapezoidales, barra, etc. Pero siempre pegados a la membrana nuclear. Se pondr atencin tambin al tamao, si es demasiado pequeo o demasiado grande ya que en estos casos se asocian con una delecin o isocromosoma del X, que deber ser necesariamente confirmado con el estudio de cariotipo. VALORES NORMALES Mujeres: 20 40% Varones: 0%

7. Cuestionario: Existen Metodologas alternas para la observacin del CB, mencione las ventajas y cual es el tipo de muestra a utilizar? Cuales son los genes y las proteinas que participaran en la Inactivacin del Cromosoma X?

LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA CITOGENETICA CURSO PRCTICO PRACTICA Nro 2 CROMATINA SEXUAL
1. Introduccin: En 1949 Barr y Bertram descubrieron una masa de cromatina sexual en clulas en interfase femenina y no masculina que inicialmente las mal denominaron SATELITES DE NUCLEOLO. A esta observacin le sigui el desarrollo de una tcnica sencilla que permita detectar los Cuerpos de Barr en clulas de mucosa oral. Lo que llevo a la conclusin que las mujeres son CB positivas y los varones CB negativos en condiciones normales. Actualmente se sabe que el corpsculo de Barr representa uno de los cromosomas X de las clulas de las hembras, el X que contempla su replica, mas tarde que su homlogo y queda condensado e inactivo genticamente a lo largo de las interfaces. En 1959 Ohno, Kaplan y Kinosita demostraron que la cromatina X corresponde a la condensacin de uno solo de los cromosomas X en la mujer. Cuando un cromosoma o parte de este difiere de la mayora en un ciclo de condensacin, se dice que exhibe heteropicnosis, por lo tanto, el cuerpo de Barr es el resultado de la heteropicnosis positiva de un cromosoma X durante la interfase. 2. Competencias: Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas que los pueden servir para integrarse en grupos de investigacin de Servicios de Gentica de Hospitales, institutos de investigacin, salud pblica, etc. Observar la evidencia citolgica del cromosoma X inactivo Capacidad de resolucin de problemas y Trabajar en equipo. 3. Metodologa: La metodologa a usar ser prctica donde los alumnos podrn identificar los Corpsculos de Barr y adems debern resolver un cuestionario al trmino de la prctica. 4. Marco Terico: La INACTIVACION EL CROMOSOMA X fue explicada en 1961 por Mary Lyon quien detalla lo que se denomina en general "LA HIPTESIS DE LYON", basa su hiptesis en parte sobre observaciones genticas de los genes ligados al cromosoma X que determinan el color de la piel del ratn y en parte sobre datos citolgicos. En las clulas somticas de las hembras de los mamferos, solo un cromosoma X es activo. El segundo cromosoma X esta condensado e inactivo y aparece en las clulas en la interfase como cromatina sexual. La inactivacin se origina al comienzo de la vida embrionaria (14avo da). El cromosoma X INACTIVO puede ser indistintamente un X paterno o materno (Xp y Xm) en clulas diferentes del mismo individuo; pero una vez inactivado un cromosoma X en una clula, este permanecer inactivo en todos los descendientes de dicha clula. En otros trminos, la inactivacin es ALEATORIA, pero FIJA.

Como consecuencia de la inactivacin del cromosoma X, todas las mujeres tienen dos poblaciones distintas de clulas: una poblacin posee un cromosoma X activo procedente del padre y la otra posee un cromosoma X activo de la madre. Al tener dos poblaciones de clulas, las mujeres son mosaicos para el cromosoma X. Aunque la inactivacin es aleatoria entre las clulas que constituyen el embrin, en las clulas que formaran el tejido extraembrionario slo se inactiva el cromosoma X procedente del padre. Aunque la inactivacin del cromosoma X es permanente en todas las clulas somticas de la mujer, el cromosoma X inactivo debe reactivarse en la lnea germinal de las mujeres, de modo que cada vulo recibir una copia activa del cromosoma.

XIST codifica para un RNA de 17kb poliadenilado que no se traduce y es inestable (200 a 1000 / clula). Tambin se transcribe Tsix. XIST es un gen localizado dentro de una regin denominada XIC (Xq13.2). Unos pocos genes del cromosoma X inactivo, 15% permanecen activos, incluyendo el gen XIST.

