INSTITUTO TECNOLOGICO DE ESTUDIOS DE OCCIDENTE

Profesor: Ral Snell Castro Manual de Laboratorio para Microbiologa Aplicada

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Manual de Laboratorio para Microbiologa Aplicada

El manual de laboratorio para la asignatura de Microbiologa Aplicada est formado por una serie de instrucciones o Trminos de Referencia, que guan al alumno para el desarrollo de un Proyecto de Investigacin en al mbito de la microbiologa. Tal proyecto tiene como propsito facilitar al alumno el aprendizaje de las principales estrategias, metodologas y tcnicas de manipulacin de los microorganismos; as como entrenarlo en el desarrollo de proyectos y buenas prcticas de laboratorio en el mbito microbiolgico.

Sesin 1
Medidas de bioseguridad y preparacin de materiales esterilizados
El propsito de la sesin 1 en el Laboratorio de Microbiologa aplicada es asignar a cada equipo de laboratorio un espacio de trabajo, una gaveta para guardar el material, explicar las normas de bioseguridad a seguir en dicho laboratorio y realizar la preparacin de material esterilizado para la manipulacin de microorganismos. ACTIVIDADES DE INVESTIGACIN PREVIAS A LA SESION: Responde las preguntas siguientes, ya que las respuestas sern comentadas y evaluadas durante la sesin. 1. Qu es un asa de siembra y cul es el material del filamento metlico? 2. Qu es una autoclave y cules son las condiciones de presin o temperatura y tiempo usadas durante el procedimiento del autoclaveado de material? 3. Qu es un medio de cultivo microbiano? 4. Describe los siguientes tipos de medio de cultivo. Medio qumicamente definido: Medio complejo: Medio enriquecido: Medio slido: Medio lquido: Medio diferencial: Medio selectivo:

5. Qu tipo de compuesto es el agar usado en los medios de cultivo slidos y de dnde se obtiene o extrae?

NORMAS DE BIOSEGURIDAD A SEGUIR POR CADA EQUIPO Las Normas de seguridad a seguir en el laboratorio de Microbiologa aplicada son aquellas indicadas para los laboratorios de qumica del ITESO y las indicadas a continuacin para la manipulacin de microorganismos. Normas de asepsia: 1. Al llegar al laboratorio los estudiantes deben dejar sus pertenencias en la mesa situada a la entrada del laboratorio. Posteriormente, los integrantes del equipo se deben poner sus batas blancas de manga larga, las cuales deben estar limpias y sin agujeros. NOTA: Siempre se deben lavar las manos con jabn al iniciar la sesin y limpiar la mesa de trabajo asignada con etanol al 70 %, que es provedo por el Profesor. 2. Siempre que alguna parte de su piel u ojos tengan contacto con material biolgico, se debe dirigir con el Profesor, quien le indicar las medidas de limpieza a seguir inmediatamente. 3. Al finalizar la sesin se debe limpiar la mesa de trabajo y cualquier otra superficie del laboratorio utilizada para la manipulacin de microorganismos con etanol al 70 % y lavarse las manos con jabn. Normas de seguridad durante el uso de mecheros: 1. Cuando se usen mecheros, se debe solicitar al Profesor la abertura de la llave principal de gas del laboratorio. 2. Cada equipo contar con un encendedor de gas para encender los mecheros, los cuales nunca deben ser encendidos con encendedores comunes, cerillos o chisperos. 3. Antes de encender un mechero se debe verificar que la llave de gas este cerrada para evitar un flamazo accidental. Si el mechero no enciende, cierre la llave de gas y luego manipule las vlvulas del mechero para solucionar el problema. NOTA: Nunca manipule las vlvulas del mechero mientras est abierta la llave del gas y nunca acerque el rostro al mechero, la distancia segura entre el mechero y su rostro debe ser del tamao de la longitud de su brazo, es decir, debe tener el brazo extendido y el rostro alejado del mechero cuando lo encienda. 4. Al finalizar el uso de los mecheros se debe verificar que las llaves de gas utilizadas estn cerradas correctamente.

