MORFOLOGA BACTERIANA Vamos a comenzar aclarando algunos conceptos importantes relacionados con las varias posibilidades que se nos

ofrecen cuando hablamos, sin mayor explicacin, de "morfologa bacteriana". La morfologa ultramicroscpica de las bacterias (observadas con Microscopio electrnico), nada tiene que ver con lo que, macroscpicamente, observamos en un medio de cultivo al estudiar el crecimiento de las colonias bacterianas. Ya hemos visto que las bacterias son microorganismos de estructura procariota y la mayor y ms importante diferencia con las clulas eucariotas es la ausencia en las primeras de una membrana nuclear. El grfico de la derecha nos muestra un corte en tres dimensiones en el que se aprecia la estructura de las sucesivas envolturas bacterianas, el citoplasma con sus componentes, as como los posibles apndices externos. En el esquema inferior, un corte axial de una clula bacteriana, podemos apreciar tambin la disposicin espacial de los distintos elementos que la conforman.

Microbiologa
La microbiologa es la rama de la biologa encargada del estudio de los microorganismos, seres vivos pequeos (del griego mikros "pequeo", bios, "vida" y - -loga, tratado, estudio, ciencia), tambin conocidos como microbios. Es la ciencia de la biologa dedicada a estudiar los organismos que son slo visibles a travs del microscopio: organismos procariotas y eucariotas simples. Son considerados microbios todos los seres vivos microscpicos, estos pueden estar constituidos por una sola clula (unicelulares), as como pequeos agregados celulares formados por clulas equivalentes (sin diferenciacin celular); estos pueden ser eucariotas (clulas con ncleo) tales como hongos y protistas, procariotas (clulas sin ncleo definido) como las bacterias]. Sin embargo la microbiologa tradicional se ha ocupado especialmente de los microorganismos patgenos entre bacterias, virus y hongos, dejando a otros microorganismos en manos de la parasitologa y otras categoras de la biologa.

Historia
Aunque el trmino bacteria, derivado del griego ("bastoncillo"), no fue introducido hasta el ao 1828 por Christian Gottfried Ehrenberg, ya en 1676 Anton van Leeuwenhoek, usando un microscopio de una sola lente que l mismo haba construido basado en el modelo creado por el erudito Robert Hooke en su libro Micrographia, realiz la primera observacin microbiolgica registrada de "animculos", como van Leeuwenhoek los llam y dibuj entonces. Eugenio Espejo (1747-1795) public importantes trabajos de medicina, como las Reflexiones acerca de la viruela (1785), el cual se convertira en el primer texto cientfico que refera la existencia de microorganismos (inclusive antes que Louis Pasteur) y que definira como poltica de salud conceptos bsicos de la actualidad como la asepsia y antisepsia de lugares y personas. La bacteriologa (ms tarde una subdisciplina de la microbiologa) se considera fundada por el botnico Ferdinand Cohn (1828-1898). Cohn fue tambin el primero en formular un esquema para la clasificacin taxonmica de las bacterias. Louis Pasteur (1822-1895), considerado el padre de la Microbiologa Mdica, y Robert Koch (1843-1910) fueron contemporneos de Cohn. Quiz el mayor logro de Pasteur consisti en la refutacin mediante cuidadosos experimentos de la por aquel entonces muy respetada teora de la generacin espontnea, lo cual permiti establecer firmemente a la microbiologa dentro de las ciencias biolgicas. Pasteur tambin dise mtodos para la conservacin de los alimentos (pasteurizacin) y vacunas contra varias enfermedades como el ntrax, el clera aviar y la rabia. Robert Koch es especialmente conocido por su contribucin a la teora de los grmenes de la enfermedad, donde, mediante la aplicacin de los llamados postulados de Koch, logr demostrar que enfermedades especficas estn causadas por microorganismos patognicos especficos. Koch fue uno de los primeros cientficos en concentrarse en la obtencin de cultivos puros de bacterias, lo cual le permiti aislar y describir varias especies nuevas de bacterias, entre ellas Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis.