4. Observacin al Microscopio: Una vez seca la lmina se procede a observar en el microscopio primero con objetivo de 10X para seleccionar el campo a estudiar y luego se pasa a objetivo de 100X para realizar el recuento de corpsculos de Barr siguiendo un criterio el conteo preestablecido.

Podemos observar en el PMN, el de la derecha presenta el corpsculo CB en la forma de Palillo de Tambor, mientras que el de la izquierda no.

5. Cuestionario: a. Paciente con fenotipo femenino con corpsculo barr positivo 12%. Escriba usted el o los probables cariotipos. As como su Dx. citogentico. b. Paciente con fenotipo femenino con corpsculo barr nicos 25% y corpsculos barr dobles 15%. Escriba usted el los probables cariotipos. As como su Dx. citogentico. c. Paciente con fenotipo femenino con corpsculo barr positivo 10%, pero estos corpsculos son pequeos. Escriba usted el o los cariotipos probables, as como su diagnstico citogentico. d. Paciente con fenotipo femenino con corpsculo de barr positivo 28%, pero estos corpsculos son grandes. Escriba usted el o los cariotipos probables, as como su Dx. citogentico. e. Paciente con fenotipo femenino con corpsculo barr doble 25% y corpsculo barr triple 22%. Escriba usted el o los cariotipos probables, as como su Dx citogentico. f. Recin nacido con genitales ambiguos con corpsculo barr positivo 30%. Escriba usted el o los probables cariotipos, as como sus Dx citogentico. g. Recin nacido con genitales externos femeninos, con ecografa que evidencian testculos, presenta corpsculo barr positivo 25%. Escriba usted el o los probables cariotipos, as como los Dx. citogenticos. h. Recin nacido con genitales externos masculinos, con ecografa que evidencian ovarios, presenta corpsculo barr negativo. Escriba usted el o los probables cariotipos, as como los Dx. citogenticos. i. Paciente con fenotipo masculino presenta corpsculo barr nico positivo 26% pero adems presenta doble corpsculo Y. Escriba usted el o los probables cariotipos, as como los Dx citogenticos.

ESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA CITOGENETICA CURSO PRCTICO PRACTICA Nro 3 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

1. Introduccin: Para el estudio Citogentico (Estudio Cromosmico) es necesario que las clulas estn en divisin celular (Mitosis) ya que los cromosomas slo podrn ser analizados, de acuerdo a su morfologa y patrn de bandas, cuando las clulas estn en el estadio de metafase. Algunas clulas de nuestro organismo normalmente pueden estar en un proceso de proliferacin y diferenciacin por lo que no es necesario estimularlos para que entren en divisin celular; pero otras clulas como los linfocitos de sangre perifrica como son clulas ya diferenciadas requieren de un estimulante mitgeno para que entren en mitosis. 2. Competencias: Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas que los pueden servir para integrarse en grupos de investigacin de Servicios de Gentica de Hospitales, institutos de investigacin, salud pblica, etc. Capacidad de aplicar los conocimientos en la prctica. Capacidad de resolucin de problemas. 3. Contenidos: Normas de Bioseguridad. Preparacin de Medios de Cultivo 4. Metodologa: La metodologa a usar ser nicamente prctica, cada alumno procesara su propia muestra y al final de la prctica observara sus propios cromosomas. 5. Definiciones: 5.1. MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo celular son compuestos que contienen: Aminocidos, vitaminas y cofactores, enzimas y coenzimas, sales, iones, indicadores de pH. Todo lo necesario para que la clula pueda dividirse in vitro. Existen distintos medios de cultivo los cuales se seleccionaran dependiendo del tipo de muestra o tipo de clula a cultivar y lograr que estos respondan adecuadamente con un crecimiento celular, as tenemos: a. MEDIO McCoy's 5 MODIFIED: Utilizado con ms frecuencia para Sangre perifrica (Linfocitos). Cultivo de Mdula sea b. MEDIO Tc 199: Utilizado en condiciones especiales Deficiencia de cido flico.

