Está en la página 1de 15

PRCTICA 1.

RECONOCIMIENTO DE BIOMOLCULAS

En esta prctica se realizarn reacciones qumicas y pruebas caractersticas para identificar la presencia de una o varias biomolculas en una mezcla y para cuantificar alguna de ellas. Finalmente, se estudiarn algunas actividades enzimticas.

1.- Identificacin de glcidos con poder reductor

Todos los monosacridos y los disacridos con enlace monocarbonilo, cuando se encuentran en solucin a pH alcalino, tienen la capacidad de reducir otros compuestos. Esta capacidad reside en las caractersticas del grupo carbonilo (C anomrico en formas cicladas) libre. Esta propiedad, y por tanto, la presencia de un azcar reductor, se pone de manifiesto mediante la reaccin de FEHLING. El reactivo de Fehling consta de : -Fehling A: CuSO4 disuelto en H2O -Fehling B: NaOH y tartrato Na-K disuletos en agua

Fundamento de la reaccin: En medio alcalino, el cobre procedente del CuSO4 se encuentra en forma de hidrxido cprico, y se forma la correspondiente sal Na2SO4.

Cuando el

Cu(OH)2 (de color azul) se calienta en presencia de un compuesto

reductor se forma xido cuproso (de color rojo ladrillo).

Si hay un compuesto reductor, el Cu cambia su estado de oxidacin de (2+ a 1+), lo que se evidencia por el cambio de color.

Prctica

Sobre la mesa hay dos soluciones de glcidos: GLCIDO I y GLCIDO II. Hay que determinar si son reductores. Mtodo: 1. Poner en un tubo de ensayo 2 mL de glcido I y en otro tubo 2mL de glcido II. 2. Aadir a cada tubo 0.5 mL de Fehling A y 0.5 mL de Fehling B. 3. Calentar a la llama. Cuestiones 1. Cal o cales son los azcares reductores? 2. Quin se oxida y quin se reduce en la reaccin? 3. Para qu sirven el tartrato Na-K y el calor?

4. Que resultado dara la reaccin de Fehling con glucosa? y con sacarosa?

2.- Identificacin de polisacridos: identificacin de almidn mediante la prueba del Lugol

En solucin acuosa, la amilosa forma estructuras helicoidales lineales y la amilopectina ramificadas, gracias a la formacin de puentes de H entre los grupos OH de la glucosa y las molculas de H2O. Si a una dislucin de almidn de le aade I, esta toma un color azul intenso. Esta caracterstica es especfica del almidn, debido a su estructura, y se debe a la adsorcin del I por las cadenas helicoidales, especialmente de la amilosa. Por tanto no es una reaccin qumica, sino una interaccin fsica reversible por mtodos fsicos. Esto se puede comprobar fcilmente, pues al calentar la mezcla, el color azul desaparece, y al enfriarla vuelve a aparecer.

Prctica
Sobre la mesa hay dos soluciones, solucin 1 y solucin 2. Hay que identificar cul de ellas tiene almidn. Mtodo: 1. Poner en un tubo de ensayo 2 mL de la solucin 1 y en otro 2 mL de la solucin 2. 2. Aadir a cada uno de los tubos de ensayo 1 gota de Lugol (solucin acuosa de iodo y ioduro potsico). Observar el resultado. Para comprobar que es una interaccin fsica 1. Calentar a la llama el tubo que contiene almidn (teido de azul con I), hasta que desaparezca el color azul.

2. Enfriar en el grifo y observar la aparicin de nuevo de color azul. Cuestiones 1. Cul de los dos soluciones contiene almidn? 2. El almidn dara positiva la reaccin de Fehling? 3. La celulosa dara positiva la prueba del Lugol? 4. El azul que aparece tras calentar y enfriar es igual de intenso? Por qu?

3.- Identificacin de lpidos. Reaccin de saponificacin.

La presencia de un lpido se puede detectar fcilmente por su insolubilidad en agua. Adems, se puede detectar si un lpido es saponificable, mediante la reaccin de saponificacin, o formacin de jabn. Los steres de cidos grasos sufren hidrlisis en presencia de un agente alcalino. Esta hidrlisis conduce a la liberacin del alcohol y a la formacin de sales de cido graso o jabones:

Prctica Sobre la mesa hay un frasco con aceite y un lcali (NaOH). Se trata de saber si en el aceite existen lpidos saponificables. Mtodo 1. Aadir aceite (sin pipetearlo) a un tubo de ensayo, hasta una altura de aproximadamente 1 cm. 2. Aadir 2 mL de NaOH al 20% (p/v) en agua. 3. Agitar enrgicamente. 4. Calentar al bao Mara y observar qu ocurre? Cuestiones 1. Existen lpidos saponificables en el frasco de aceite? 2. A qu corresponde cada fase de las que aparecen en el tubo? 3. Por qu se da esa disposicin de fases? 4. Cmo se prepara la NaOH al 20% en agua?