MARCO TEORICO Las bacterias u otros microorganismos que se desarrollan en medios de laboratorio, se llaman cultivos. POBLACIONES MICROBIANAS NATURALES (CULTIVOS MIXTOS) Muchas especies de microbios habitan normalmente las diferentes partes de nuestro cuerpo, como son la cavidad bucal, conducto intestinal y la piel, en donde se encuentran en cantidades extraordinarias. De igual manera nuestro ambiente -aire, suelo y agua-, se compone de toda una diversidad de bacterias y otros microorganismos. El estudio de los microorganismos en estos hbitats exige que se conozcan los microorganismos especficos presentes. Para lograr esto es necesario aplicar tcnicas que ayuden a desenmaraar las poblaciones mixtas y complejas de microorganismos, o cultivos mixtos, y obtener cultivos puros de especies distintas y separadas. Un cultivo puro est formado de poblaciones de clulas derivadas de una sola clula. CULTIVOS PUROS El cultivo puro representa las condiciones artificiales para el desarrollo de las bacterias y otros microorganismos y las condiciones impuestas a los microorganismos mediante el manejo del laboratorio; es imperativo que el organismo se asle y se desarrolle en el laboratorio como un cultivo puro. MTODOS PARA AISLAR UN CULTIVO PURO: ? Tcnica de siembra por estras en placa y tcnica de siembra por difusin en placa: Se pasa una porcin de la muestra a la superficie de un medio de cultivo hecho a base de agar y se siembra en el medio ya sea por estras o por difusin. Esta operacin hace posible adelgazar la muestra de tal manera que en la superficie del agar quedan las bacterias separadas unas de otras. Tcnica de la placa vertida: El principio de la tcnica de la placa vertida es la dilucin (adelgazamiento) de la muestra en tubos con agar fundido y enfriado. Se necesita hacer diluciones en ms de un tubo para obtener colonias bien aisladas. ? Tcnica del enriquecimiento del cultivo: Para mejorar las posibilidades de aislamiento de algunos tipos fisiolgicos poco frecuentes de bacterias, los procedimientos de siembra en placa debern de estar precedidos del desarrollo de las bacterias en un cultivo de enriquecimiento. El principio de esto, es procurar un ambiente de cultivo diseado que pueda favorecer el desarrollo de cierto tipo concreto de bacterias que necesitemos pero que no sea adecuado para las dems. Los medios de enriquecimiento se usan generalmente cuando el tipo de bacteria que queremos aislar se encuentra en muy pequeas cantidades. ? Tcnica de aislamiento de una sola clula: Para poder obtener un solo microorganismo de una preparacin en gota suspendida, se necesita el micromanipulador. Este aparato permite al operador controlar una micropipeta o microcnula (aguja muy fina) dentro de una gota pendiente de tal manera que se pueda tomar una sola clula y pasarla a un medio de cultivo. MANTENIMIENTO Y PRESERVACIN DE CULTIVOS PUROS Relacionado Al estudio de cultivos puros est el problema de su mantenimiento en condiciones viables por varios perodos. Una gran variedad de este tipo de cultivos se llama coleccin de cultivos tipos. Estos cultivos se emplean para probar la efectividad de agentes quimioteraputicos nuevos y potencialmente efectivos. MTODOS DE PRESERVACIN: No todas las especies responden de manera similar, lo que significa que lo que se ha aprendido para un cultivo puede no ser aplicable para otro. Las tcnicas en uso son: ? Resiembra peridica a medios frescos: Los cultivos de bacterias se pueden mantener en tubos de medio en los que han sido cultivados mediante pasos peridicos a medios frescos. Los intervalos en que se hace la resiembra varan con el tipo de microorganismos. Se deben determinar tres cosas antes de manejarlo: el medio de cultivo apropiado para usarlo con cada cultivo, la temperatura propia para mantener los cultivos, y el tiempo que se necesita para hacer las resiembras. ? Preservacin de cultivos con una capa de aceite mineral: Muchas bacterias se preservan bien cubriendo el agar en que estn creciendo con aceite mineral estril. El aceite deber cubrir ms o menos 1.5cm del pico del agar inclinado. Algunas especies se han conservado durante 15 o 20 aos. ? Preservacin de cultivos por secado rpido en congelacin (Liofilizacin): Es el procedimiento ms eficaz para la preservacin de cultivos por ms de 20 aos. En este procedimiento las clulas se secan rpidamente, mientras son congeladas, mediante las siguientes etapas: la suspensin de clulas se pone en pequeos frascos que se