Para el estudio de Cromosoma X frgil. Utilizado tambin para el cultivo de sangre perifrica (Linfocitos). c. MEDIO Ham F10 o Ham F12: Utilizado con ms frecuencia para: Cultivo de piel. Cultivo inicial de lquido amnitico (clulas fetales) Cultivo de tumores (clulas neoplsicas) d. MEDIO RPMI 1640: Utilizado para: Sangre perifrica (Linfocitos) Cultivo de tumores (clulas neoplsicas) e. MEDIO DE CULTIVO CHANG B + CHANG C: Utilizado para: Cultivo de vellosidades coriales. Cultivo de liquido amnitico (clulas fetales) Cultivo de tumores (clulas neoplsicas) f. MEDIO AMNIOMAX: Utilizado para: Cultivo de vellosidades coriales. Cultivo de liquido amnitico (clulas fetales) 5.2. SUPLEMENTOS: Adems del medio de cultivo base las clulas requieren para su crecimiento y divisin celular de suplementos, los cuales sern utilizados dependiendo del tipo de clulas que se desea cultivar. As tenemos: a. SUERO BOVINO FETAL (SBF): Se utiliza a diferentes concentraciones: Para el estudio de X frgil al 5% Para Cultivo de Sangre Perifrica y cultivo de Medula sea al 20%. Para Cultivo de Liquido Amnitico (clulas fetales) al 30%. b. PENICILINA + ESTREPTOMICINA: utilizado como antibitico para impedir la contaminacin bacteriana. c. FUNGIZONA: Utilizado como antimictico en caso que fuera necesario. d. L - GLUTAMINA: Utilizado para mejorar el crecimiento celular. e. FITOHEMAGLUTININA (PHA): Utilizado solo en caso de cultivo de sangre perifrica (linfocitos) como un estimulante mitognico. 5.3. PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Este procedimiento se sigue cuando el Medio de Cultivo base (McCOY'S 5A Modified, RPMI 1640, F1O, F12, etc.) est en polvo. a. Pesar la cantidad de gramos de medio a preparar. Ejemplo: Preparacin del Medio McCOY's 5A Modified. Pesar 12gr Para un volumen de 1000ml. b. Disolver lo pesado en el volumen respectivo de agua bidestilada y agitar en un vortex por 10 minutos o agitar manualmente. c. Se pesa Bicarbonato de Sodio CO3HNa. Cada medio de cultivo requiere una cantidad adecuada de CO3HNa. Ver lista de preparacin de reactivos. d. Se adiciona el CO3HNa al frasco y seguir con la agitacin. e. Se adiciona el Suero Bovino Fetal al medio en la concentracin necesaria para cada cultivo. Ej.: Para 1000ml McCOY's se le adiciona 250ml (SBF 20%). f. Adicionar al medio 2cc de Penicilina + Estreptomicina por cada 100ml de medio a preparar y continuar con la agitacin por 5 minutos. g. Ajustar el pH del medio a 7.0 0.2 utilizando HCl 1N o OHNa 1N. Generalmente se utilizan los medios a este pH, pero en algunos casos como cultivo de clulas fetales (LA) se usa pH cido 6.0 0.2. h. Para el caso de cultivo de Sangre (linfocitos) se adicionar la PHA tipo M en proporcin de 2cc/100ml de medio preparado. Se recomienda adicionar la PHA despus de esterilizado el medio y en el momento de su uso.

i. La esterilizacin del Medio de Cultivo: Se realiza solamente por filtracin al vaco utilizando Filtros Millipore de 0.22m. j. Control de Esterilidad: Una vez filtrado todo el medio se recomienda alicuotar en frascos de 50ml o 100ml y se controla la esterilidad colocando los frascos en estufa a 370C por 24 a 48hrs. NOTA: Si el Medio cambia de color (amarillo) o se observa una turbidez o flculos es mejor desechar los frascos porque probablemente estn contaminados. k. Finalmente, los medios de cultivo se guardan en congelacin a -4.0 o -20.0 hasta su uso. Los medios de cultivo, reactivos y colorantes debern prepararse de acuerdo a como est indicado para cada tipo de cultivo. Se deber realizar la siembra con la mayor esterilidad posible. No debern ser modificados los tiempos o rangos de centrifugacin ni las temperaturas incubacin inadecuadamente. Deber tenerse en cuenta que son muchas las causas que interfieren con el normal desarrollo de la mitosis y que incluso producen alteraciones cromosmicas. Estos agentes interferentes pueden ser de naturaleza fsica como los rayos X, la Luz Ultravioleta, cambios bruscos de temperatura, campo magntico u ondas sonoras.