Normas de seguridad sobre el comportamiento en el laboratorio: 1. No se debe jugar durante las sesiones del laboratorio, ni colocar bebidas, alimentos y utensilios escolares de uso en otras asignaturas sobre las mesas de trabajo. En la mesa de trabajo solo deben colocar la bitcora exclusiva de Microbiologa aplicada y su material de uso en microbiologa, las plumas, calculadoras y otros tiles escolares se deben guardar en las bolsas de la bata. 2. En caso de duda sobre el manejo de un equipo o tcnica de laboratorio se debe solicitar asesora al Profesor. INSTRUCCIONES PARA INICIAR EL TRABAJO DE INVESTIGACIN: Al inicio de esta sesin el Profesor indicar a cada equipo su lugar de trabajo para todas las sesiones de prctica. Despus asignar una gaveta a cada equipo, que ser destinada para guardar el material bsico y suplementario de microbiologa. El material bsico para cada equipo y la llave de la gaveta asignada previamente por el Profesor deben solicitarse en el almacn durante esta sesin, este material se devolver al almacn hasta la ltima sesin del laboratorio. A continuacin se enlista el material bsico, que se usar durante todas las sesiones del Laboratorio de Microbiologa aplicada. Material bsico de Microbiologa a solicitar por cada equipo: Un mechero Fisher. Dos mecheros de Bunsen. 10 tubos de ensayo de 15 mL con rosca. 6 tubos de ensayo de 10 mL con rosca. Una esptula grande para pesar cantidades mayores a un gramo. 2 frascos para medio de cultivo de un litro. 2 frascos para medio de cultivo de 500 mL. 1 frascos para medio de cultivo de 100 mL. Un vaso de precipitados de plstico para usar en autoclave de un litro. Un vaso de precipitados de plstico para usar en autoclave de 500. Un encendedor con cartucho de gas. Posteriormente, el Profesor entregar a cada equipo el material de Microbiologa suplementario, que se enlista a continuacin. Material suplementario abastecido por el Profesor a cada equipo: Tres pipetas serolgicas esterilizadas de 1 o 2 mL. Dos pipetas serolgicas esterilizadas de 5 mL. Dos pipetas serolgicas esterilizadas de 10 mL. Una asa de siembra. Tres vasos de plstico para pesar sustancias.
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NOTA IMPORTANTE: Cada equipo de traer un plumn permanente o indeleble de punto ultrafino negro o azul, tijeras escolares y un jabn lquido para manos. Los proyectos de investigacin a desarrollar requieren de material especfico, que se usar en cada proyecto, este material se pedir en el almacn. Por otra parte, si se requiere de material suplementario adicional, ste ser provedo por el Profesor. Cuando cada equipo tenga el material bsico y suplementario en la gaveta se proceder a la preparacin de medios de cultivo, que sern esterilizados por autoclaveado. La preparacin de medios de cultivo implica que el uso de una probeta de 500 o 1000 mL, un recipiente de aluminio de 500 mL y una parrilla elctrica, que se deben pedir en el almacn junto con el material bsico de microbiologa. PRIMERA ACTIVIDAD DE LA SESIN 1: Preparar para esterilizar por autoclaveado un frasco para medio de cultivo de 1000 mL con 350 mL de Agar Nutritivo. Este medio de cultivo se prepara siguiendo las instrucciones o modo de preparacin indicadas en el frasco del Agar Nutritivo donde se menciona la cantidad de gramos que se pesan para preparar un litro (1000 mL) de medio de cultivo. El proceso para la preparacin del medio de cultivo es el siguiente: 1. Primero se realiza el pesado del medio de cultivo calculando la cantidad de medio deshidratado en base al volumen de medio que se va a preparar, que en este caso es de 350 mL. Entonces, si necesitas preparar 350 mL de medio se debe hacer una regla de tres con los datos indicados en el modo de preparacin del frasco de Agar Nutritivo para calcular la cantidad de medio de cultivo que se debe pesar. 2. Despus, se agrega 350 mL de agua destilada en el frasco de 1000 mL usando una probeta para medir dicho volumen y posteriormente se agrega el medio de cultivo pesado. En seguida, se cierra y agita el frasco con la mano hasta disolver el medio de cultivo, a este proceso se le llama hidratacin. 3. Posteriormente, el medio de cultivo hidratado se coloca en un recipiente de aluminio de 500 mL y se calienta en una parrilla elctrica hasta hervir el medio durante un minuto, a este proceso se le llama clarificacin. El medio de cultivo clarificado se vierte en el frasco de 1000 mL y se prepara para el proceso de autoclaveado (Ver Tercera Actividad). SEGUNDA ACTIVIDAD DE LA SESIN 1: Preparar para esterilizar por autoclaveado un frasco para medio de cultivo de 1000 mL con 350 mL de Agar Dextrosa y Papa. Este medio de cultivo se prepara siguiendo las instrucciones o modo de preparacin indicadas en el frasco del Agar Dextrosa y Papa donde se menciona la cantidad de gramos que se pesan para preparar un litro (1000 mL) de medio de cultivo. El proceso para la preparacin de este medio de cultivo es idntico al indicado en la Primera actividad pero usando los datos sobre el modo de preparacin del frasco de Agar