sumergen en una mezcla de hielo seco y alcohol (-78C). Los frascos se conectan inmediatamente a una lnea de alto vaco, y una vez que se termin el secado cada frasco se sella bajo condiciones de vaco. Almacenamiento a temperaturas muy bajas: En este procedimiento las clulas se congelan con un agente protector (glicerol o dimetil sulfxido). Los especimenes congelados se guardan en refrigeradores con nitrgeno lquido. SELECCIN DE LOS MEDIOS Medios de cultivo primario: Se usan para el cultivo inmediato del material clnico y favorecen el crecimiento de la mayora de microorganismos, incluyen Agar Sangre (para incubacin aerbica y anaerbica), BHI (Agar Infusin Cerebro Corazn), Agar Chocolate, Caldo de Infusin Cerebro Corazn y Tioglicolato. Medios diferenciales: Contienen sustratos e indicadores que sealan si las bacterias utilizan o no dicho sustrato. El Agar Sangre tambin es un medio diferencial debido a su capacidad para detectar los diferentes tipos de hemlisis. El Agar MacConkey es diferencial para enterobacterias. Otros medios diferenciales son: Agar Salmonella Shigella (SS) y el Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD). Medios selectivos: Estos medios favorecen el crecimiento de algunos microorganismos e inhiben el crecimiento de otros. Entre las sustancias inhibidoras que contienen estn el alcohol feniletlico, hidrato de cloral, violeta cristal, fucsina bsica, telrito potsico y algunos antibiticos como la colistina y el cido nalidxico. Un medio selectivo es el Thayer Martin modificado. Medios especiales: Ciertos microorganismos requieren estos medios, por ejemplo el medio LowensteinJensen para Mycobacterium tuberculosis; el agar base Bordet-Gengou para Bordetella pertussis; los medios selectivos para clostridios contienen neomicina y azida sdica. Medios de enriquecimiento: Estos medios mantienen el crecimiento de algunos microorganismos, por ejemplo el caldo selenitos, caldo GN y caldo tetrationato, estimulan el crecimiento de Salmonella y suprimen el de otras bacterias gram negativas. CARACTERSTICAS DEL CULTIVO Una de las caractersticas principales de las bacterias es su apariencia seguida del crecimiento en diferentes medios de cultivo. Estas caractersticas generales como el color, abundancia de crecimiento y aun el olor del cultivo nos pueden servir de guas para la identificacin. Para determinar las caractersticas de desarrollo de un cultivo puro es costumbre observar lo siguiente: 1.Tipo de colonias en agar. 2.Desarrollo en agar inclinado. 3.Desarrollo en caldo. 4.Desarrollo en gelatina por picadura. Despus de la siembra del medio de cultivo y despus de la incubacin se pueden determinar las caractersticas de cultivo del microorganismo. Los aspectos ms peculiares de desarrollo son: COLONIAS EN PLACAS CON AGAR: 1.Tamao: los tamaos de las colonias son desde fracciones de milmetro de dimetro hasta 5 o 10mm de dimetro. 2.Margen o borde: pueden formar un crculo perfecto o mostrar gran variedad de irregularidades como salientes redondos, hendiduras irregulares, proyecciones filiformes, o proyecciones en forma de raz. 3.Elevacin: pueden ser muy finas (aplanadas) o gruesas (elevadas). 4.Cromognesis o pigmentacin: las colonias pueden estar coloreadas o sin color. 5.Caractersticas pticas: hay opacas, transparentes u opalescentes. DESARROLLO EN AGAR (INCLINADO) POR ESTRAS: 1.Cantidad: escaso, moderado o abundante. 2.Margen o borde de desarrollo: uniforme o presentando varias irregularidades. 3.Consistencia de la masa desarrollada: mantecosa o de mantequilla, fcilmente removibles con una aguja de siembras. 4.Cromognesis o pigmentacin: colonias pueden estar coloreadas o sin color. DESARROLLO EN CALDO NUTRITIVO:

1. Cantidad de desarrollo: escaso, moderado o abundante. 2. Distribucin del desarrollo en el caldo: uniformemente distribuido (turbidez), desarrollo confinado (nata o pelusa) o desarrollo que se acumula como sedimento. 3. Olor: ptrido, a frutas o aromtico, o imperceptible. DESARROLLO EN GELATINA POR PICADURA: 1. Desarrollo (sin licuefaccin) a lo largo de la lnea de inoculacin. El desarrollo puede estar limitado a la zona de la picadura o puede haberse expandido. 2.Licuefaccin de la gelatina: se puede presentar desde arriba suavemente o adquirir aspectos variados de embudos al licuar la gelatina. La cromognesis o pigmentacin, es una de las caractersticas ms notables de los cultivos. No todas las especies bacterianas poseen esta caracterstica de distincin. Algunas de las especies bacterianas comunes que producen y retienen pigmento intracelular son: Serratia marcescens Rojo Chromobacterium violaceum Violeta Stafhylococcus aureus Amarillo dorado Sarcina lutea Amarillo limn Micrococcus flavus Amarillo M. niger Pardo oscuro Algunas de las bacterias que producen pigmento y lo excretan el medio son: Pseudomonas chlororaphis Verdoso a amarillo P. fluorescens Verdoso a caf oliva P. aeruginosa Verde, azul, a caf oscuro. MATERIALES Staphylococcus aureus Escherichia coli Bacillus Creus Muestra de garganta Agar nutritivo Caldo nutritivo Agar EMB ( Eosina Azul de Metileno) Agar AMS (Manitol Sal) Agar AN Agar Sangre Mecheros Asas y agujas de inoculacin Cinta de enmascarar PROCEDIMIENTO

Se utilizan varios mtodos de siembra por estras en superficies como lo son el mtodo Francs, Clsico y Radial en agar en placa, mtodos de zig-zag, picaduras y estra en agar en tubo y mtodo de cultivo en caldo nutritivo. Para el cultivo de las bacterias, se distribuyeron los agares asi: EMB: Escherichia coli Sangre: Garganta AMS: Staphylococcus aureus AN: Bacillus Creus Agar- Agar 1: Bacillus Creus Agar- Agar 2: Escherichia coli Caldo 1: Garganta Caldo 2: Staphylococcus aureus Nota: Para el anlisis de resultados es necesario tener en cuenta que el Agar Sangre se encontraba contaminado y determinar si se rompen o no se rompen los glbulos rojos y se da Beta Hemoltico.