6. CUESTIONARIO:

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ESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA CITOGENETICA CURSO PRCTICO PRACTICA Nro 4 CULTIVO DE LINFOCITOS

1. Introduccin: Para el estudio Citogentico es necesario que las clulas estn en divisin celular (Mitosis) ya que los cromosomas slo podrn ser analizados, de acuerdo a su morfologa y patrn de bandas, cuando las clulas estn en el estadio de metafase. Por ello aprenderemos la metodologa para la obtencin de metafases a partir de un Cultivo de Sangre Perifrica (Linfocitos), para luego hacer la observacin directa de los cromosomas 2. Competencias: Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas que los pueden servir para integrarse en grupos de investigacin de Servicios de Gentica de Hospitales, institutos de investigacin, salud pblica, etc. Capacidad de identificacin y diferenciacin cromosomica. Capacidad de aplicacin e implementacin en un Laboratorio 3. Contenidos: Toma de muestra y Normas de Bioseguridad. Medios de Cultivo Ciclo Celular. 4. Metodologa:

La metodologa a usar ser nicamente prctica, cada alumno procesara su propia muestra y al final de la prctica observara sus propios cromosomas.
5. Procedimiento: 5.1 TOMA DE LA MUESTRA:

Se obtiene 5ml de sangre venosa teniendo en cuenta todas las medidas de bioseguridad, con una jeringa previamente cargada con 0.1 ml de heparina sdica

Tomada la muestra se deja la jeringa en posicin vertical con la aguja hacia abajo el tiempo necesario para que sedimente el paquete globular
5.2 SIEMBRA DE LA MUESTRA: Se elimina el paquete globular de la jeringa, dejndose la interfase entre el paquete globular y el plasma, donde se encuentra la mayor cantidad de glbulos blancos que se utilizaran para la siembra.

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Se adiciona al frasco de cultivo 1 a 1.5ml de la muestra (plasma + elementos celulares). Mezclar suavemente y cerrar hermticamente el frasco de cultivo. Se deja en incubacin en una estufa a 37oC por 72 horas. Todo el procedimiento de la siembra se debe realizar en absoluta esterilidad, diariamente se debe de mezclar el frasco de cultivo y observar si hay cambios de color del medio o turbidez que nos indicara una probable contaminacin. 5.3 COSECHA DE LA MUESTRA: Cumplida las 72 horas se saca el frasco de cultivo de la estufa y se agregar 100l de Colchicina al 0.1gr/ml. Mezclar suavemente e incubar en estufa a 37C por 50 minutos.

Centrifugar a 1000rpm por 10min. Luego utilizando una pipeta Pasteur, decantar o eliminar el sobrenadante y homogenizar el sedimento o Pellet..
Luego agregar 6ml de Cloruro de Potasio 0.075M (solucin Hipotnica) y agitar bien el Pellet usando la pipeta Pasteur por 2 3 minutos. Se colocar el tubo en la estufa a 37oC durante 10 minutos. NOTA: El tiempo de exposicin en la solucin Hipotnica no deber exceder en ningn caso ms de 15minutos. Sacar el tubo de la estufa y agregar de 5 a 8 gotas de fijador Carnoy (recin preparado), para detener la accin de la solucin Hipotnica. Mezclar suavemente usando una pipeta Pasteur.

Luego se centrifuga a 1000rpm por 10min. Utilizando una pipeta Pasteur eliminar el sobrenadante y resuspender el Pellet. Agregar 5ml de fijador Carnoy, el 1er ml agregarlo gota a gota, el resto puede hacerse ms rpido. Utilizando una pipeta Pasteur agite y deje fijndolo por 30 minutos a To ambiente.
NOTA: En este paso puede dejarse fijando el cultivo por 24h (o ms tiempo si fuera necesario) a To de refrigeracin. Luego se centrifuga a 1000rpm por 10min y se procede con los siguientes pasos. Eliminar el sobrenadante y resuspender el Pellet usando una pipeta Pasteur. Se adicionar 5ml de fijador y nuevamente centrifugar a 1000 RPM. Se repite este paso 3 veces a manera de lavados con fijador. El Pellet obtenido finalmente se debe resuspender con 1 a 2 ml. de fijador (esta cantidad puede variar dependiendo de la cantidad de Pellet) hasta obtener una suspensin opalescente. 5.4 PREPARACION DE LAMINAS: Las lminas portaobjetos son limpiadas previamente con una mezcla de alcohol y acetona, se almacenaran en la nevera hasta el momento de su empleo.