4.- Identificacin de protenas mediante la reaccin el Biuret

La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la reaccin del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solucin acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reaccin se basa en la formacin de un compuesto de color

violeta, debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos.

La reaccin debe su nombre al biuret, una molcula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la ms sencilla que da positiva esta reaccin, comn a todos los compuestos que tengan dos o ms enlaces peptdicos consecutivos en sus molculas.

Espectrofotometra. Principios bsicos A diferencia de las pruebas realizadas anteriormente, la reaccin de Biuret es cuantificable, es decir, a mayor concentracin de protenas, mayor intensidad de color violeta. Esta reacciones, en las que el color formado es proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimtricas. Midiendo la intensidad de color se podra conocer la concentracin de la sustancia que lo produce. Para ello se aplican tcnicas fotomtricas, empleando un aparato llamado colormetro (si mide slo un determinado color) o espectrofotmetro (si realiza una medida de todo el espectro de colores).

La luz es parte de la radiacin electromagntica, que se propaga de forma ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas (los distintos colores) se diferencian unas de otras por sus longitudes de onda ( (distancia entre la cresta de una onda y la siguiente), que se mide en nm. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre 380-750 nm, que corresponden a los colores del arco-iris, de tal forma que cada color corresponde a una radiacin con una especfica. El espectrofotmetro dispone de una lmpara que emite luz monocromtica, de una longitud de onda determinada, que incide y atraviesa la muestra coloreada a medir, y de un detector, que medir la cantidad de luz que no es absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada, se utilizar la radiacin de longitud de onda a la que absorba ms cantidad de luz. Su funcionamiento de basa en la ley de Beer-Lambert: la fraccin de luz incidente que es absorbida por una solucin es proporcional a la concentracin de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relacin entre la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dar una idea de la cantidad de radiacin que ha sido absorbida por la muestra. Es lo que se denomina Absorbancia (Abs) o Densidad ptica (DO)

La Ley de Beer-Lambert se formula como Abs (DO) = x C x l

Siendo el coeficiente de extincin molar (especfico para cada sustancia a una y en unas condiciones determinadas) (M-1 cm-1), C la concentracin de la muestra a medir (M), y l el espesor de la muestra. La mayora de los espectrofotmetros utilizan cubetas para la muestra de 1 cm de espesor, por lo que l se puede ignorar. As, la concentracin desconocida de la sustancia coloreada ser C = Abs /

Prctica

Sobre la mesa hay una solucin de protenas. Se trata de detrerminar la concentracin de dicha solucin mediante la reaccin del Biuret y el espectrofotmetro.

Mtodo

1. Realizacin de una recta patrn. Puesto que se desconoce el coeficiente de extincin molar () de las protenas coloreadas con el reactivo del Biuret, se proceder a construir una curva (en este caso recta) patrn, midiendo la Abs de soluciones con concentraciones conocidas de protena, para, sobre ella interpolar el valor de Abs de la solucin problema y determinar su concentracin. Para ello, se dispone de una solucin de 10 mg.mL-1 de ovoalbmina. A partir de ella se realizarn diluciones conocidas aplicando la frmula

Ci xVi = Cf x Vf Ci = concentracin de la solucin madre inicial Vi = volumen a tomar de la solucin madre inicial Cf = concentracin final de la solucin a preparar Vf = volumen total final de la solucin a preparar

En 4 tubos de ensayo se preparan , a partir de la solucin madre (Ci = 10 mg.mL-1) las soluciones de la tabla

Tubo Blanco
1 2 3

Cf 0 mg.mL-1 2 mg.mL-1 5 mg.mL-1 10 mg.mL-1

Vi 0 mL 0,2 mL 0,5 mL 1 mL

Agua 1 mL 0,8 mL 0,5 mL 0 mL

Vf 1mL 1mL 1mL 1mL

Adems se prepara un tubo con 1 ml de la solucin problema cuya concentracin se quiere conocer

Problema X

1 mL (sol. problema)

