LHmatopose

LHmatopose se dfinit par lensemble des mcanismes qui assurent le remplacement continu et rgul des diffrentes cellules sanguines: Polynuclaires Neutrophiles (PNN), Basophiles (PNB), Eosinophiles (PNE). Ces lments figurs du sang ont une demi-vie de 24 heures Globules rouges (GR) ou rythrocytes, dure de vie 120 jours. Plaquettes (thrombocytes), dure de vie 7 jours. Ces derniers lments, qui appartiennent la ligne mylode, sont des lments hyperspcialiss qui ne sont plus capables de se multiplier. Ils doivent donc tre remplacs en permanence. Elments figurs du sang Globules rouges Polynuclaires Plaquettes Demi-vie 120j 24h 7j Nombre total circulant 20 x 1012 5 x 1010 1x 1012 Production quotidienne 2 x 1011 5 x 1010 1 x 1011

Les monocytes et lymphocytes du sang priphrique sont par contre des cellules encore capable de se multiplier et de se diffrencier. Mylopose Granulopose PN Erythropose GR Thrombopose Plaquettes Monocytopose Monocytes Lymphopose

Hmatopose

I- La moelle osseuse, rappels anatomiques

1) Dveloppement embryonnaire
Chez lhomme adulte, lhmatopose est assure par la moelle osseuse ( la diffrence des rongeurs o la rate est le principal organe hmatopotique). Au
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cours du dveloppement embryonnaire lhmatopose va se mettre en place dans diffrents sites anatomiques (Figure 1). a) Stade primitif msodermique Les cellules sanguines sont dorigine msodermique, elles sont dabord identifiables au niveau des lots de Wolf et Pander prsents dans le sac vitellin au 16me jour, puis dans le msoblaste de lembryon au 22me jour. A ce stade sont produites uniquement des cellules rythrodes qui synthtisent des hmoglobines (Hb) de type embryonnaires puis foetales. La production msodermique de cellules sanguines dcrot partir du deuxime mois de la vie intra-utrine. b) Stade hpatosplnique (3me au 6me mois) Les lots hmatopotiques prsents dans le foie et la rate sont essentiellement constitus de cellules rythropotiques, la production de cellules granuleuses et mgacaryocytaires restant faible. c) Stade mdullaire Dbute au quatrime mois et concide avec le dveloppement des bauches osseuses o les cellules souches se diffrencient en lments mylodes. Lhmatopose mdullaire devient prpondrante partir du sixime mois et elle est exclusive ds la naissance. Seules des conditions pathologiques peuvent conduire une reprise de lhmatopose extramdullaire aprs la naissance (cf cours sur les syndromes myloprolifratifs).

Figure 1 : sites de lhmatopose pendant la gestation.

2) Rpartition topographique selon lge

Jusqu 5 ans la moelle de la totalit des cavits osseuses est une moelle rouge qui assure une hmatopose active. Une involution adipeuse sinstalle ensuite donnant un aspect de moelle jaune et progresse avec lge. Chez ladulte, la moelle hmatopotique nest plus localise quau niveau des os plats et courts (Figure 2).

- os pelviens - crne - maxillaire

Figure 2 : Rpartition de lhmatopose selon lge de lindividu.

3) Rpartition quantitative
La composition cellulaire de la moelle hmatopotique adulte est la suivante: Cellules granuleuses Cellules rythrodes Cellules mgacaryocytaires Lymphocytes* Plasmocytes 60% 25% 0.5% 10% 3%

* La composition de la moelle en lymphocytes varie avec lge, elle est de 50% jusqu la fin du premier mois, de 20% chez le petit enfant.

4) Histologie: le microenvironnement mdullaire

dassurer la diffrenciation, la multiplication et la destruction des cellules sanguines.

a) Le compartiment vasculaire mdullaire et la barrire mdullo-sanguine

La moelle osseuse a pour caractristique dtre disperse dans de nombreux territoires osseux en situation extravasculaire; malgr cette dispersion, il existe une unit structurale et fonctionnelle qui permet de runir les diffrents territoires osseux en un systme ou organe mdullaire dont la fonction est

Le systme vasculaire mdullaire est reprsent sur la figure qui suit. Larbre sinusodal constitue lunit lmentaire structurale et fonctionnelle de la moelle hmatopotique. Les sinus mdullaires ont, dans la moelle rouge, un dveloppement parallle la cellularit mylode, ils sont peu abondants dans la moelle jaune. Laltration exprimentale du rseau vasculaire mdullaire par irradiation ou par traitement la saponine entrane une aplasie mdullaire. La rgnration mylode au sortir de laplasie est prcde de la reconstitution des sinus. En pathologie, au cours de la mylofibrose avec splnomgalie mylode (cf cours syndromes myloprolifratifs), laltration du rseau vasculaire entrane des perturbations de lhmatopose avec rythro- et granulopose intravasculaires (Figures 3 et 4).

