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INSTITUTO TECNOLOGICO DE ESTUDIOS DE OCCIDENTE

INSTITUTO TECNOLOGICO DE ESTUDIOS DE OCCIDENTE Profesor: Raúl Snell Castro Manual de Laboratorio para Microbiología

Profesor: Raúl Snell Castro

Manual de Laboratorio para Microbiología Aplicada

Manual de Laboratorio para Microbiología Aplicada

El manual de laboratorio para la asignatura de Microbiología Aplicada está formado por una serie de instrucciones o Términos de Referencia, que guían al alumno para el desarrollo de un Proyecto de Investigación en al ámbito de la microbiología. Tal proyecto tiene como propósito facilitar al alumno el aprendizaje de las principales estrategias, metodologías y técnicas de manipulación de los microorganismos; así como entrenarlo en el desarrollo de proyectos y buenas prácticas de laboratorio en el ámbito microbiológico.

Sesión 1

Medidas de bioseguridad y preparación de materiales esterilizados

El propósito de la sesión 1 en el Laboratorio de Microbiología aplicada es asignar a cada equipo de laboratorio un espacio de trabajo, una gaveta para guardar el material, explicar las normas de bioseguridad a seguir en dicho laboratorio y realizar la preparación de material esterilizado para la manipulación de microorganismos.

ACTIVIDADES DE INVESTIGACIÓN PREVIAS A LA SESION: Responde las preguntas siguientes, ya que las respuestas serán comentadas y evaluadas durante la sesión.

1. ¿Qué es un asa de siembra y cuál es el material del filamento metálico?

2. ¿Qué es una autoclave y cuáles son las condiciones de presión o temperatura y tiempo usadas durante el procedimiento del autoclaveado de material?

3. ¿Qué es un medio de cultivo microbiano?

4. Describe los siguientes tipos de medio de cultivo.

Medio químicamente definido:

Medio complejo:

Medio enriquecido:

Medio sólido:

Medio líquido:

Medio diferencial:

Medio selectivo:

5.

¿Qué tipo de compuesto es el agar usado en los medios de cultivo sólidos y de dónde se

obtiene o extrae?

NORMAS DE BIOSEGURIDAD A SEGUIR POR CADA EQUIPO

Las Normas de seguridad a seguir en el laboratorio de Microbiología aplicada son aquellas indicadas para los laboratorios de química del ITESO y las indicadas a continuación para la manipulación de microorganismos.

Normas de asepsia:

1. Al llegar al laboratorio los estudiantes deben dejar sus pertenencias en la mesa situada a la entrada del laboratorio. Posteriormente, los integrantes del equipo se deben poner sus batas blancas de manga larga, las cuales deben estar limpias y sin agujeros. NOTA: Siempre se deben lavar las manos con jabón al iniciar la sesión y limpiar la mesa de trabajo asignada con etanol al 70 %, que es proveído por el Profesor.

2. Siempre que alguna parte de su piel u ojos tengan contacto con material biológico, se debe dirigir con el Profesor, quien le indicará las medidas de limpieza a seguir inmediatamente.

3. Al finalizar la sesión se debe limpiar la mesa de trabajo y cualquier otra superficie del laboratorio utilizada para la manipulación de microorganismos con etanol al 70 % y lavarse las manos con jabón.

Normas de seguridad durante el uso de mecheros:

1. Cuando se usen mecheros, se debe solicitar al Profesor la abertura de la llave principal de gas del laboratorio.

2. Cada equipo contará con un encendedor de gas para encender los mecheros, los cuales nunca deben ser encendidos con encendedores comunes, cerillos o chisperos.

3. Antes de encender un mechero se debe verificar que la llave de gas este cerrada para evitar un flamazo accidental. Si el mechero no enciende, cierre la llave de gas y luego manipule las válvulas del mechero para solucionar el problema. NOTA: Nunca manipule las válvulas del mechero mientras está abierta la llave del gas y nunca acerque el rostro al mechero, la distancia segura entre el mechero y su rostro debe ser del tamaño de la longitud de su brazo, es decir, debe tener el brazo extendido y el rostro alejado del mechero cuando lo encienda.

4. Al finalizar el uso de los mecheros se debe verificar que las llaves de gas utilizadas estén cerradas correctamente.

Normas de seguridad sobre el comportamiento en el laboratorio:

1. No se debe jugar durante las sesiones del laboratorio, ni colocar bebidas, alimentos y

utensilios escolares de uso en otras asignaturas sobre las mesas de trabajo. En la mesa de trabajo solo deben colocar la bitácora exclusiva de Microbiología aplicada y su material de uso en microbiología, las plumas, calculadoras y otros útiles escolares se deben guardar en las bolsas de la bata.