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La preparacin de las lminas se obtiene aadiendo 3 4 gotas de la suspensin final sobre las laminas portaobjetos a una distancia de 20 a 30cm de altura y soplar para obtener un extendido homogneo. Secar la lmina usando un mechero de alcohol.

5.5. COLORACIN Y OBSERVACIN DE LAMINAS:


Se prepara la solucin colorante de Giemsa al 4% en un Koplyns. Se introducen las lminas y dejarlo por espacio de 6 minutos. Enjuagar con agua destilada y secarlo usando papel filtro.

La metafase seleccionada deber ser una metafase aislada y que presente los cromosomas separados, no sobrepuestos, para lograr una fcil visualizacin 6. CUESTIONARIO: 6.1 Que suceder si nuestra muestra es incubada por ms de 15 minutos con la Solucin Hipotnica? 6.2 Que suceder si nuestra muestra es incubada por ms o menos tiempo con la colchicina?

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ESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA CITOGENETICA CURSO PRCTICO PRACTICA Nro 5 COLORACION CONVENCIONAL
1. Introduccin: Las primeras observaciones de cromosomas humanos se remontan a 1956, en que Tjio y Levin por primera vez determinaron que el nmero de cromosomas humanos era de 46 y no 48. Poco tiempo despus Lejeune describi la primera anomala citogentica: trisoma 21. Para ponerse de acuerdo respecto a cmo nombrar cada cromosoma, etc, se realizaron sucesivas Conferencias en los aos 1960 (Denver), 66 (Chicago), 71 (Pars) y 75 y 78 y posteriormente varios Complementos de la de Pars, conforme aparecen nuevas tcnicas, que han dejado determinado un sistema universal de nomenclatura de los cromosomas y sus regiones. La clasificacin de los cromosomas por grupos no permite identificar cada cromosoma individualmente; por eso, en la literatura de hace algunos aos se encuentran referencias a trisomas o monosomas etc. del grupo tal. A partir de la dcada del 70 se desarrollaron tcnicas que coloreaban a los cromosomas de una manera especial, en bandas.

2. Competencias: Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas que los pueden servir para integrarse en grupos de investigacin de Servicios de Gentica de Hospitales, institutos de investigacin, salud pblica, etc. Capacidad para identificar cromosomas 3. Contenidos: Ciclo celular Medios de Cultivo 4. Metodologa: La metodologa a usar ser nicamente prctica, cada alumno procesara su propia muestra y al final de la prctica observara sus propios cromosomas. 5. Procedimiento: Una vez preparadas las lminas se proceder a colorear, para la observacin de cromosomas de modo convencional. 5.1. Colocar en un Koplins Colorante Giemsa al 4% por 10 minutos 5.2. Enguadar con Agua Destilada y dejar secar 5.3. Observa al microscopio primero a 10X, 40Xy finalmente a 100X 6. Cuestionario: 6.1 Revisin de Sistema Internacional de Nomenclatura de Cromosomas