Figure 3 : Compartiment vasculaire.

dchange entre le sang et les territoires hmatopotiques. Cette paroi est constitue par: Les cellules endothliales qui forment un revtement mince et continu de 2-3m dpaisseur. Ces cellules sont jointives leur priphrie, le passage des cellules sanguines vers le sang est transendothlial = diabase. La basale des sinus: elle est irrgulire et discontinue. Les cellules adventicielles: forment une couche discontinue et ne recouvrent quune partie de la surface endothliale. Les histiocytes macrophagiques sont en position adventicielle et phagocytent parfois les noyaux des globules rouges qui traversent la paroi.

La barrire mdullosanguine est forme par la paroi des sinus, zone essentielle

Figure 4 : Barrire mdullo-sanguine.

b) La matrice conjonctive = stroma mdullaire La matrice cellulaire Une srie de structures cellulaires et fibrillaires constituent le microenvironnement de la moelle osseuse ncessaire la fixation, la diffrenciation et la multiplication des cellules mylodes. Les histiocytes sont de type classique, de grande taille (30m), avec un cytoplasme riche en lysosomes et phagolysosomes et dans lequel on peut observer des GR en voie de lyse. Ces cellules sont en contact troit avec les
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cellules hmatopotiques et en particulier avec les GR (lots rythroblastiques, o un macrophage est entour de nombreux rythroblastes). Les cellules interstitielles non phagocytaires, varit de cellules conjonctive spcialises dans la synthse des fibres intercellulaires (fibroblastes) Les adipocytes: constituants caractristiques de la moelle hmatopotique , sont en quantit inversement proportionnelle la richesse en cellules mylodes. Ils constituent une structure de remplissage. Lendoste: spare la moelle des traves osseuses avec ses cellules spcialises que sont les ostoblastes et les ostoclastes. En pathologie, ils existent de nombreuses modifications parallles ou intriques de los et de la moelle osseuse (ostosclrose dans certains syndromes myloprolifratifs). Les terminaisons nerveuses constituent un autre lment du microenvironnement mdullaire ncessaire lhmatopose. On trouve des fibres mylinises ou non dotes de proprits nociceptives et vasomotrices. La matrice extracellulaire Est constitue de fibres dont les constituants protiques sont de deux types: - Protines collagniques: collagne de type I et III synthtis par les fibroblastes - Protines non collagniques telles que la fibronectine, la thrombospondine synthtises par les fibroblastes et les cellules endothliales Dans cette matrice extracellulaire sont galement prsents des mucopolysaccharides du type hparane sulfate.

II-Les cellules souches hmatopotiques

La majorit des cellules sanguines matures sont destines vivre seulement de quelques heures (PN) quelques semaines (GR) avant dtre dtruites. Afin de compenser cette destruction rapide, le systme hmatopotique doit produire quelques 1013 cellules par jour. Cette intense production journalire a lieu normalement dans la moelle osseuse chez lhomme, ds la naissance et est rgule par un systme complexe de facteurs de croissance et dinhibiteurs, le tout dans un cosystme trs adapt: le micro-environnement mdullaire. On distingue quatre compartiments dimportance ingale dans le systme hmatopotique: Le compartiment des cellules souches multipotentes, le compartiment des progniteurs hmatopotiques, le compartiment des

prcurseurs hmatopotiques et le compartiment des cellules matures fonctionnelles.

1) Les cellules souches multipotentes (Stem Cells)

Ces cellules ne sont pas morphologiquement identifiables (aspect de petit lymphocyte) et sont dotes dune capacit dautorenouvellement leve, capacit quelles vont progressivement perdre lorsquelles vont sengager dans une des voies de diffrenciation hmatopotique (Figure 5).