2. En caso de duda sobre el manejo de un equipo o técnica de laboratorio se debe solicitar

asesoría al Profesor.

INSTRUCCIONES PARA INICIAR EL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN: Al inicio de esta sesión el Profesor indicará a cada equipo su lugar de trabajo para todas las sesiones de práctica. Después asignará una gaveta a cada equipo, que será destinada para guardar el material básico y suplementario de microbiología. El material básico para cada equipo y la llave de la gaveta asignada previamente por el Profesor deben solicitarse en el almacén durante esta sesión, este material se devolverá al almacén hasta la última sesión del laboratorio. A continuación se enlista el material básico, que se usará durante todas las sesiones del Laboratorio de Microbiología aplicada.

Material básico de Microbiología a solicitar por cada equipo:

Un mechero Fisher. Dos mecheros de Bunsen. 10 tubos de ensayo de 15 mL con rosca. 6 tubos de ensayo de 10 mL con rosca. Una espátula grande para pesar cantidades mayores a un gramo. 2 frascos para medio de cultivo de un litro. 2 frascos para medio de cultivo de 500 mL. 1 frascos para medio de cultivo de 100 mL. Un vaso de precipitados de plástico para usar en autoclave de un litro. Un vaso de precipitados de plástico para usar en autoclave de 500. Un encendedor con cartucho de gas.

Posteriormente,

el

Profesor

entregará

a

cada

equipo

el

suplementario, que se enlista a continuación.

material

de

Microbiología

Material suplementario abastecido por el Profesor a cada equipo:

Tres pipetas serológicas esterilizadas de 1 o 2 mL. Dos pipetas serológicas esterilizadas de 5 mL. Dos pipetas serológicas esterilizadas de 10 mL. Una asa de siembra. Tres vasos de plástico para pesar sustancias.

NOTA IMPORTANTE: Cada equipo de traer un plumón permanente o indeleble de punto ultra- fino negro o azul, tijeras escolares y un jabón líquido para manos.

Los proyectos de investigación a desarrollar requieren de material específico, que se usará en cada proyecto, este material se pedirá en el almacén. Por otra parte, si se requiere de material suplementario adicional, éste será proveído por el Profesor. Cuando cada equipo tenga el material básico y suplementario en la gaveta se procederá a la preparación de medios de cultivo, que serán esterilizados por autoclaveado. La preparación de medios de cultivo implica que el uso de una probeta de 500 o 1000 mL, un recipiente de aluminio de 500 mL y una parrilla eléctrica, que se deben pedir en el almacén junto con el material básico de microbiología.

PRIMERA ACTIVIDAD DE LA SESIÓN 1:

Preparar para esterilizar por autoclaveado un frasco para medio de cultivo de 1000 mL con 350 mL de Agar Nutritivo. Este medio de cultivo se prepara siguiendo las instrucciones o modo de preparación indicadas en el frasco del Agar Nutritivo donde se menciona la cantidad de gramos que se pesan para preparar un litro (1000 mL) de medio de cultivo. El proceso para la preparación del medio de cultivo es el siguiente:

1. Primero se realiza el pesado del medio de cultivo calculando la cantidad de medio

deshidratado en base al volumen de medio que se va a preparar, que en este caso es de 350 mL.

Entonces, si necesitas preparar 350 mL de medio se debe hacer una regla de tres con los datos indicados en el modo de preparación del frasco de Agar Nutritivo para calcular la cantidad de medio de cultivo que se debe pesar.

2. Después, se agrega 350 mL de agua destilada en el frasco de 1000 mL usando una

probeta para medir dicho volumen y posteriormente se agrega el medio de cultivo pesado. En seguida, se cierra y agita el frasco con la mano hasta disolver el medio de cultivo, a este proceso se le llama hidratación.

3. Posteriormente, el medio de cultivo hidratado se coloca en un recipiente de aluminio

de 500 mL y se calienta en una parrilla eléctrica hasta hervir el medio durante un minuto, a este proceso se le llama clarificación. El medio de cultivo clarificado se vierte en el frasco de 1000 mL y se prepara para el proceso de autoclaveado (Ver Tercera Actividad).

SEGUNDA ACTIVIDAD DE LA SESIÓN 1:

Preparar para esterilizar por autoclaveado un frasco para medio de cultivo de 1000 mL con 350 mL de Agar Dextrosa y Papa. Este medio de cultivo se prepara siguiendo las instrucciones o modo de preparación indicadas en el frasco del Agar Dextrosa y Papa donde se menciona la cantidad de gramos que se pesan para preparar un litro (1000 mL) de medio de cultivo. El proceso para la preparación de este medio de cultivo es idéntico al indicado en la Primera actividad pero usando los datos sobre el modo de preparación del frasco de Agar

Dextrosa y Papa para calcular la cantidad de medio que se debe pesar, el resto del proceso, es decir, hidratación y clarificación del medio, se realiza de la misma manera hasta preparar este medio para el proceso de autoclaveado (Ver Tercera Actividad).