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CITOGENETICA CURSO PRCTICO PRACTICA Nro 6 TCNICA DE BANDAS

1. Introduccin: Hasta antes del ao de 1970 no era posible estudiar los cromosomas bandeados sino solo de manera convencional. Pero en la actualidad se conocen varias tcnicas de bandeo cromosmico que permiten identificar individualmente los cromosomas, lo cual facilita la identificacin de una alteracin cromosmica numrica y especialmente demostrar la presencia de alteraciones cromosmicas estructurales. 2. Competencias: Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas que les sirve para la identificacin de cromosomas. Capacidad de identificacin y diferenciacin cromosomica. Capacidad de aplicacin e implementacin en el laboratorio. Capacidad de trabajar en equipo. 3. Contenidos: Ciclo Celular. Sistema Internacional de nomenclatura cromosomica. 4. Metodologa: La metodologa a usar ser nicamente prctica, cada alumno procesara su propia muestra y al final de la prctica observara sus propios cromosomas. 5. Procedimiento: 5.1 TECNICA DE BANDAS Q: Primera metodologa utilizada, desarrollada por Casperson, en 1970 quien utilizo mostaza de quinacrina para luego observar la distinta emisin de fluorescencia cuando eran observados en el microscopio de fluorescencia (utilizando luz ultravioleta). Este mtodo fue posteriormente denominado como las tcnicas de bandas Q (Paris, Conferencia de 1971). Esta metodologa tiene como principal desventaja que la fluorescencia desaparece progresivamente por lo que la observacin y anlisis cromosmico as como la toma de microfotografa debe ser lo ms rpido posible. Las bandas obtenidas con esta tcnica son caractersticas para cada cromosoma; pero tienen mayor utilidad para demostrar la porcin distal del brazo largo del cromosoma Y, que se tie ms intensamente que los dems cromosomas. Las regiones pericentromericas de los cromosomas 3 y 4, y las regiones satlites y pericentromericas de los cromosomas acrocntricos muestran variaciones significativas conocidos como Polimorfismos o Heteromorfismos, que pueden ser demostrados con esta tcnica. Soluciones: 1. Buffer Sorensens a pH 5.6

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2. Colorante Dihidrocloruro de Quinacrina al 1% Procedimientos: 1. Se tien las lminas con el Colorante de Quinacrina por 15 - 20 minutos en oscuridad. 2. Se lavan las lminas con el Buffer Sorensen's. 3. Se monta con una laminilla cubreobjetos con el Buffer. Examinar al microscopio de fluorescencia utilizando una luz de longitud de onda de 450 550nm 5.2 TECNICA DE BANDAS G: Es la ms utilizada en el Laboratorios de Citogentica para el anlisis rutinario de los cromosomas, esta tcnica es descrita o conocida como GTG (Bandas G por tripsina usando Giemsa). Un rol directo de la tincin con Giemsa es producir bandas G (Mc Kay, 1973; Shuh et al, 1975). Clark y sus colegas (Clark y Felsenfeld, 1975) sugirieron que las Histonas ricas en argininas estn involucradas en las bandas GTG y no tanto la prdida de DNA y las protenas de los cromosomas, durante el tratamiento con la tripsina. Esta hiptesis que diferencia entre bandas G positivas (oscuras) y bandas G negativas (claras) puede ser debido a la distribucin de las protenas cromosmicas y el DNA. Tambin se ha sugerido que las bandas G positivas son relativamente ricas en protenas disulfuro, mientras que las bandas G negativas contienen sulfhidrilos. Soluciones: 1. Solucin Tripsina 1% 2. Solucin Salina Fisiolgica 3. Colorante Giemsa 4% Procedimientos: 1. Se coloca en Bao Mara a 37 oC el frasco Nro 1 de Solucin de tripsina 1% (5ml de Tripsina + 22.5 Buffer Fosfato + 22.5m de SSF) 2. Se colocan las lminas con la preparacin cromosmica (menos de 1 semana) en el frasco Nro 1 por 10 segundos.

3. Se enjuaga las lminas en el frasco Nro 2 de Solucin salina fisiolgica. 4. Se colocan las lminas en el frasco Nro 3 de Colorante Giemsa 4% por 10 minutos.
5. Lavar con agua corriente y Examinar al microscopio

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5.3 TECNICA DE BANDAS R: El principio bsico de esta tcnica es el tratamiento de las lminas a altas temperaturas en varios buffer, seguido por la tincin con Acridina Orange (RFA) o en Giemsa (RHG, bandas R, por calor usando Giemsa). Las bandas que produce est tcnica en los cromosomas humanos son el reverso de las bandas G o bandas Q, es decir que las bandas claras en Q o G son bandas oscuras en R y viceversa. (Dutrillanx and Lejeune 1971; Sehested, 1974; Bobrow and Madan, 1973). Una de las ms importantes ventajas de la Tcnica de bandas R, es que las regiones telomricas de los cromosomas son teidas, a diferencia de las Tcnicas bandas Q y G en las que no son tan claras. El mecanismo de las bandas reversas no esta totalmente conocido. (Coming's 1978). El tratamiento con calor induce denaturacin de las protenas cromosmicas as como de las secuencias del DNA ricas en nucletidos A-T, mientras que el DNA rico en G-C de las bandas R en una configuracin nativa (SUMMER 1982). Coming s (1978) detalla que a temperaturas altas el DNA rico en A-T de las bandas G es denaturada y parcialmente extrada mientras que el DNA nativo de las bandas R no lo es.