Figure 5 : Multipotence des cellules souches.

a) Leur mise en vidence Chez lanimal La dmonstration de leur existence chez lanimal repose sur les expriences de Till & McCulloch (1961). Ces cellules sont capables chez la souris, aprs irradiation dose ltale et injection de cellules mdullaires syngniques normales, de former des nodules (colonies) splniques composs de cellules hmatopotiques. La cellule lorigine de ces colonies est dsigne par le terme de CFU-S pour Colony Forming Unit in Spleen . (Annexe I)

cellules granuleuses, rythrodes, monocytaires et mgacaryocytaires. On nobserve pas de cellules lymphodes mais linjection des cellules dune colonie permet la restauration du systme lymphode chez lanimal receveur.
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Certaines des colonies splniques observes sont mixtes, composes de

cellule unique) comme cela a pu tre dmontr en utilisant des cellules mdullaires associes un marqueur (anomalies chromosomiques); dans ce cas, toutes les cellules dune mme colonie prsentent le mme marqueur. Les cellules pluripotentes sautorenouvellent au sein dune colonie. Linjection des cellules dune colonie un animal receveur irradi permet la reconstitution de lhmatopose. Rle ++ du microenvironnement dans la dtermination des cellules souches: Chez lanimal receveur, la rate contient essentiellement des colonies rythrodes (60%) dans la pulpe rouge, alors que les colonies granuleuses (22%), mgacaryocytaires (3%) et mixtes (15%) sont plus rares. On observe galement des colonies dans la moelle mais elles sont essentiellement dorigine granuleuse. Lexistence de cellules souches pluripotentes peut tre galement dmontre in vitro dans des systmes de culture particuliers: Systme de culture en milieux liquide de Dexter : On reconstitue dans un premier temps le microenvironnement mdullaire en cultivant dans un flacon de culture de la moelle osseuse. Les cellules adhrentes de cette moelle (cellules qui constituent la matrice cellulaire du stroma) vont se fixer au fond du flacon et constituer un milieu propice pour la fixation et la diffrenciation des cellules souches long terme. Cette couche adhrente peut tre maintenue en culture pendant plusieurs mois et permettre la survie des cellules souches qui, lorsquelles seront rinjectes un animal receveur irradi vont pouvoir reconstituer une hmatopose normale. Les cellules souches ainsi mises en vidence constituent les GEMM-CFU ou LTC-IC (Long Term Culture - Initiating Cells) car capables de produire des colonies granuleuses, rythrocytaires, monocytaires et mgacaryocytaires. (Annexe II) Culture en milieu semi-solide: En prsence de milieux conditionns (cf infra) les cellules souches produites dans le systme de Dexter ou prsentes dans la moelle osseuse normale peuvent donner des colonies lorsquelles sont ensemences dans un milieux semi-solide (Agar, mthylcellulose). (Annexe III)

Les cellules dune mme colonie sont dorigine clonale (drivant dune

Chez lhomme

Chez lhomme, un certain nombre darguments suggrent galement lexistence dune cellule souche pluripotente. Dans la leucmie mylode chronique (LMC), toutes les cellules mylodes et les lymphocytes B prsentent la mme anomalie chromosomique clonale: le chromosome Philadelphie qui rsulte dune translocation entre les chromosomes 9 et 22. Chez les femmes atteintes de LMC et htrozygotes pour le G6PD (gne est localis sur le chromosome X avec deux allles) toutes les cellules mylodes et lymphodes prsentent la mme isoforme enzymatique. Enfin, les techniques de culture en milieux liquide ou semi-solide ont confirm lexistence dune cellule souche pluripotente (CFU-GEMM ou CFU-Mix) capable de produire des colonies mixtes.

2) Les progniteurs hmatopotiques

Ces cellules sont engages dans une ou plusieurs voies de diffrenciation et leur capacit dautorenouvellment sont rduites. Elles ne sont pas reconnaissables morphologiquement. (Figure 6)

Elles sont mises en vidence grce aux techniques de culture de cellules mdullaires en milieux semi-solide et en prsence de facteurs de croissance adapts o elles donnent naissance des colonies de diffrents types: Colonies de cellules granuleuses neutrophiles et monocytaires dont lorigine est la GM-CFU = Granuleux (neutrophiles)-Monocytes- Colony Forming Unit. Colonies de cellules granuleuses osinophiles dont lorigine est la Eo-CFU qui est diffrente de la GM-CFU qui ne produit pas de colonies osinophiles Colonies de cellules granuleuses basophiles dont lorigine est la Ba-CFU Colonies rythroblastiques dont lorigine est une BFU-E (Burst Forming Unit) qui donne de volumineuses colonies aprs 2-3 sem de culture et la CFU-E qui donne des colonies de plus petites tailles aprs quelques jours de culture. Colonies mgacaryocytaires dont lorigine est une Mk-CFU.

Figure 6 : Schma de lhmatopose chez lhomme.