TERCERA ACTIVIDAD DE LA SESIÓN 1:

Preparar la autoclave para el proceso de esterilización añadiendo un litro de agua destilada a la autoclave usando un vaso de precipitados de plástico de un litro y colocando el soporte de la autoclave cerca de dos llaves de gas con dos mecheros Fisher. Después, colocar la autoclave sobre la mesa y meter los frascos con medio de cultivo dentro de la autoclave, estos frascos deben tener el tapón flojo o parcialmente enrroscado y sujeto con cinta masking type para evitar que el tapón se desprenda del frasco. NOTA: Nunca se deben meter los frascos cerrados porque podrían explotar en el interior de la autoclave durante el proceso de esterilización.

Finalmente, se debe cerrar la autoclave y colocarla sobre el soporte. Es importante recordar que se debe retirar la válvula principal de la tapa de la autoclave para dejar escapar el aire del interior de la autoclave cuando sea calentada. Dicha válvula debe colocarse en la tapa cuando se observe la salida de vapor durante el calentamiento de la autoclave. Después de conocer y entender lo dicho sobre la válvula principal, se deben prender los mecheros con el encendedor de gas, asegurándose que la válvula inferior del mechero está correctamente abierta y alejando del área de fuego del mechero cualquier parte del cuerpo para evitar alguna quemadura accidental.

El proceso de autoclaveado se desarrolla de la manera siguiente:

1. Se deja calentar a la autoclave hasta que el manómetro o indicador de presión llegué a

una presión de 15 lb/pulg 2 o 1 Kg/cm 2 o 121 ºC.

2. Cuando se alcance alguno de dichos valores de presión o temperatura se debe apagar

uno de los mecheros Fisher y sacar el otro mechero para cerrarle la válvula inferior hasta dejar una pequeña flama que mantenga la presión o temperatura en los valores indicados en este inciso 1 cuando sea regresado este mechero debajo de la autoclave.

3. Si la presión o temperatura es menor a los valores indicados cuando se regresa el

mechero Fischer, entonces se debe abrir un poco la válvula del mechero hasta estabilizar los

valores indicados de presión y temperatura durante 15 o 20 minutos, que es el período de duración de la esterilización.

4. Cuando termine el tiempo de esterilización se debe apagar el mechero Fisher y llevar la

autoclave a la tarja usando los guantes para sujetar material caliente. Al tener a autoclave en la tarja se debe abrir la llave del agua para verter el chorro de agua sobre la tapa de la autoclave hasta observar que el manómetro indica cero de presión y verificando con la mano una temperatura tibia en el costado de la autoclave.

5. Finalmente, la autoclave se coloca sobre la mesa y se retira la tapa usando los guantes

para sujetar material caliente. Es importante evitar que el agua sobre la tapa usada para enfriar la autoclave caiga dentro de ésta al retirar la tapa porque el agua sucia podría contaminar el material esterilizado. Al retirar la tapa se debe verificar que los tapones de los frascos estén aun enrroscados a éstos, si algún tapón no está enrroscado al frasco se debe buscar el tapón y colocarlo inmediatamente sobre el frasco para evitar la contaminación del medio, se recomienda no hablar durante esta operación para evitar que los microorganismos de la boca contaminen los medios de cultivo. En seguida, se cierran completamente todos los frascos y se colocan sobre la mesa de trabajo usando los guantes para sujetar material caliente. A cada frasco con el medio de cultivo esterilizado se le retira la cinta masking type usada para sujetar los tapones y se guarda en la gaveta hasta la siguiente sesión.

Es importante mencionar, que al esterilizar soluciones por autoclaveado, el volumen máximo que debe ocupar la solución a esterilizar es de un tercio del volumen toral del frasco contenedor; en este caso, 350 mL es menos que un tercio de 1000 mL (volumen máximo del frasco). Si no respetas esta norma se derramará la solución durante el proceso de autoclaveado y se perderá el trabajo realizado.

ACTIVIDAD DE REFLEXIÓN:

1. ¿Explica para qué se esterilizaron los medios de cultivo microbiano?

2. ¿Cuál es el efecto del calor y la presión sobre la esterilización de los materiales, es decir,

hubiera sido lo mismo esterilizar los materiales con autoclave que usando una olla abierta con agua hirviendo tipo baño maría?

3. Menciona lo que aprendiste en esta sesión de práctica del Laboratorio de Microbiología

aplicada.