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Dextrosa y Papa para calcular la cantidad de medio que se debe pesar, el resto del proceso, es decir, hidratacin y clarificacin del medio, se realiza de la misma manera hasta preparar este medio para el proceso de autoclaveado (Ver Tercera Actividad). TERCERA ACTIVIDAD DE LA SESIN 1: Preparar la autoclave para el proceso de esterilizacin aadiendo un litro de agua destilada a la autoclave usando un vaso de precipitados de plstico de un litro y colocando el soporte de la autoclave cerca de dos llaves de gas con dos mecheros Fisher. Despus, colocar la autoclave sobre la mesa y meter los frascos con medio de cultivo dentro de la autoclave, estos frascos deben tener el tapn flojo o parcialmente enrroscado y sujeto con cinta masking type para evitar que el tapn se desprenda del frasco. NOTA: Nunca se deben meter los frascos cerrados porque podran explotar en el interior de la autoclave durante el proceso de esterilizacin. Finalmente, se debe cerrar la autoclave y colocarla sobre el soporte. Es importante recordar que se debe retirar la vlvula principal de la tapa de la autoclave para dejar escapar el aire del interior de la autoclave cuando sea calentada. Dicha vlvula debe colocarse en la tapa cuando se observe la salida de vapor durante el calentamiento de la autoclave. Despus de conocer y entender lo dicho sobre la vlvula principal, se deben prender los mecheros con el encendedor de gas, asegurndose que la vlvula inferior del mechero est correctamente abierta y alejando del rea de fuego del mechero cualquier parte del cuerpo para evitar alguna quemadura accidental. El proceso de autoclaveado se desarrolla de la manera siguiente: 1. Se deja calentar a la autoclave hasta que el manmetro o indicador de presin llegu a una presin de 15 lb/pulg2 o 1 Kg/cm2 o 121 C. 2. Cuando se alcance alguno de dichos valores de presin o temperatura se debe apagar uno de los mecheros Fisher y sacar el otro mechero para cerrarle la vlvula inferior hasta dejar una pequea flama que mantenga la presin o temperatura en los valores indicados en este inciso 1 cuando sea regresado este mechero debajo de la autoclave. 3. Si la presin o temperatura es menor a los valores indicados cuando se regresa el mechero Fischer, entonces se debe abrir un poco la vlvula del mechero hasta estabilizar los valores indicados de presin y temperatura durante 15 o 20 minutos, que es el perodo de duracin de la esterilizacin. 4. Cuando termine el tiempo de esterilizacin se debe apagar el mechero Fisher y llevar la autoclave a la tarja usando los guantes para sujetar material caliente. Al tener a autoclave en la tarja se debe abrir la llave del agua para verter el chorro de agua sobre la tapa de la autoclave hasta observar que el manmetro indica cero de presin y verificando con la mano una temperatura tibia en el costado de la autoclave.
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5. Finalmente, la autoclave se coloca sobre la mesa y se retira la tapa usando los guantes para sujetar material caliente. Es importante evitar que el agua sobre la tapa usada para enfriar la autoclave caiga dentro de sta al retirar la tapa porque el agua sucia podra contaminar el material esterilizado. Al retirar la tapa se debe verificar que los tapones de los frascos estn aun enrroscados a stos, si algn tapn no est enrroscado al frasco se debe buscar el tapn y colocarlo inmediatamente sobre el frasco para evitar la contaminacin del medio, se recomienda no hablar durante esta operacin para evitar que los microorganismos de la boca contaminen los medios de cultivo. En seguida, se cierran completamente todos los frascos y se colocan sobre la mesa de trabajo usando los guantes para sujetar material caliente. A cada frasco con el medio de cultivo esterilizado se le retira la cinta masking type usada para sujetar los tapones y se guarda en la gaveta hasta la siguiente sesin. Es importante mencionar, que al esterilizar soluciones por autoclaveado, el volumen mximo que debe ocupar la solucin a esterilizar es de un tercio del volumen toral del frasco contenedor; en este caso, 350 mL es menos que un tercio de 1000 mL (volumen mximo del frasco). Si no respetas esta norma se derramar la solucin durante el proceso de autoclaveado y se perder el trabajo realizado. ACTIVIDAD DE REFLEXIN: 1. Explica para qu se esterilizaron los medios de cultivo microbiano? 2. Cul es el efecto del calor y la presin sobre la esterilizacin de los materiales, es decir, hubiera sido lo mismo esterilizar los materiales con autoclave que usando una olla abierta con agua hirviendo tipo bao mara? 3. Menciona lo que aprendiste en esta sesin de prctica del Laboratorio de Microbiologa aplicada.