3) Les prcurseurs hmatopotiques

Ce sont des cellules morphologiquement reconnaissables engages vers une ou lautre des lignes sanguines. Ces cellules sont capables dun nombre limit de mitoses et sont normalement localises dans la moelle osseuse. Ligne granuleuse Myloblaste Promylocyte Mylocyte Mtamylocyte Polynuclaire Ligne rythrocytaires Prorythroblaste Erythroblaste basophile Erythroblaste polychromatophile Rticulocyte Globule rouge Ligne mgacaryocytaire Mgacaryoblaste Mgacaryocyte

Plaquette

4) Cintique des cellules souches

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90% dentre elle sont bloques en phase G1. En cas de dpopulation mdullaire ou de traitement par le 5-FU (5- Fluoro-uracile) elles peuvent tre recrutes , prolifrer et se diffrencier. Ces cellules expriment un certain nombre de gnes qui leur confrent une aptitude remarquable survivre: gne BCL2 inhibiteur du programme de mort cellulaire programme (apoptose), gne MDR = gne de rsistance de nombreux gnotoxiques.

Les cellules souches pluripotentes sont pour la plupart hors cycle cellulaire, >

5) Marqueurs de diffrenciation des cellules hmatopotiques

Bien que les cellules souches hmatopotiques (cellules pluripotentes, progniteurs) ne soient pas morphologiquement reconnaissable, ils existe un certain nombre de marqueurs immunologiques (CD) qui permettent de les identifier avec un degr de prcision variable. (Annexe IV)

III-Rgulation de lHmatopose
1) Facteurs de croissance hmatopotiques
On regroupe sous le terme de facteurs de croissance hmatopotiques un ensemble de molcules qui agissent le plus souvent sur le mode paracrine et qui sont ncessaires la diffrenciation et la survie des cellules

hmatopotiques. Leur prsence dans un systme donn de culture est indispensable la production de colonies in vitro partir de progniteurs spcifiques. (Figure 7) De faon schmatique on distingue trois familles de
facteurs de croissance:

Facteurs agissant sur les cellules les moins dtermines (CFU-S et GEMM-CFU): ce sont linterleukine 1 (IL3), le FLT3L et leSCF (Stem cell factor). Les facteurs agissant sur les cellules pluripotentes et les progniteurs les plus diffrencis voir sur les cellules terminales matures: SCF (Stem Cell Factor), IL3, GM-CSF (Granulo-Monocyte Colony Stimulating Factor), et IL4 Les facteurs agissant sur les stades les plus tardifs de la diffrenciation et qui sont relativement spcifiques: G-CSF, M-CSF, Erythropotine (Epo) et Thrombopotine (Tpo). Ces facteurs ont des effets qui ne sont pas uniquement limits aux cellules sanguines et peuvent agir en dehors du systme hmatopotique, ex: Le LIF

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intervient diffrents stades de lembryogense, lIL6 est galements un rgulateur des fonctions hpatocytaires.
SCF, FLT3

Figure 7 : Facteurs de croissance hmatopotiques.

2) Rcepteurs aux facteurs de croissance hmatopotiques

Leur connaissance est rcente car ils existent en petit nombre sur les cellules normales ( 1000 sites/cellule) ce qui a considrablement ralenti leur identification. Le dveloppement de la Biologie Molculaire a permis le clonage des gnes qui codent pour ces rcepteurs avec comme corollaire de pouvoir tudier leurs produits. On distingue deux types de rcepteur Les rcepteurs avec activit tyrosine-kinase: La fixation du ligand sur la partie extramembranaire du rcepteur dmasque son activit enzymatique prsente dans la rgion intracytoplasmique et permet la transduction dun signal ex: M-CSF-R: produit du proto-oncogne FMS SCF-R: produit du proto-oncogne KIT

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 Les rcepteurs de la superfamille des rcepteurs des cytokines hmatopotiques: Ces rcepteurs nont pas dactivit tyrosine-kinase et ncessite la prsence dune deuxime protine, gnralement endomembranaire pour transduir le signal. Les rcepteurs pour le GM-CSF, le G-CSF, les IL 3,4,6 et lEpo appartiennent cette famille.

