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INFORME N 01 DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS

I.-Resultados e interpretacin: Se armo el siguiente sistema:

TUBOS COMPONENTES (en ml) Amilasa al 1% NaOH 1N HCl 3N cido Tricloro actico 20% Sulfato de Cobre al 20% Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 I II III IV V VI 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.4 -

2.4 -

2.4 -

2.4 2.4

2.4 -

Se observ todos los cambios producidos, los cuales indicamos a continuacin: Tubo I: Luego de verter 1 ml de amilasa al 1% al tubo (con ayuda de la pipeta) se agreg Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6, puesto que cada enzima acta a un PH determinado ( normalmente entre 6-8, superado este intervalo tiende a desnaturalizarse e inactivarse). Al utilizar esta sustancia amortiguadora (buffer fosfato) nos permitir, que la enzima no se desnaturaliza. Tubo II: Una vez vertida la amilasa al 1% , posteriormente se agreg NaOH 1N (con ayuda de la pipeta), este por ser una base fuerte tender a producir la desnaturalizacin de la enzima (amilasa) por lo cual no actuar. No se observa cambio de color de la solucin. Tubo III: Luego de verter amilasa, pasamos a agregar HCl 3N ( con ayuda de la pipeta), al ser este un cido fuerte va a alterar la conformacin de la amilasa y esta tender a desnaturalizarse; sin embargo no presenciamos cambio de color de la solucin. Tubo IV: Al haber ya agregado amilasa, procedimos a verter 2.4 ml de Ac. Tricloro actico 20 % (con la pipeta), el cual siendo un cido dbil, proceder a desnaturalizar a la enzima (amilasa).

Tubo V: A este tubo con amilasa se le agrega sulfato de cobre al 20%( utilizando la pipeta), el cual por ser una sal pesada generar un cambio en la enzima. Se observ que este tubo si cambio de color, y se torn un color celeste debido a la presencia del cobre. Tubo VI: Luego de agregar la amilasa al 1% al tubo (con la pipeta) se agreg Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6, siendo esta una sustancia amortiguadora no permite la desnaturalizacin de la enzima. Presenta las mismas caractersticas del tubo 1 debido que se utilizaron los mismos reactivos. No present cambio de color. Al finalizar todo el sistema A, se dej los 5 primeros tubos del sistema en reposo por 10 minutos a la temperatura ambiente. El tubo restante (tubo VI) se coloc en un bao de agua hirviendo tambin por 10 minutos. Durante este lapso se construy el sistema B:

Uso del sustrato almidn, este es un homopolmero de la glucosa:

TUBOS COMPONENTES (en ml) I II III IV V VI

Almidn al 1.0% en solucin 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 acuosa Buffer fosfato 0.1 M / pH 6.6 NaCl 0.15 M Agua Destilada 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

En este sistema se utilizaron 6 tubos ms, a los cuales se les agreg los reactivos indicados en el recuadro del sistema correspondiente: Almidn al 1.0% en solucin acuosa, Buffer fosfato 0.1 M / pH 6.6 (darel ambiente adecuado para que acte la enzima), NaCl 0.15 M (el cloro (cofactor) ser quien active la enzima), Agua Destilada, a todos los tubos se le agreg el mismo volumen de cada reactivo. Luego se pre incub los tubos a una temperatura de 37 C, favoreciendo que el sustrato tenga una actividad normal ya que la temperatura es la misma que la temperatura corporal. Esto se realizo por un lapso de dos minutos. Posteriormente se agreg 0.6 ml. de la enzima tratada, de cada uno de los tubos del primer sistema A a su correspondiente tubo del ltimo sistema B .Una vez realizado esto, se dej incubar nuevamente a 37 C por un transcurrir de 20 minutos. Se observ que todos los tubos se tornaron de un color transparente a excepcin del tubo V, el cual present un precipitado y un sobrenadante de color celeste.

A continuacin se arm el sistema C:

TUBOS COMPONENTES (en ml) HCl 0.05N I 5 II 5 III 5 IV 5 V 5 VI 5

De los tubos de reaccin del 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 sistema B, agregar: Solucin yodada 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Al ya tener los tubos en donde estn actuando la enzima (amilasa) del sistema A con el sustrato (almidn) del sistema B, se procede a verter el volumen de cada reactivo indicados en el recuadro del sistema C segn corresponda al nmero de tubo. Se observ diferencias en la actividad de la enzima, debido a la cantidad de sustrato residual formado; la cual se reconoci por ayuda de la solucin yodada. Como resultado se observ que el primer tubo nos mostr un color amarillento, lo cual es signo que la enzima no ha sufrido ningn tipo de cambio (desnaturalizacin) y la gran parte del sustrato se ah convertido en producto. En cambio los tubos restantes (II-VI) presentaron un color azul marino oscuro, lo cual nos indica que gran cantidad de sustrato no se ah activado con la enzima (no hubo reaccin). II.- Conclusin: Con esta prctica se a demostrado como es que la enzima (en este caso amilasa) tiene que estar en un medio adecuado para poder actuar, y por el mismo hecho de ser esta una protena tiende a desnaturalizarse fcilmente si son expuestos a factores como : PH fuera del rango 6-8, temperatura, cidos y bases tanto dbiles como fuerte.

CUESTIONARIO 1.-Cul es el mecanismo de accin de las sales pesadas sobre la protena (enzima)? Las sales pesadas actan sobre las enzimas desnaturalizndolas. En el caso de la prctica la sal pesada que se utiliz fue el So4Cu y la enzima fue la amilasa, al reaccionar origina que de la sal se desprenda un ion cprico el cual une el coo- de la enzima a los grupos de las cadenas laterales originando la ruptura de los puentes salinos. 2.-Cmo actan los cidos y bases fuertes sobre la protena (enzima)? Ejemplos La exposicin de los cidos y bases fuertes a la enzima tienden a desnaturalizar a la protena. Estas tienden a precipitarse de la solucin acuosa por la adicin de ciertos cidos y bases.

Ejemplo: cidos fuertes: disminuyen el PH: HCl, ATCA Bases fuertes: aumentan el PH: NaOH 3.-Cmo acta la temperatura sobre la estructura proteica de la enzima? Con la accin de la temperatura elevada, tambin aumenta la energa cintica de las molculas que conforman la enzima, desorganizando la envoltura acuosa de la enzima y desnaturalizndola. El aumento de temperatura tambin destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la protena, de tal forma que el interior hidrfobo interacciona con un medio acuoso y se produce la precipitacin de la enzima desnaturalizada.

4.-Cmo repercute la modificacin de la estructura proteica, producida por agentes fsicos y qumicos, sobre la actividad enzimtica? La modificacin de la estructura de las protenas (desnaturalizacin), ocasiona que esta enzima se inactive y no tenga una actividad enzimtica normal. Algunos agentes son mas desnaturalizantes que otros, por ende la actividad de la enzima depende del agente que la desnaturalice. Por ejemplo la enzima estar mas inactivada si es sometido a altas temperaturas.