0 mL

1 mL

2. Aadir a cada tubo 2 mL de reactivo del Biuret, agitar y dejar reposar 20 min. 3. Transcurrido este tiempo, se mide la DO u Abs en el espectrofotmetro, de la siguiente manera a) Seleccionar la longitud de onda de 570 nm (mxima Abs para la reaccin del Biuret) b) Poner en la cubeta del espectrofotmetro el contenido del tubo Blanco, secarla y limpiarla bien por fuera e introducirla en el espectrofotmetro c) Se ajusta la lectura a 0 de Abs d) Se devuelve el contenido al tubo original y se mide la Abs de las soluciones de los otros tubos, comenzando por el de menor concentracin. e) Limpiar con agua la cubeta, secarla por fuera y medir la Abs del tubo Problema 4. Con las medidas obtenidas de los tubos 1 a 3 y el blanco (Abs = 0), se construye una recta en papel milimetrado, representando las concentraciones en el eje de abcisas y las Abs en el de ordenadas. 5. Interpolar la Abs de la protena problema en la grfica y calcular su concentracin.

Cuestiones 1. Cul es la concentracin de protenas de la muestra problema? 2. Se podra determinar la concentracin de cualquier muestra de protenas con esta recta patrn? 3. Los aminocidos y los dipptidos daran positiva la reaccin del Biuret? 4. Servira esta reaccin para determinar protenas en orina?

4.- Actividades enzimticas: especificidad y desnaturalizacin por cambios de pH y temperatura

Prctica 4.1. Especificidad de la invertasa

La invertasa o sacarasa hidroliza el enlace entre los C 1-2 de la sacarosa, liberando glucosa y fructosa libres. La enzima slo rompe este tipo de enlace glucosdico y no otros.

Mtodo

1. Preparar 3 tubos de ensayo con los siguientes reactivos:

TUBO 1 1mL solucin de sacarosa 1mL solucin de invertasa

TUBO 2 1mL solucin de sacarosa 1mL H2O

TUBO 3 1mL solucin de almidn 1mL solucin de invertasa

2. Agitar los tubos y dejarlos reposar 15 min para que transcurra la reaccin enzimtica. 3. Realizar la reaccin de Fehling a cada tubo.

Cuestiones 1. En qu tubo/s da positiva la reaccin de Fehling?En cul/es negativa?Por qu? 2. Qu demuestran el tubo 2 y el tubo 3 respectivamente?

Prctica 4.2. Desnaturalizacin a pH cido de la amilasa

Las enzimas tienen un pH ptimo de actuacin. Cambios de pH desnaturalizan la protena y, por tanto, inhiben la actividad enzimtica. La amilasa es una de las enzimas encargadas de la digestin del almidn, concretamente hidroliza enlaces 1-4 entre molculas de -glucosa. Es una enzima que se encuentra a lo largo de todo el tracto digestivo de los mamferos, y que tambin la producen las glndulas salivares.

Mtodo

1. Preparar 2 tubos de ensayo con los siguientes reactivos :

TUBO 1 Amilasa (escupir un poco de saliva) 2 gotas de H2O

TUBO 2 Amilasa (escupir un poco de saliva) 2 gotas de HCL 1N

2. Agitar los tubos y esperar 5 min. 3. Aadir 1 mL de solucin de almidn a cada tubo. 4. Agitar los tubos y dejarlos reposar 10 min para que transcurra la reaccin enzimtica. 5. Realizar la prueba del Lugol a cada tubo.

Cuestiones 1. En qu tubo/s da positiva la prueba del lugol?En cul/es negativa?Por qu?

Prctica 4.3. Desnaturalizacin de la catalasa por calor

Las enzimas tienen una temperatura ptima de actuacin. La catalasa se encuentra en todos los tejidos vivos, donde descompone el H2O2 en H2O y O2, que al ser gas, en solucin acuosa se desprende en forma de burbujas. Por tanto, al aadir agua oxigenada a un tejido vivo, la deteccin de desprendimiento de oxgeno gas, indicar actividad catalasa. En la mesa hay dos platos con trozos de patata. En uno de ellos, la patata ha sido previamente cocida.

Mtodo
1. Introducir en sendos tubos de ensayo un trozo de patata de cada plato. 2. Aadir 1 mL de H202.

Cuestiones

1. Cal es el plato que contiene la patata cocida? 2. Qu indica la falta de desprendimiento de O2 al aadir H202 a dicha patata?