3) Mcanismes daction des facteurs de croissance

La plupart de ces facteurs ont la fois des fonctions de rgulation au niveau des cellules en cours de diffrenciation, mais sont galement actifs au niveau des cellules matures du sang circulant. Par exemple, au cours des infections ces facteurs acclrent la production de cellules phagocytaires et agissent sur la fonction et la survie de ces cellules. Les facteurs de croissance hmatopotiques sont ncessaires pour la prolifration et la survie des cellules cibles. Ils agissent en phase G1 du cycle cellulaire et conduisent la multiplication cellulaire. Leur absence du milieu mort de la cellule. Cette action sur la survie semble primordiale et leur action diffrenciante et leur rle apparent sur la dtermination des cellules prcurseurs pourraient tre simplement la consquence de la survie de cellules dont le programme gntique est dj entirement dtermin.

4) Rgulation ngative de lhmatopose

Elle est assure par des facteurs dorigine cellulaire diffrente: Interfrons: groupe de protines dfinis par leur proprit antivirale et qui jouent un rle antimitotique sur les cellules normales ou leucmiques. TGF (Transforming Growth Factor): Protine qui exerce un effet inhibiteur sur la pousse in vitro des progniteurs prcoces. TNF (Tumor Necrosis Factor) synthtis par les monocytes et lymphocytes T Autres molcules: Lactoferrine (produite par les PNN inhibition de la synthse de G-CSF par les monocytes), isoferritine acide, prostaglandines

5) Rle du microenvironnement mdullaire

(Figures 8 et 9)

Comme nous lavons dj signal, le microenvironnement mdullaire joue un rle ++ dans la rgulation de lhmatopose: le rle inductif du microenvironnement dans les expriences de Till & McCulloch constituait un argument. Dautres modles confirment limportance du stroma mdullaire dans lhmatopose:

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Il existe une souche de souris (souris W/Wv) qui prsente une anmie congnitale qui est corrige par greffe de cellules mdullaires dun animal normal; dans ce cas il existe une anomalie intrinsque de la cellule souche rythrode: absence de rcepteur au SCF. Dans une autre souche de souris (souris Sl/Sld), lanmie nest pas corrige par greffe de moelle, par contre les cellules mdullaires Sl/Sld sont capables de reconstituer une rythropose normale chez un animal receveur irradi. Dans ce cas lanomalie correspond une absence de synthse de SCF par les cellules stromales. Dans le modle des culture de Dexter, la couche stromale qui stablit au fond de la bote de culture est ncessaire pour maintenir en survie les prcurseurs hmatopotiques. Les prcurseurs les plus primitifs sont dans la couche adhrente, les cellules les plus diffrencies sont dans le surnageant. Toutes les cellules de la matrice cellulaire produisent des CSF lexception de lIL3. La rgulation par ces facteurs de croissance est de mode endocrine en ce qui concerne les cellules les plus matures, mais la rgulation physiologique de lhmatopose est paracrine, par libration des CSF au contact des progniteurs. Les protines fibrillaires du stroma jouent un rle dans le homing des cellules souches. En effet, on retrouve la surface de ces cellules des rcepteurs (VLA, CD36) spcifiques pour les protines de la matrice extracellulaire: fibronectine, thrombospondine. Enfin, certains CSF peuvent tre adsorbs sur ces fibres.
Figure 8 : Schma du microenvironnement mdullaire.

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Figure 9 : Interaction facteurs de croissance et microenvironnement mdullaire.

IV-Exploration de lHmatopose
1) Le mylogramme
Cest la mthode dexploration la plus courante. Elle consiste en une ponction dun os hmatopotique (sternum, pine iliaque, vertbre ou crtes tibiales chez le jeune enfant). Aprs aspiration de sang mdullaire, talement et coloration panoptique, on peut estimer la cellularit de la moelle osseuse.

2) La biopsie ostomdullaire
Elle est ralise si une tude quantitative plus prcise est ncessaire. A laide dun trocart, on recueille un cylindre ostomdullaire (corticale osseuse, os spongieux, moelle) qui fait lobjet dune analyse histologique.

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3) Exploration isotopique
Technique au radiofer pour explorer la ligne rythroblastique avec tude de lincorporation dans les GR et comptage externe (cf cours sur rythropose).

4) Culture de moelle osseuse

Pour rechercher des anomalies des cellules souches, lexistence dinhibiteurs de lhmatopose, ..

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Annexe I : Technique des CFU-S selon Till et McCulloch.

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Annexe II : Systme de culture en milieux liquide de Dexter.

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Annexe III : Technique de clonage des cellules hmatopotiques en milieu semisolide.

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Annexe IV: Marqueurs de diffrenciation.

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Annexe V: Modles cellulaires pouvant expliquer lhmatopose (avant la dmonstration de lexistence dune cellule souche pluripotente.

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