5.4 TECNICA DE BANDAS C: La tcnica de bandas C produce una tincin selectiva de la Heterocromatina constitutiva. Estas bandas estn localizadas en la regin pericentromerica de los cromosomas humanos. El mtodo original descrito por Arrighi y Hsu (1971) involucra primero un tratamiento con lcali, (OH)Na, para denaturar el DNA Cromosmico y subsiguiente incubacin en una Solucin Salina. Posteriormente se describe un mtodo por SUMMER (1972) en la que el lcali usado es el (OH) 2Ba. Ambos mtodos producen un patrn caracterstico similar de bandas C. El tratamiento de denaturacin con el lcali (OH) 2Ba es crtico y debe ser ptimo para obtener mejor calidad bandas C. La duracin del tratamiento depende de la edad (vejez) de la preparacin cromosmica y del tejido de origen. Un tratamiento inadecuado con lcali produce una pobre diferenciacin de bandas C, mientras que un tratamiento excesivo resulta en la prdida de la morfologa cromosmica. Las bandas C requieren de dos pasos sucesivos para la prdida del DNA cromosmico, primero una depurinacin y denaturacin sucesiva durante el tratamiento con un cido (HCl) y un lcali (Ba(OH) 2). La denaturacin del DNA es seguida de una remocin de los pequeos fragmentos y eliminacin de ellos durante la incubacin en la solucin 2xSSC. La principal aplicacin de la tcnica de bandas C es para demostrar la variacin de tamao de la regin de Heterocromatina Constitutiva presente en las regiones pericentromrica de los cromosomas, en especial de los cromosomas 1, 9, 16 y los brazos largos del cromosoma Y. Estas variaciones constituyen los llamados Polimorfismos. Adems esta tcnica es til para demostrar la presencia de una inversin pericentromerica.

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Bandas C

6. Cuestionario:

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CITOGENETICA CURSO PRCTICO PRACTICA Nro 7 SISTEMA DE NOMENCLATURA CROMOSOMICA

1. Introduccin: Cada cromtide de un cromosoma est formada por una molcula de ADN en un soporte de protenas. La cromtide est constituida por cromatina; que es el conjunto del ADN con las protenas de soporte, formadas fundamentalmente por histonas y otras.

Los cromosomas cambian ligeramente de forma segn la etapa de la divisin celular; son ms alargados en profase y alcanzan el mximo de condensacin en la metafase; por lo cual es el momento ideal para observarlos.
En esa etapa podemos observar que cada cromosoma tiene una zona que es como una constriccin, y se llama el centrmero (constriccin primaria). El centrmero determina en el cromosoma los brazos cortos (p) y los brazos largos (q). 2. Competencias: Los alumnos adquirirn conocimientos sobre el manejo de tcnicas citogenticas que les sirve para la identificacin de cromosomas. Capacidad de identificacin y diferenciacin cromosomica. Capacidad de aplicacin e implementacin en el laboratorio. Capacidad de trabajar en equipo. 3. Contenidos: Ciclo Celular. Sistema Internacional de nomenclatura cromosomica. 4. Metodologa:

La metodologa a usar ser nicamente prctica, cada alumno procesara su propia muestra y trabajara con fotografas al final de la prctica identificara cada uno de los cromosomas.
5. Definiciones: Segn la posicin del centrmero, los cromosomas se clasifican en:

Metacntricos: el centrmero se localiza a mitad del cromosoma y los dos brazos presentan igual longitud. Submetacntricos: la longitud de un brazo del cromosoma es algo mayor que la del otro. Acrocntrico: un brazo es muy corto (p) y el otro largo (q). Telocntrico: slo se aprecia un brazo del cromosoma al estar el centrmero en el extremo (este tipo de cromosomas no se encuentran en el cariotipo humano).

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Los pares cromosmicos se ordenan de forma decreciente de tamao, y luego se clasifican en grupos, de acuerdo al tamao y a la ubicacin del centrmero. Estos grupos se nombran con las letras: A, B, C, D, E, F, G. La representacin ordenada de los cromosomas constituye el cariotipo.

Grupo A: Metacntricos grandes. Cromosomas 1, 2, 3, excepto el 2, el cual es un cromosoma submetacntrico grande. Grupo B: Submetacntricos grandes. Cromosomas 4 y 5. Grupo C: Submetacntricos medianos. Los cromosomas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y el cromosoma X Grupo D: Acrocntricos medianos. Cromosomas 13,14 y 15, presentan satlites en sus brazos cortos. Grupo E: Submetacntricos pequeos. Los cromosomas 16, 17, 18, Grupo F: Metacntricos pequeos. Los cromosomas 19 y 20. Grupo G: Acrocntricos pequeos. Los cromosomas 21 y 22 y el cromosoma Y

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5.1 ANOMALAS ESTRUCTURALES DE LOS CROMOSOMAS

Deleccin: Cuando se pierde un fragmento de cromosomas. Puede ser Terminal o intersticial.

Translocacin: Cuando hay cambio de posicin de un fragmento, el cual va a parar a otro cromosoma, generalmente implica una ruptura en cada cromosoma. Recproca: Cuando hay intercambio de fragmentos entre dos cromosomas; Robertsoniana: Unin entre los brazos largos de dos cromosomas acrocntricos. Se dice que una translocacin es balanceada o equilibrada

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cuando no hay prdida ni ganancia de material gentico en la misma (las Robertsonianas se consideran balanceadas).

Inversin: Implica dos rupturas dentro del cromosoma. Puede ser pericntrica o paracntrica, segn el segmento involucrado comprenda o no al centrmero. Es anomala balanceada, pero, mediante el fenmeno de entrecruzamiento desigual, puede originar gametos con cromosomas que contengan regiones duplicadas o faltantes.

Duplicacin: Es un fenmeno ms difcil de explicar; cuando no ha sido consecuencia de una inversin en cromosomas paternos, probablemente se
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debe a translocacin entre dos cromosomas homlogos, durante la meiosis que origin uno de los gamentos paternos o maternos. La duplicacin puede ser en serie o en espejo.

Cromosoma en anillo: Se origina por ruptura en ambos extremos del mismo cromosoma.

5.2 NOMENCLATURA EN ANOMALIAS ESTRUCTURALES DE LOS CROMOSOMAS De acuerdo a la Conferencia de Pars (1971) y posteriores (hasta ISCN 1995) hay dos sistemas de nomenclatura: El breve y el detallado. El breve solamente indica cules son los cromosomas involucrados y los puntos de ruptura de un rearreglo. El detallado describe cada uno de los cromosomas resultantes. SIMBOLOS: p :: chi del dic brazo corto de...... hasta Ruptura y unin quimera delecin dicntrico q : cen mos der cromos. fra brazo largo ruptura centrmero mosaico derivado lugar frgil

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dup i inv mat r rob add

duplicacin dir directo isocromosoma mar cromosoma marcador inversin ins insercin de origen materno pat de origen paterno anillo t translocacin translocacin robertsoniana ter telmero material adicional de origen desconocido

Delecin terminal 46,XX,del(8)(p12) 46,XX,del(8)(qterp12): Delecin intersticial 46,XX,del(8)(q21q23) 46,XX,del(8)(pter21::q23qter) Isocromosoma del brazo largo 46,X,i(X)(q10) Isocromosoma del brazo corto 46,XY,i(5)(p10) Inversin pericntrica 46,XY,inv(4)(p15q13) 46,XY,inv(4)(pterp15::q13p15::q13qter) Inversin paracntrica 46,XY,inv(13)(q13q32) 46,XY,inv(13)(pterq13::q32q13::q32qter) Cromosoma en anillo 46,XX,r(18)(p11q22) 46,XX,r(18)(p11q22) Translocacin recproca 46,XY,t(2;8)(p13;q12) 46,XY,t(2;8)(2pter2p13::8q128pter;2qter2p13::8q128qter) Trisoma y monosoma parciales por herencia de cromosomas derivados 46,XY, der(8)t(2;8)(p13;q12)pat 46,XY, der(8pter8q12::2p132pter)pat Translocacin robertsoniana balanceada 45,XX,der(14;21) (q10;q10) 45,XX,der(14;21)(14qtercen21qter) Translocacin robertsoniana desbalanceada 46,XX,+13,der(13;14)(q10;q10)

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46,XX,+13,der(13;14)(13qter13q10::14q1014qter)

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